[0001] 本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种mascRNA分子标志物在制备诊断PBM中是否患有恶性肿瘤的产品中的应用。

[0002] 年龄作为恶性肿瘤发病的独立危险因素，老年人罹患恶性肿瘤的风险逐渐攀升，恶性肿瘤的早起诊断对于患者的有效治疗和提高生存率至关重要，现阶段对于恶性肿瘤的诊断主要依靠组织活检、影像学检查等手段，但这些方法存在如辐射暴露、创伤等多种副作用。因此，寻找具有高敏感性、特异性的肿瘤标志物对于实现术前无创性诊断尤为迫切。

[0003] mascRNA是一种来源于肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1)的加工后产物，是具有tRNA样结构的胞质小RNA。目前的研究表明，mascRNA生物学功能主要集中于肿瘤及免疫过程。mascRNA在多种恶性肿瘤细胞系中高表达，例如肝癌细胞系(MHCC97L、MHCC97H、SK‑Hep1、SMMC‑7721和Hep3B)；结直肠癌细胞系(HCT15和HCT116)；乳腺癌细胞系(T47D、SK‑BR‑3、MCF‑7和MCF10A)；卵巢癌细胞系(HO‑8910PM和A2780/TAX)。此外，恶性肿瘤组织样本中mascRNA也表现出高表达：例如与癌旁组织相比，肝癌组织中mascRNA的表达显著上调。虽然多项证据表明mascRNA参与肿瘤疾病过程，但限于标本取材具有一定创伤性这一缺陷，体外检测mascRNA则是协助诊断恶性肿瘤的有效方法之一。与机体其他组织器官相比较，mascRNA被证实在外周血细胞中相对高表达，尤其是单核细胞，提示mascRNA具有在单核细胞中发挥相应生物学功能的潜力。

[0004] 单核细胞作为高度可塑的先天免疫细胞，在生理稳态、炎症和肿瘤形成过程中展现出显著的多样性。肿瘤疾病引起的体内及其微环境的变化会直接影响单核细胞的表型、分化和功能。同时，单核细胞通过对肿瘤生长或迁移的影响，在多种恶性肿瘤疾病的进展中有着重要的调控作用。同时，有研究表明在多种类型的肿瘤患者中发现了外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear,PBM)中的差异基因表达，而这些基因的差异表达并不依赖于实质性的肿瘤负荷，因此可以避免一些细胞外生物标志物低敏感性等缺点。

[0020] 下面结合说明书附图和实施例对本发明做进一步地说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

[0021] 收集受试者样本

[0022] 1)血液标本来源

[0023] 共纳入100例确诊恶性肿瘤患者，包括20例结直肠癌、22例肝癌、19例乳腺癌、21例肺癌以及18例胃癌，同时以44例健康体检受试者为对照，空腹采集外周血标本。

[0024] 2)血液样本入选标准

[0025] 所有肿瘤患者均通过诊断指南评估，纳入标准：符合恶性肿瘤诊断标准的肿瘤患者。排除标准：(1)既往史患有其他恶性肿瘤；(2)具有其他免疫系统疾病的患者；(3)严重肝、肾功能不全的患者；(4)免疫功能异常、心脑血管等疾病。

[0026] 实施例1 RT‑qPCR定量分析受试者外周血单核细胞中mascRNA表达丰度[0027] PBM的分离

[0028] 该实验按照天津灏洋华科生物科技有限公司的PBM分离试剂盒(TBD2011H)使用说明操作，以下操作均在室温下进行。

[0029] 1)在15ml离心管中分别加入5ml分离液1和2ml分离液2，再缓慢沿管壁加入2ml抗凝血样品于分离液液面之上；

[0030] 2)600g离心30min；

[0031] 3)离心完成后，用移液枪小心吸取环状乳白色层的单核细胞于新的离心管中；

[0032] 4)向含有单核细胞层溶液的离心管中加入10ml清洗液，充分混匀细胞；

[0033] 5)250g离心10min，弃去上清；

[0034] 6)重复步骤4)和步骤5)；

[0035] 7)获得下一步实验所需的单核细胞沉淀。

[0036] 单核细胞中RNA的提取和纯化

[0037] 细胞总RNA提取参照Takara公司RNA提取试剂RNAiso Plus(9108)使用说明进行操作。

[0038] 1)样品处理

[0039] 在分离得到的单核细胞中加入1ml RNAiso Plus，用移液枪在冰上反复吹打裂解细胞至裂解液中无明显沉淀；

[0040] 2)总RNA提取分离

[0041] a.将上述裂解液转移至1.5ml EP管中，加入200μl三氯甲烷，剧烈涡旋振荡15s，室温静置10min；

[0042] b.4℃，12000g离心15min；

[0043] c.小心吸取上层水相溶液约450μl至新EP管中，加入500μl异丙醇，轻柔颠倒混匀10次，室温静置10‑15min；

[0044] d.4℃，12000g离心10min；

[0045] e.弃去上清，加入1ml 75％乙醇(用DEPC水现配)，涡旋振荡充分洗涤，使管底白色RNA沉淀完全悬浮起来；

[0046] f.4℃，7500g离心10min，弃上清；

[0047] g.将EP管管盖打开自然干燥10min，加入50μl DEPC水溶解RNA。

[0048] 3)RNA质量检测

[0049] a.在超微量核酸检测仪上检测提取RNA的纯度及浓度；

[0050] b.取一定量RNA进行下一步逆转录实验。

[0051] Homo sapiens MALAT1‑associated small cytoplasmic RNA(MASCRNA),small cytoplasmic RNA，NCBI Reference Sequence:NR_144569.1，人源mascRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0052] RNA样品的特异性逆转录(RT)

[0053] RNA特异性RT参照Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit(RR037A)使用说明书进行操作。本实验中的特异性RT用于mascRNA和内参基因U6TaqMan探针的定量检测，样品均以1μg总RNA进行逆转录合成cDNA。所有试剂配制过程均需在冰上操作。

[0054] 表1试剂检测用量表

[0055]试剂 使用量
总RNA 1μg
RNase‑free水 补齐至4.5μl

[0056] 反应条件为90℃，2min；冰上，2min

[0057] 表2逆转录反应体系(10μl)汇总表

[0058]

[0059]

[0060] 反应条件为50℃，15min；85℃，5s；最后是4℃

[0061] 逆转录为cDNA后，加入50μl ddH2O进行稀释，用作TaqMan探针qPCR反应模板。

[0062] 特异性引物和Taqman探针设计

[0063] 表3特异性引物和Taqman探针设计汇总表

[0064]引物及探针 5’to 3’
mascRNA(上游) GATGCTGGTGGTTGGCACTC
mascRNA(下游) TGGAGACGCCGCAGGGAT
U6(上游) CTCGCTTCGGCAGCACA
U6(下游) AACGCTTCACGAATTTGCGT
mascRNA TaqMan探针 CTGGTTTCCAGGACGGGGTTCAGATCCCT
U6 Taqman探针 CCATGCTAATCTTCTCTGTCTCGTTCCA

[0065] PCR反应体系和条件

[0066] 该实验按照Takara公司Premix Ex TaqTM(RR390A)使用说明书操作。

[0067] 表4 PCR反应体系汇总表

[0068]试剂 使用量
Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×) 10.0μl
PCR上游引物(10μM) 0.4μl
PCR下游引物(10μM) 0.4μl
TaqMan探针 0.8μl
ROX Reference Dye(50×) 0.4μl
cDNA模板 2.0μl
ddH2O 6.0μl

[0069] 反应条件：95℃，20s；然后以95℃，1s，60℃，20s的方式循环40次。

[0070] 数据统计学分析

[0071] 以上实验使用GraphPad Prism 6.0软件进行数据统计分析和作图。数据结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。数据符合正态分布的，采用Student’s t检验(双尾)对两组数据间差异进行分析；不符合正态分布的，采用Kruskal‑Wallis非参数检验。两组之间构成2
比比较采用卡方(X)检验。当P<0.05认为两样本间差异有统计学意义，具体表示为：***p<
0.001,****p<0.0001。AUC用于评估mascRNA作为恶性肿瘤诊断标志物的敏感性和特异性。

[0072] 研究结果

[0073] 1.mascRNA在多种恶性肿瘤受试者PBM中的表达情况分析

[0074] 1)受试者的临床资料分析

[0075] 受试者临床资料如表5，结果显示除了乳腺癌患者组，其余恶性肿瘤患者组和健康对照组在年龄、性别方面没有显著差别(P值均大于0.05)。

[0076] 表5研究受试者的临床资料

[0077]

[0078] 2)恶性肿瘤患者和健康对照受试者PBM中mascRNA表达情况分析本实验采用Taqman探针RT‑qPCR技术检测了100例恶性肿瘤患者和44例健康对照受试者PBM中mascRNA的表达丰度。结果显示，恶性肿瘤患者组显著高于健康对照组(P<0.0001)(图1)；且mascRNA在不同类型恶性肿瘤患者组中均高于健康对照组，差异具有统计学意义(图2)。

[0079] 2.mascRNA作为分子标志物诊断多种恶性肿瘤的ROC曲线分析利用GraphPad Prim 6软件制作mascRNA在不同类型恶性肿瘤患者和健康对照的ROC曲线，并通过曲线下面积(AUC)值评估mascRNA在多种类型恶性肿瘤疾病中的诊断效能。其中AUC值越大，表明mascRNA作为相应恶性肿瘤疾病诊断分子标志物的灵敏度和特异性越高，这将大大提升其作为恶性肿瘤诊断分子标志物的可能性。如图3的结果显示，mascRNA在结直肠癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌疾病诊断中的AUC值分别为0.793、0.935、0.794、0.850和0.961；其灵敏度分别为65.00％、86.36％、57.89％、80.95％和94.44％；特异性分别为81.82％、88.64％、
90.91％、90.91％和90.91％。上述结果表明，mascRNA在多种类型恶性肿瘤疾病的诊断中具有较高的诊断效能。