技术领域
[0001] 本发明涉及遗传工程领域中与高粱株高相关的分子标记SbPH1及其应用。
相关背景技术
[0002] 单核苷酸多态性(Single‑nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组核苷酸序列中由单个核苷酸水平上的变异而引起的基因组水平上的DNA序列多态性，主要包括单个碱基的缺失、插入、转换及颠换等。SNP标记即为在此基础上发展起来的第三代分子标记，该标记类型具有突变频率低，遗传稳定性高；位点丰富，分布广泛；检测快速，筛选规模化等特点。与第二代分子标记相比，SNP标记不需要根据DNA片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法。
[0003] 高粱(Sorghum bicolor)又叫蜀黍，为禾本科高粱属一年生草本植物，高粱是世界五大作物之一，属于C4作物，光合效率高，生物产量高。高粱的用途很广泛，可食用、饲用、酿造用、生物能源用、化工材料用等。高粱因具有耐旱涝、耐盐碱、耐贫瘠和易于种植等特性，是全球最重要的粮食作物和饲料作物。
[0004] 株高是作物形态学调查基本指标,也是影响高粱生物产量重要因素，一般高粱株高越高，其生物产量也越高，大多数高秆品种的生物产量都高于矮秆品种的产量。因此，选育含有高秆单倍型的高粱亲本系及杂交种成为促进高粱产业发展的关键。
具体实施方式
[0099] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0100] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0101] 下述实施例采用GraphPad Prism v8.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One‑way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
[0102] 下述实施例中的235份高粱自交系关联群体：由中国科学院植物研究所生态草牧业工程实验室景海春实验室提供，该关联群体的详细信息见已发表的文章：Xiaoyuan Wu,et al..Genomic footprints of sorghum domestication and breeding selection for multiple end uses.Molecular Plant,2022,VOLUME 15,ISSUE 3,P537‑551(DOI:https://doi.org/10.1016/j.molp.2022.01.002)，品种详细信息如表1所示。
[0103] 实施例1高粱株高显著关联单倍型组合和SbPH1‑Hap1(AT)配子基因型分子标记的应用
[0104] 本发明发现了一个与高粱株高相关基因SbPH1的单倍型。SNP1对应于高粱自交系BTx623第2号染色体上第6591060位(BTx623(v3.1)高粱基因组序列信息)，其核苷酸为G或A，该位点位于序列1第2124位置，其为C或T，将该SNP命名为SbPH1‑SNP1，下述又称SNP1；SNP2对应于高粱自交系BTx623第2号染色体上第6591525位(BTx623(v3.1)高粱基因组序列信息)，其核苷酸为C或T，该位点位于序列1第1659位置，其为G或A，将该SNP命名为SbPH1‑SNP2，下述又称SNP2；序列表中SEQ ID No.1的r表示g或a，y表示t或c。
[0105] 序列1具体如下：
[0106] CCGGAGATCAAGATGAATGAATGGTTGTCCATTTTTTCCCCATGTATTGTAAAATGAGTTATTACTGACGAAAT
[0107] CACCTCGTATCCCGGAGTACTCTCAAGGGAAACAAACACTCGGTCCACACCCAGAAATATAAAACGATATTGAA
[0108] ATACAAAAGATAGATCCTGCTGAAGAACAAAAAAAATGGAAATATGTGCTAGCAGAGGGACTTGCGCTACTCTA
[0109] GTTTTCAGTTCTCATGCTTCATTGATATTCATTGTTGTTTACTATTGGACTTGTTGGCCTTTTCCTTAGCGTCC
[0110] TTGTCTTCCCGCGTTGCCTTGGATTGCCCAATGGCCTCTACAAGTTTCTTCTTTCTTGGCAAGCCTTCATCAGA
[0111] AAGCGCTTCAGGTGCCAAATTCTTGATCACTTCACTAGATAGGGCTGGTGACTCACCAGCTCTTGGATCCTCAT
[0112] CTATAGGGGCCACTTGCAGTGCTACAGAAATTTAGAACATAACATCAGTTAGCTAAGGAACTAATATGCTCCCA
[0113] GTGAACATGGTTACTGAACAACCACATGGACCAACAACTTGCCGCCATGCAATGACCACGCTATCTCAGAGATC
[0114] TATGCATGCAAGTTCAAGAGAGGAAATGCCTTATATGTTTCTTGTTTCCTTGCAGGAACTTCTGTTTTGTGCAA
[0115] GGCTATTACAGTATGTAAAAAACACTCAAACTATTGTTTTATGCATGAACATGATTGAATCCTATTCTTCCACG
[0116] ACCTTTGTGCCAGAATTGGGATGGTTCAAATCCCACACAGAAGGCGCCACAAAAGACTTCAGGGGAAATTGAGA
[0117] GAATAAGTCTTGTGTTCTTGATATTTTGGAGCTCCATCTCTAGCATAAGTAGTAGTGGTTAATGCCTATGTCAT
[0118] GGCATCTTATCGTTACTTTAGCATATCTTATCTTCTACCTTACACTCTACTTTAGTTGTTGCTAGTCTTTCTAC
[0119] TTTCAGTTGCAAGCAGACCTCTTGGTCCTATATATGTAACAAGAACCAGACATGGTTGGCACTGCCTAAGTAAT
[0120] ACAGAAAATTCTCAAACCTGTGTCTTTGCCACCAACAGAAAGAAAGGAATTCATTGCATCATCAATTCATTATG
[0121] GCAACTTAAATAAGAATGTAAAATTTAACTAACCACACTGCTGGTTCAACCTATCTAATCTAAAGCATGTTTCC
[0122] ACCCACAAACTGGCAAAGCAATACCTGGAGTATAGAAGCTCATGTATGGAACAAAGATGTCCAGGGTACCATTG
[0123] ACCCCTCTTACTTCACTGAACTCTCCAGACTTCAAATTAGCAATAAAAGACCCTTGATTTGTCTCCACATGAAC
[0124] GATACCACTGCCATCCGCAAAGGCCGCTACATCAAATCCGCATATGGAATGACCAGCAGGGACGGGTCTGGTTA
[0125] ACTCAATGGTTCTGCCTAGCACCCATCTGATATCCCTGTCAAGACCAACCTCTGCTGACCATAGGCAGATTTTG
[0126] GACCATGTCAATGCGGCGCATCCCAGCCCACCACCCTCTGCAATCATGAGTGCACTGTGGGCATTGCTCATAGG
[0127] TGGCCGTCTAATCGTAGTCATTTTCCGGGTACCCAAATTGTACTTGAGAATTCCTGGAGATTTATTGACCACAA
[0128] AGTACAGTGCATTCTCCACAAGAGTGCTGCrTACCGACTGCAAAAGATTACCTAAGTACCCATGATGAGCTGAT
[0129] CCACTCCACGCATTAGCTTCTGACGAGTAGACATAGGACGACATCATAAGTTTTGGATCATGGAGGGACAAGGA
[0130] CATCTTACTACACTGAGAGGCCGCGCCCACAAAGACCACGAGGAAGGGTTTGCCGTGGCAGTCCAGGTGGTCAC
[0131] AGCCATCGGCAGCGCAGAGCACCGCTCCTTTGTAATTGTGCATGATCTGCGGCATCCACGGCGTCGCGGGCAGT
[0132] TCCAGAAGCTCGTCCGTGATAGGATCCCAGACTGCGACGTTGAAGTGGTCACCGGAAAACGAGCTGCGTAAAAG
[0133] GACGCGGCCGTGGCGGGAGTCGATCGCCAGCCAGTTGATGAGCTCGGCGCGGCGCGGCCGGAAGGAGCCGGTGG
[0134] GGACGAAGCGAGCGAGCTTTGCGCCGTCTTCGTTCATGCAGTTCGAGACGAyACCCAGCAAGGGGGGCGACCCG
[0135] TGGTGCTCGCGGAACCTACGGCGGAAGCCCGGTCCGCAGACGAGGCGGCACCAGGGCTTGCACGCGACGGCGGCGCGCATGAGCCGCGCGGGGTCGTCCGGCGGGACGTGGAGGAGGATCTCCTCCACGA。
[0136] 各个高粱品种的基因型检测结果如表1所示。结果显示SNP1(SbPH1‑SNP1)位点有2种基因型(简称SNP1(SbPH1‑SNP1)基因型)，即CC或TT，基因型CC是SNP1(SbPH1‑SNP1)为C的纯合型，基因型TT是SNP1(SbPH1‑SNP1)为T的纯合型；SNP1(SbPH1‑SNP1)为C的纯合型是序列1的第2124位核苷酸为C的纯合型，SNP1(SbPH1‑SNP1)为T的纯合型是序列1的第2124位核苷酸为T的纯合型；SNP2(SbPH1‑SNP2)位点有2种基因型(简称SNP2(SbPH1‑SNP2)基因型)，即GG或AA，基因型GG是SNP2(SbPH1‑SNP2)为G的纯合型，基因型AA是SNP2(SbPH1‑SNP2)为A的纯合型；SNP2(SbPH1‑SNP2)为G的纯合型是序列1的第1659位核苷酸为G的纯合型，SNP2(SbPH1‑SNP2)为A的纯合型是序列1的第1659位核苷酸为A的纯合型。
[0137] 并根据上述基因型设计了下述检测方法：
[0138] 设计SNP1和SNP2的特异引物序列(序列表中的SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7)，均由中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司合成。
[0139] 鉴定SNP1位点多态性的引物组F1如下：
[0140] 特异性引物F1‑A(SEQ ID No.2)：
[0141] 5’‑GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGTTCATGCAGTTCGAGACGAC‑3’
[0142] 特异性引物F1‑B(SEQ ID No.3)：
[0143] 5’‑GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGTTCATGCAGTTCGAGACGAT‑3’
[0144] 通用引物F1‑C(SEQ ID No.4)：5’‑ACCACGGGTCGCCCCCCTT‑3’
[0145] 特异性引物F2‑A(SEQ ID No.5)：
[0146] 5’‑GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATTCTCCACAAGAGTGCTGCG‑3’
[0147] 特异性引物F2‑B(SEQ ID No.6)：
[0148] 5’‑GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCATTCTCCACAAGAGTGCTGCA‑3’
[0149] 通用引物F2‑C(SEQ ID No.7)：5’‑GTGGATCAGCTCATCATGGGTACTT‑3’。
[0150] 上述鉴定SNP1位点多态性的引物组F1是根据序列SEQ ID No.1正义链设计。鉴定SNP2位点多态性的引物组F2是根据序列SEQ ID No.1正义链设计。
[0151] 上述引物F1‑A和F2‑A中下划线序列为FAM序列；F1‑B和F2‑B中下划线序列为HEX序列。
[0152] 上述序列SEQ ID No.2与SEQ ID No.4所示的单链DNA分子扩增序列表SEQ ID No.1中SNP1(SbPH1‑SNP1)位点为C的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号；
[0153] 上述序列SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示的单链DNA分子扩增序列表SEQ ID No.1中SNP1(SbPH1‑SNP1)位点为T的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号。
[0154] 上述序列SEQ ID No.5与SEQ ID No.7所示的单链DNA分子扩增序列表SEQ ID No.1中SNP2(SbPH1‑SNP2)位点为G的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号；
[0155] 上述序列SEQ ID No.6与SEQ ID No.7所示的单链DNA分子扩增序列SEQ ID No.1中SNP2(SbPH1‑SNP2)位点为A的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号。
[0156] 提取供试品种高粱基因组DNA，加ddH2O溶解获得模板，用于PCR扩增。
[0157] 使用上述SNP引物组F1和引物组F2分别进行PCR扩增上述得到的模板，检测SNP位点的多态性(核苷酸种类)和基因型；利用Douglas‑Araya高通量流水线式荧光信号扫描仪对F1引物组和F2引物组的PCR产物进行荧光数据读取，用Douglas专用软件‑Kraken进行荧光信号处理。
[0158] 配制引物混液：先将引物F1‑A、引物F1‑B、引物F1‑C这3条引物分别用ddH2O稀释成‑1100mmol·L ，分别得到引物F1‑A溶液、引物F1‑B溶液、引物F1‑C溶液。取引物F1‑A溶液60μL、引物F1‑B溶液60μL、引物F1‑C溶液150μL，加入10mM Tris‑HCL 230μL，得到引物混液F1。
使用上述方法获得引物F2‑A溶液、引物F2‑B溶液、引物F2‑C溶液，取引物F2‑A溶液60μL、引物F2‑B溶液60μL、引物F2‑C溶液150μL，加入10Mm Tris‑HCL 230μL，得到引物混液F2。
[0159] 若F1引物组PCR产物显示只有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP1位点的基因型为CC(即高粱基因组中SNP1(SbPH1‑SNP1)位点为C的纯合型)；若显示只有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP1位点的基因型为TT(即高粱基因组中SNP1(SbPH1‑SNP1)位点为T的纯合型；若显示既有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号又有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP1位点的基因型为CT(即高粱基因组中SNP1(SbPH1‑SNP1)位点为C和T的杂合型)。若F2引物组PCR产物显示只有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP2位点的基因型为GG(即高粱基因组中SNP2(SbPH1‑SNP2)位点为G的纯合型)；若显示只有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP2位点的基因型为AA(即高粱基因组中SNP2(SbPH1‑SNP2)位点为A的纯合型；若显示既有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号又有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP2位点的基因型为GA(即高粱基因组中SNP2(SbPH1‑SNP2)位点为G和A的杂合型)。
[0160] 待测高粱：235份高粱自交系关联群体
[0161] 2021年在中国山东省东营市农高新区的农田土壤中种植235份高粱自交系关联群体种质资源，采用随机完全区组设计，试验小区长3m、宽2m，种植5行，每行10株，株距0.3m，行距0.5m，正常灌溉。
[0162] 一、高粱的株高测定
[0163] 方法同实施例1使用上述的检测方法对235份高粱自交系关联群体进行基因型和株高进行检测。结果表明(具体如表1所示)，在中国山东省东营市农高新区的农田土壤中种植235份高粱自交系(该关联群体的详细信息见已发表的文章：Xiaoyuan Wu,et al..Genomic footprints of sorghum domestication and breeding selection for multiple end uses.Molecular Plant,2022,VOLUME 15,ISSUE 3,P537‑551(DOI:https://doi.org/10.1016/j.molp.2022.01.002)，品种详细信息如表1所示)，不同高粱品种的的株高存在显著差异，高粱株高范围111‑382厘米，其中138个高粱自交系的株高超过
250厘米，约占该关联群体的58.72％。
[0164] 二、分子鉴定或辅助鉴定高粱自交系的的株高
[0165] 提取待测高粱基因组DNA，加ddH2O溶解作为模板。采用实施例1中的配子基因型相关SNP位点的基因组特异引物组F1和引物组F2进行PCR扩增，得到SbPH1基因相关配子基因型中SNP位点的多态性信息，从而确定待测高粱的基因SbPH1相关的配子基因型和基因型，从而鉴定或辅助鉴定供试高粱品种的的株高：待测高粱SNP的基因型为基因型TTAA的高粱(如高粱自交系)的的株高高于或候选高于SNP基因型为基因型CCGG和CCAA的高粱(如高粱自交系)，基因型CCAA的高粱(如高粱自交系)的的株高高于或候选高于SNP基因型为基因型CCGG的高粱(如高粱自交系)；配子基因型SbPH1‑Hap2(TA)对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)的株高高于或候选高于配子基因型SbPH1‑Hap1(CG)和SbPH1‑Hap3(CA)对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)；配子基因型SbPH1‑Hap3(CA)对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)的株高高于或候选高于配子基因型SbPH1‑Hap1(CG)对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)。
[0166] 235份待测高粱中SNP位点基因型和高粱的株高如表1和表2所示，待测高粱的SNP位点包含CCGG、TTAA和CCAA三种基因型(SNP基因型列所示)。供试高粱基因组中SNP位点按基因组顺序共存在3种单倍型，即单倍型SbPH1‑Hap1(CG)、SbPH1‑Hap2(TA)和SbPH1‑Hap3(CA)。
[0167] 检测结果表明，235份高粱品种中，104个配子基因型SbPH1‑Hap2(TA)的高粱品种中，有73个配子基因型SbPH1‑Hap2(TA)的高粱品种株高高于250cm；19个配子基因型SbPH1‑Hap1(CG)型的高粱品种中，有15个高粱品种株高低于250cm，70.19％的配子基因型SbPH1‑Hap2(TA)的高粱品种中株高高于250cm，78.95％的配子基因型SbPH1‑Hap1(CG)的高粱品种中株高低于250cm。这表明利用配子基因型SbPH1‑Hap1(CG)淘汰低株高的高粱品种，选择配子基因型SbPH1‑Hap2(TA)的高株高的高粱品种，并作为配子基因型分子标记用于高粱株高辅助选择是切实有效的。
[0168] 表1、235份高粱自交系的株高和2个SNP位点的基因型
[0169]
[0170]
[0171]
[0172]
[0173]
[0174]
[0175] 备注：
[0176] IS:改良甜高粱；IG:改良籽粒高粱；LG:地方籽粒高粱；AL:未知高粱；LB:地方帚高粱；Wild:野生高粱；Sudangrass:饲草高粱；Weedy:杂草高粱
[0177] 下述实施例采用GraphPad Prism v8.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One‑way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
[0178] 当显著水平为0.05时，在最小平均数后标记小写拉丁字母a，直到某一个与其差异显著的平均数标记字母b为止。再以标有字母b的平均数，与上方比它大的各个平均数比较，凡与其差异不显著，一律再加标字母b，直到差异显著不加标字母b为止。如此重复下去，直到最大的平均数被标记、比较完毕。各个平均数间凡有一个相同字母的，为差异不显著；凡无相同字母的，为差异显著。
[0179] 对三种单倍型与株高进行差异显著性分析，单倍型SbPH1‑Hap2对应的纯合基因型高粱株高与单倍型SbPH1‑Hap1和SbPH1‑Hap3对应的纯合基因型高粱存在显著差异(P<0.05)，单倍型SbPH1‑Hap2对应的纯合基因型高粱株高高于或候选高于单倍型SbPH1‑Hap1和SbPH1‑Hap3对应的纯合基因型高粱。
[0180] 表2按基因SbPH1的基因型和单倍型组合纯合类型统计的235份高粱自交系的株高[0181] 单倍型类型 基因型 品种数/个 平均株高±标准偏差(cm)c
SbPH1‑Hap1 CCGG 19 204.00±47.25
a
SbPH1‑Hap2 TTAA 104 272.20±54.50
b
SbPH1‑Hap3 CCAA 112 249.70±54.37
[0182] 对单独的SNP1的基因型或SNP2的基因型与株高进行差异显著性分析，结果表明SNP1的纯合基因型(CC)高粱株高与纯合基因型(TT)高粱存在极显著差异(P<0.0001)，基因型SNP1‑AA对应的高粱株高高于或候选高于SNP1‑GG对应的高粱。SNP2的纯合基因型(GG)高粱株高与纯合基因型(AA)高粱存在极显著差异(P<0.0001)，基因型SNP2‑TT对应的高粱株高高于或候选高于SNP2‑CC对应的高粱。
[0183] 表3基因SbPH1的2个SNP位点不同基因型对应的235份高粱自交系的株高及差异分析
[0184]
[0185] 实施例2与高粱株高相关单倍型组合及相关单倍型分子标记的发现
[0186] 一、供试材料的株高统计
[0187] 1、供试材料的种植
[0188] 2021年在中国山东省东营市农高新区的农田土壤中种植235份高粱自交系关联群体种质资源，采用随机完全区组设计，试验小区长3m、宽2m，种植5行，每行10株，株距0.3m，行距0.5m，正常灌溉。
[0189] 2、供试材料的株高统计
[0190] 待235份高粱自交系关联群体完全成熟后，每份材料选取3株，统计每株主茎的株高，三次重复的平均值作为该样品株高的最终结果，如表1中株高所示。
[0191] 二、基因SbPH1相关的单倍型组合及其单倍型分子标记的发现
[0192] 1、235份高粱自交系关联群体的全基因组测序
[0193] 235份高粱自交系关联群体的全基因组测序数据由中国科学院植物研究所生态草牧业工程实验室景海春实验室提供。
[0194] 2、基因SbPH1相关的单倍型组合及其相关单倍型分子标记的发现
[0195] 根据高粱自交系株高和其基因组测序结果，筛选出两个与高粱株高相关基因SbPH1的SNP。SNP1对应于高粱自交系BTx623第2号染色体上第6591060位(BTx623(v3.1)高粱基因组序列信息)，其核苷酸为G或A，该位点位于序列1第2124位置，其为C或T，将该SNP命名为SbPH1‑SNP1，下述又称SNP1。SNP2对应于高粱自交系BTx623第2号染色体上第6591525位(BTx623(v3.1)高粱基因组序列信息)，其核苷酸为C或T，该位点位于序列1的第1659位置，其为G或A，将该SNP命名为SbPH1‑SNP2，下述又称SNP2。序列表中SEQ ID No.1的r表示g或a，y表示t或c。
[0196] 各个高粱品种的基因型检测结果如表1所示。结果显示SNP1位点有2种基因型(简称SNP1(SbPH1‑SNP1)基因型)，即CC或TT，基因型CC是SNP1为C的纯合型，基因型TT是SNP1为T的纯合型；SNP1为C的纯合型是序列1的第2124位核苷酸为C的纯合型，SNP1为T的纯合型是序列1的第2124位核苷酸为T的纯合型。SNP2位点有2种基因型(简称SNP2(SbPH1‑SNP2)基因型)，即GG或AA，基因型GG是SNP2为G的纯合型，基因型AA是SNP2为A的纯合型；SNP2为G的纯合型是序列1的第1659位核苷酸为G的纯合型，SNP2为A的纯合型是序列1的第1659位核苷酸为A的纯合型。
[0197] 在供试群体中，此SNP(SbPH1‑SNP)具有三种配子基因型：配子基因型SbPH1‑Hap1(CG)(简称SbPH1‑Hap1)、配子基因型SbPH1‑Hap2(TA)(简称SbPH1‑Hap2)、配子基因型SbPH1‑Hap3(CA)(简称SbPH1‑Hap3)。配子基因型SbPH1‑Hap1(CG)是SNP1(SbPH1‑SNP1)为C且SNP2(SbPH1‑SNP2)为G的组合，配子基因型SbPH1‑Hap2(TA)是SNP1(SbPH1‑SNP1)为T且SNP2(SbPH1‑SNP2)为A的组合，配子基因型SbPH1‑Hap3(CA)是SNP1(SbPH1‑SNP1)为C且SNP2(SbPH1‑SNP2)为A的组合。SNP1(SbPH1‑SNP1)为C是序列1的第2124位核苷酸为C，SNP1(SbPH1‑SNP1)为T是序列1的第2124位核苷酸为T，SNP2(SbPH1‑SNP2)为G是序列1的第1659位核苷酸为G，SNP2(SbPH1‑SNP2)为A是序列1的第1659位核苷酸为A。
[0198] 株高统计结果显示：配子基因型SbPH1‑Hap2(TA)所对应的纯合基因型高粱的株高显著高于配子基因型SbPH1‑Hap1(CG)和SbPH1‑Hap3(CA)所对应的纯合基因型高粱株高。
[0199] 因此，选择将上述得到的与基因SbPH1相关的单倍型组合用于鉴定或辅助鉴定不同品系高粱的株高；将配子基因型SbPH1‑Hap2(TA)作为鉴定或辅助鉴定不同品系高粱的株高的分子标记，含有配子基因型SbPH1‑Hap2(TA)分子标记的高粱品系的株高可能高于250cm。
[0200] 三、基因SbPH1相关的配子基因型及SbPH1‑Hap2(TA)配子基因型分子标记专用引物的设计及其方法的建立
[0201] 1、配子基因型相关SNP1位点的基因组特异引物设计，配子基因型相关SNP2位点的基因组特异引物设计
[0202] 设计SNP1和SNP2的特异引物序列(序列表中的SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7)，均由中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司合成。
[0203] 鉴定SNP1位点多态性的引物组F1如下：
[0204] 特异性引物F1‑A(SEQ ID No.2)：
[0205] 5’‑GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGTTCATGCAGTTCGAGACGAC‑3’
[0206] 特异性引物F1‑B(SEQ ID No.3)：
[0207] 5’‑GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGTTCATGCAGTTCGAGACGAT‑3’
[0208] 通用引物F1‑C(SEQ ID No.4)：5’‑ACCACGGGTCGCCCCCCTT‑3’
[0209] 特异性引物F2‑A(SEQ ID No.5)：
[0210] 5’‑GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATTCTCCACAAGAGTGCTGCG‑3’
[0211] 特异性引物F2‑B(SEQ ID No.6)：
[0212] 5’‑GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCATTCTCCACAAGAGTGCTGCA‑3’
[0213] 通用引物F2‑C(SEQ ID No.7)：5’‑GTGGATCAGCTCATCATGGGTACTT‑3’。
[0214] 上述鉴定SNP1位点多态性的引物组F1是根据序列SEQ ID No.1正义链设计，鉴定SNP2位点多态性的引物组F2是根据序列SEQ ID No.1正义链设计。
[0215] 上述引物F1‑A和F2‑A中下划线序列为FAM序列；F1‑B和F2‑B中下划线序列为HEX序列。
[0216] 上述序列SEQ ID No.2与SEQ ID No.4所示的单链DNA分子扩增序列表SEQ ID No.1中SNP1位点为C的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号；
[0217] 上述序列SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示的单链DNA分子扩增序列表SEQ ID No.1中SNP1位点为T的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号。
[0218] 上述序列SEQ ID No.5与SEQ ID No.7所示的单链DNA分子扩增序列表SEQ ID No.1中SNP2位点为G的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号；
[0219] 上述序列SEQ ID No.6与SEQ ID No.7所示的单链DNA分子扩增序列SEQ ID No.1中SNP2位点为A的片段，用酶标仪或荧光定量PCR仪可读取到模板中与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号。
[0220] 2、检测方法的建立
[0221] 2.1DNA提取
[0222] 提取供试品种高粱基因组DNA，加ddH2O溶解作为模板用于PCR扩增。
[0223] 2.2PCR扩增和荧光信号检测
[0224] 使用步骤1中引物组F1和引物组F2分别进行PCR扩增上述得到的模板，检测SNP位点的多态性(核苷酸种类)和基因型；利用Douglas‑Araya高通量流水线式荧光信号扫描仪对F1引物组和F2引物组的PCR产物进行荧光数据读取，用Douglas专用软件‑Kraken进行荧光信号处理。
[0225] 配制引物混液：先将引物F1‑A、引物F1‑B、引物F1‑C这3条引物分别用ddH2O稀释成‑1100mmol·L ，分别得到引物F1‑A溶液、引物F1‑B溶液、引物F1‑C溶液。取引物F1‑A溶液60μL、引物F1‑B溶液60μL、引物F1‑C溶液150μL，加入10mM Tris‑HCL 230μL，得到引物混液F1。
使用上述方法获得引物F2‑A溶液、引物F2‑B溶液、引物F2‑C溶液，取引物F2‑A溶液60μL、引物F2‑B溶液60μL、引物F2‑C溶液150μL，加入10Mm Tris‑HCL 230μL，得到引物混液F2。
[0226] 若F1引物组PCR产物显示只有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP1位点的基因型为CC(即高粱基因组中SNP1(SbPH1‑SNP1)位点为C的纯合型)；若显示只有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP1位点的基因型为TT(即高粱基因组中SNP1(SbPH1‑SNP1)位点为T的纯合型；若显示既有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号又有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP1位点的基因型为CT(即高粱基因组中SNP1(SbPH1‑SNP1)位点为C和T的杂合型)。若F2引物组PCR产物显示只有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP2位点的基因型为GG(即高粱基因组中SNP2(SbPH1‑SNP2)位点为G的纯合型)；若显示只有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP2位点的基因型为AA(即高粱基因组中SNP2(SbPH1‑SNP2)位点为A的纯合型；若显示既有与FAM序列结合的荧光基团的荧光信号又有与HEX序列结合的荧光基团的荧光信号，则所述待测高粱SNP2位点的基因型为GA(即高粱基因组中SNP2(SbPH1‑SNP2)位点为G和A的杂合型)。
[0227] 确定基因SbPH1相关的配子基因型和基因型从而鉴定或辅助鉴定供试高粱品种的的株高：待测高粱基因型为TTAA的高粱(如高粱自交系)的的株高高于或候选高于基因型为CCGG和CCAA的高粱(如高粱自交系)。配子基因型SbPH1‑Hap2(TA)对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)的株高高于或候选高于配子基因型SbPH1‑Hap1(CG)和SbPH1‑Hap3(CA)对应的纯合基因型高粱(如高粱自交系)。
[0228] 以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
