[0001] 本发明涉及海水淹溺实验领域，具体是一种小鼠海水淹溺肺损伤模型的制备方法。

[0002] 随着海洋事业的发展，海洋溺水的发生率每年都在增加。世界卫生组织(世卫组织)估计，溺水每年导致37.2万人死亡，并将溺水列为全球“意外伤害死亡”的第三大原因。海水溺水具有低温、高渗、细菌含量丰富等特点，比淡水溺水更严重，海水溺水的常见并发症为急性肺损伤(acutelunginjury，ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS)。海水溺水急性肺损伤(seawaterdrowningacutelunginjury，SW‑ALI)的致病机制十分复杂，可能与炎症反应、肺水肿、肺泡表面活性物质减少、氧化应激、细胞凋亡和自噬有关。SW‑ALI的治疗主要是有症状性的，包括心肺复苏、机械通气和预防性抗生素，缺乏长期关注。由于缺乏先前的报告或研究来提供有效治疗溺水相关肺损伤的证据，这是一个令人关注的问题。因此，迫切需要在细胞和动物水平上进行研究，以尽量减少SW‑ALI的致死率和残疾率。

[0003] 目前海水淹溺肺损伤小鼠模型制备方法主要有直接淹溺法和颈部切开气管内注射法，其他引起小鼠肺损伤的方法有鼻滴法，上述方法均能够对小鼠肺部造成损伤，从而模拟肺部进入海水后的损伤情况。但是对于直接淹溺法和颈部切开气管内注射法而言，在进行操作时存在很多不确定因素；对于直接淹溺法而言，是将小鼠在海水中进行淹溺指定时间并观察小鼠变化，而对于不同小鼠而言所吸收进入到肺部的海水剂量是不一致的，所以存在一定的变化因素；而对于颈部切割气管内注射的方法而言，需要手术将小鼠的气管进行切除操作，从而给小鼠带来额外损伤，不能够更清晰的判断小鼠肺部的变化情况，从而给小鼠肺部损伤研究带来弊端。

[0004] 基于上述问题，需要进行一种小鼠海水淹溺肺损伤模型的制备方法的设置，能够更为有效的进行小鼠海水淹溺肺损伤模型的建立，并且排除外界其他问题对小鼠海水淹溺肺损伤模型的构建影响，使得实验者更清晰直观的观察到小鼠肺部海水淹溺后的损伤情况，以方便实验者针对海水淹溺问题进行具体分析。

[0036] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。

[0037] 对于传统的小鼠海水淹溺肺损伤模型的构建方式而言，包括直接淹溺法、鼻滴法、经颈部切开气管内注射法，即如说明书附图图1‑3所示。具体操作方式如下述：

[0038] 直接淹溺法：在实验前12h对小鼠禁食不禁水。取10只常规饲养的小鼠，将小鼠分别放入盛有人工海水的容器内，水深6cm，水温25℃，根据小鼠情况，计时25s后迅速将小鼠从水里捞出，用纸擦干，密切观察小鼠的生命体征，观察小鼠状态，并记录小鼠的存活状况。

[0039] 鼻滴法：将小鼠称重后用3％戊巴比妥钠溶液1ml/kg腹腔注射麻醉；待小鼠疼痛刺激反应消失后左手拇指、食指固定小鼠下颌，使小鼠保持仰头抬颏位，其余手指和手掌握住小鼠身体，使小鼠身体垂直于桌面，右手持移液器吸取4ml/Kg的人工海水从鼻孔缓慢滴注，滴注完毕后垂直旋转15s，使海水在小鼠肺内尽可能均匀分布。过程中注意观察海水吸入情况、小鼠状态及小鼠生存情况。

[0040] 经颈部切开气管内注射法：将小鼠称重后用3％戊巴比妥钠溶液1ml/kg腹腔注射麻醉；待小鼠疼痛刺激反应消失后将小鼠仰卧位固定于手术板，保持与地面成60‑70°夹角，固定小鼠头部使其颈部轻度过伸。用剪刀经小鼠颈部前正中线切开皮肤、筋膜，分离肌肉组织，暴露出气管，用1ml注射器插入气管，在2min内匀速注入4ml/kg人工海水，结束后垂直旋转15s，使海水在肺内尽可能分布均匀。过程中观察气管内液体变化，小鼠呼吸、咳嗽反射、发绀及生存等情况。

[0041] 而对于上述操作方法而言，均存在弊端问题：直接淹溺法(小鼠个体差异较大，死亡率极高)；鼻滴法(吸入剂量可靠性较差，部分被吞咽)；经颈部切开气管内注射法(操作难度略大，需要麻醉时间略长，全身炎症反应性较高)，从而给实验者操作以及后续实验数据带来弊端问题，因此针对上述问题进行下述方法设置：

[0042] 一种小鼠海水淹溺肺损伤模型的制备方法，包括下述步骤：

[0043] S1，选择动物外观健康、反应良好的小鼠，并为小鼠提供SPF级，室温在20～25℃之间，层流房间通风良好，明暗交替12小时的生存环境，适应环境1周；

[0044] S2，当小鼠适应生存环境后将小鼠取出进行麻醉，将小鼠称重后用3％戊巴比妥钠溶液1ml/kg腹腔注射麻醉；3％戊巴比妥钠溶液配制方法为用微量精密天平称取3g戊巴比妥钠，加入生理盐水配制至100ml，磁力搅拌使戊巴比妥钠完全溶解，分装后4℃避光保存[0045] S3，小鼠疼痛刺激反应消失后将小鼠仰卧位固定于手术板，保持与地面成60‑70°夹角，固定小鼠头部使其颈部轻度过伸；

[0046] S4，左手持喉镜由右口角放入口腔，右手牵出小鼠舌部，喉镜挑起会厌，可观察到倒三角形的白色软骨随呼吸开闭，打开时用微量注射器注射4ml/kg的人工海水，结束后垂直旋转15s，使海水在肺内尽可能分布均匀，观察小鼠呼吸、咳嗽反射、发绀及生存等情况；人工海水配制方法包括下述步骤：

[0047] 1，用精密电子秤称量指定剂量的氯化钠、硫酸镁、氯化镁、氯化钙、氯化钾、碳酸氢钠、溴化钠物质并在烧杯中用超纯水溶解，操作在室温下完成，注意氯化钙与碳酸氢钠避免前后加入溶解，磁力搅拌30min；

[0048] 2，将初步溶解好的液体转到1000ml容量瓶中，超纯水充分洗涤烧杯壁上残余溶液，转入容量瓶中；

[0049] 3，用pH仪检测液体，使用氢氧化钠滴定溶液，调整pH值至8.2，比重为1.05，渗透压为1300mmol/L，并使用胶头滴管定容至1000ml，充分摇匀后盖好瓶塞，放置于室内25℃左右保存，完成人工海水配制操作。

[0050] S5，将小鼠造模后每4h记录一次，观察24h内的生存情况观察并统计小鼠生存率，并各取7只小鼠重复进行上述S1‑S4步骤，并观察没治小鼠24h内统计生存情况，每4个小时观察一次，统计并记录生存时长，将死亡或生存时间为24h设定为终止事件；

[0051] S6，用组织镊提起小鼠的剑突，沿左右两侧肋软骨结合处向上剪断至胸锁关节，在气管分支部位上方切断气管，游离双肺，并将小鼠肺组织取出后加入10％福尔马林固定液室温固定；

[0052] S7，将被10％福尔马林固定液室温固定的小鼠肺部组织进行HE染色，并观察染色后的小鼠肺部组织情况，完成小鼠肺部组织检测。

[0053] 小鼠肺部组织HE染色步骤如下述：

[0054] 1，将固定好的肺组织置于染色架上水洗，依次浸入75％乙醇中90min、80％乙醇中90min、90％乙醇中90min、95％乙醇中90min、100％乙醇中60min逐渐脱水，并依次在二甲苯Ⅰ中60min)、二甲苯Ⅱ中60min，使组织变得透明；

[0055] 2，在65℃下将肺组织置于石蜡中渗透3次，每次持续90min，再将组织块平整放入包埋框中，用热的石蜡液包埋，静置2h等待石蜡冷却；

[0056] 3，将包埋好的组织块放入切片机中，设置切片厚度为3‑5um，连续切片，将切片置于70℃烤箱中过夜；

[0057] 4，切片置于二甲苯中脱蜡3次，每次持续10分钟，无水乙醇3次，每次持续10分钟，95％乙醇中10分钟，90％乙醇中10分钟，80％乙醇中10分钟，70％乙醇中10分钟，用蒸馏水冲洗切片10分钟；

[0058] 5，使用苏木素染色10分钟，水洗3次后，用0.1％盐酸分化切片，再用PBS冲洗反蓝10秒钟，水洗10分钟；

[0059] 6，将切片放入梯度浓度乙醇中逐级脱水，即在二甲苯Ⅰ中2分钟、二甲苯Ⅱ中2分钟，用中性树胶封片，全自动数字切片扫描仪扫描摄片，完成小鼠肺部组织HE染色。

[0060] 对于不同小鼠肺部淹溺情况的分析，如说明书附图图6所示，鼻滴组小鼠出现部分呼吸困难，口鼻处无明显分泌物溢出，经口喉镜下气管内注射组和经颈部切开气管内注射组的小鼠可见明显呛咳及呼吸困难，口鼻处有透明至白色泡沫样分泌物溢出，轻中度紫绀；直接淹溺组小鼠可见严重呼吸困难，口鼻处有大量的白色泡沫样分泌物溢出，伴有明显的低体温及紫绀。小鼠肺部大体观及病理观如图6所示，对照组小鼠肺组织呈淡粉色，HE染色无出血、水肿表现；鼻滴组大体观表现为局部红肿，病理表现为局灶性相对较轻微的水肿，出血较少；经口喉镜下气管内注射组和经颈部切开气管内注射组的小鼠肺组织大体观及病理观可见不同程度肿胀、出血、炎症细胞渗出、肺透明膜形成等；直接淹溺组大体观呈严重的肿胀、充血改变，HE染色可见局部肺不张、出血、水肿、炎性细胞渗出，部分可见明显的肺泡断裂。同时，不同造模方法生存情况见生存曲线如说明书附图图7所示。从而判断，经口喉镜下气管内注射法高度仿真，且操作较快捷、简便，相对适合实验操作，而且后面实验可以应用速效气雾麻醉剂异氟烷，同时可以使小鼠快速苏醒，避免长时间麻醉对小鼠的影响。

[0061] 因此，一种小鼠海水淹溺肺损伤模型的制备方法的设置，能够更为有效的进行小鼠海水淹溺肺损伤模型的建立，并且排除外界其他问题对小鼠海水淹溺肺损伤模型的构建影响，使得实验者更清晰直观的观察到小鼠肺部海水淹溺后的损伤情况，以方便实验者针对海水淹溺问题进行具体分析。