[0001] 本发明属于动物模型技术领域，涉及一种光化学诱导动物意识障碍模型的建立方法。

[0002] 随着医疗技术的进步，颅脑损伤患者的救治率有所提升，但意识障碍问题仍亟待解决。意识障碍可以区分为脑死亡、昏迷、植物状态、最低意识状态等类型。动物模型能够突破以人为实验对象的局限性，为疾病的诊断和治疗提供有力依据。不同类型的意识障碍动物模型，如脑损伤模型，通过不同的建模方法，为深入探索意识障碍的发病机制和治疗方法提供了实验基础。动物模型，如自由落体撞击、冲击加速性模型等，能够模拟不同形式的颅脑损伤，帮助研究者更深入地了解意识障碍的病理过程。同时，弥漫性轴索损伤、液压冲击颅脑损伤等模型也为研究提供了多样的实验手段。此外，光化学诱导法建立的脑梗死和意识障碍动物模型，以及立体定向电解法脑损伤模型等，为研究提供了更为丰富的实验工具。这些模型具有良好的可调控性、可操作性和可重复性，为深入研究意识障碍的发病机制和治疗手段提供了有力支持。然而，动物模型制作和应用仍面临挑战，如模型复制的稳定性和实验条件的控制等。

[0003] 光化学诱导法则是利用光敏物质在单色绿色下产生自由基,直接损伤血管内皮细胞,使其产生脂质过氧化物,促使血小板聚集,激活凝血过程,形成血栓,阻塞血管导致缺血。在脑梗死的大小鼠模型建立中应用非常广泛。而兔脑出血模型始于20世纪80年代，与大型动物模型相比费用较少，且其高成功率和低长期死亡率可以帮助医疗人员更好研究脑出血后的长期神经功能和病理生理机制：与大鼠相比，兔基底神经节更发达，兔脑容积明显大于大鼠，便于外科手术和标本采集；寿命长,各种临床和病理改变易于观察。

[0004] 现有技术中，文献1(游宇,赵振伟,王梁,等.不开颅光化学诱导兔脑皮层梗死模型的建立[J].中华实验外科杂志,2007,24(09):1055‑1056+1153.)给出了如下一种光化学诱导兔脑皮层梗死模型的制作方法:3％戊巴比妥钠按1mlVkg体重的剂量由兔耳缘静脉注人麻醉,固定并剪去头顶部毛发,常规消毒,选择平行于颅骨正中矢状线外侧5mm的直线与眼后角连线交点,纵行切开皮肤约2cm,分离暴露颅骨,刮去骨膜,在矢状缝外侧5mm与冠状缝后5mm处,用牙科钻逐层钻透颅骨的外板和板障,暴露内板并将内板打磨平整,造成不完全穿透颅骨的直径5mm的圆形骨洞,电凝止血后,将操作视野清理千净。由耳缘静脉按1ml/kg体重的剂量缓慢注人3.5％RB溶液,观察兔眼部颜色变化，出现玫瑰红样颜色改变后,通常为注药后5‑10min,启动LG‑150B冷光源设定在MAX档,使单绿色光通过光导纤维,探头接近颅骨骨洞内板,垂直照射30min,然后缝合皮肤,常规消毒处理。

[0005] 文献2(邵义祥,朱顺星,丁莉,等.光化学法诱导兔脑梗塞模型[J].上海实验动物科学,2004,(02):91‑93+128.)给出了一种光化学法诱导兔脑梗塞模型的制作方法:3％戊巴比妥钠按1ml/kg体重由兔耳缘静脉注入进行麻醉，约3～5min,兔处于麻醉状态。固定免头，剪去头顶部被毛，常规局部消毒，沿颅骨的中央与眼后角亚直交叉处纵行切开皮肤约2cm,暴露颅骨，刮离骨膜，见矢状缝和眼眶后的冠状缝。在矢状缝左(或右)侧外0.5cm与冠状缝后0.5cm处，用钻头直径0.5cm的颅钻钻透颅骨，造成颅骨圆形洞窗，明胶海绵压迫止血，清理、暴露脑膜。随即由耳缘静脉按体重1ml/kg一次性缓慢注人3.5％四氯四碘萤光素钠盐。约3min后用L‑G150B型冷光源对准颅骨洞窗，接近脑膜，连续照射8min后，缝合皮肤切，外涂碘酒消毒。

[0006] 文献3(丁莉,朱向阳,邵义祥,等.光化学诱导家兔脑皮层梗死模型建立的研究[J].交通医学,2006,(03):347‑348.)给出的化学诱导家兔脑皮层梗死模型建立方法：3％戊巴比妥以1m lkg的剂量经耳缘静脉麻醉，剪去动物头顶部毛发，固定头部及四肢，常规消毒，选择右侧头颅于冠状线后0.5cm,距中线0.5cm交界处，纵形切开皮肤2cm,暴露头骨，用外径0.5cm颅钻钻透颅骨后，经静脉注射刚果红(3.5％4‑氯‑4‑碘荧光素钠盐)染料，剂量为1mMkg.随即用西安光机所生产的LG150B型冷光源导子(波长540nm绿光，功率为140勒克斯)，经骨窗紧贴于硬脑膜上持续照射8分钟。

[0007] 然而上述文献描述中，使用光化学诱导大脑皮层血管梗死模型，该方法无法致使受试动物置为植物状态，即无法模拟人类脑干缺血导致植物状态的病理过程。

[0025] 首先，对相关技术领域做如下的解释和说明。

[0026] 在人类和动物中，觉醒系统由位于不同大脑区域的数百万神经元组成，采用多种神经递质来恢复和维持清醒状态。尽管觉醒的途径和机制具有广泛的潜在性，但一些观察表明，特定细胞类型和神经元聚集在意识状态调节中具有特定的因果作用。最近的工作表明，意识的行为恢复与多层次神经元尺度(包括细胞内、细胞、局部网络和更广泛的网络)有关。因此为更好地理解脑损伤后产生意识损伤以及在良好康复条件下意识恢复的病理生理过程，需要我们从动物模型开始进行深入探究。

[0027] 在动物的研究中显示，脑干神经元在从麻醉和昏迷中醒来的过程中也起着关键作用。当动物被深度麻醉时，对臂旁核中谷氨酸能神经元的化学遗传和光遗传刺激产生皮质激活，并加速出现意识的过程。类似地，蓝斑去甲肾上腺素能神经元的化学原性刺激产生皮质激活，但在持续麻醉剂暴露期间不会触发行为激活，即使它们广泛地支配大脑皮质和脊髓。相反，在轻度麻醉期间，对腹侧被盖区(VTA)的多巴胺能神经元进行光遗传刺激可使动物恢复正位，且脑电图无明显变化。然而，VTA食欲素能末梢的光遗传刺激激活了皮质活动，并缩短了从麻醉中苏醒的时间，因此脑干神经元在维持意识和意识苏醒过程中有非常重要的作用，基于此，本发明主要对脑干附近，椎基底动脉进行研究。

[0028] 常见的引起意识障碍的原因有脑创伤、脑中风和缺血缺氧性脑病。因此本动物模型构建是通过脑干缺血(阻断脑干部的供血动脉)引起脑干神经元的失营养化，进而导致动物出现意识损伤表现，直至严重意识障碍。目前常用的缺血模型构建方法有两种：开颅阻断供血动脉和采用导管法栓塞供血动脉。光化学法脑血管梗死则是另外一种创伤性小的制作模型方法。光化学法由于操作简单、重复性好、可控性强等优点，一直被广泛应用于这一领域的研究。其原理是：静脉注射荧光剂，随血液循环分布全身，选择要梗死的部位，采用特定波长光照射，荧光剂受到光照后产生自由基物质，导致血管内皮细胞损伤，管腔通透性增大，血小板黏附于血管内皮表面并发生释放反应，激发血管内凝血，导致血栓形成，进而由缺血水肿引起炎性改变甚至坏死，该模型的梗死过程与人类血管病变导致的血栓形成过程类似，其血栓成分病理学证实与产生于人体的血栓类似，是一种较为理想的进行脑缺血性意识损伤的研究模型。

[0029] 兔性情温顺，除了成本低廉、易于饲养、便于操作外(模型制作简单，快速，重复性好，一次可制备大量动物模型，动物体型大进行神经功能评分容易)，其颅内外血管之间无网状吻合，采血操作方便，采血量较多，可满足各项指标测定及动态观察的需要。

[0030] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

[0031] 实施例1：

[0032] 兔子选用体重为2.3‑2.4千克、年龄为12周的成年雄性新西兰白兔。

[0033] 立体定位框架：68915，深圳市瑞沃德生命科技；

[0034] 光活化剂：孟加拉玫瑰红(四氯四碘荧光素632‑69‑9)；

[0035] 探针：光纤(M122L01，Thorlabs，美国)M；光纤耦合准直器(F240FC‑532，f＝7.86mm，Thorlabs，美国)和聚焦透镜(LA1027‑ML，Thorlabs，美国)。

[0036] 按照图1所示的流程：

[0037] S1准备步骤：将兔子固定于定位脑血管的立体定位框架中，光学试验板安装在立体定位框架的基板上，以连接其他部件；

[0038] S2将光活化剂按80mg/kg体重的剂量注入兔的耳缘静脉步骤，具体为如下的操作；

[0039] 将兔子使用15mg/kg的唑来替肌肉注射麻醉，剃除兔子的头部毛发，采在整个手术和激光照射过程中，用1.5％异氟烷持续吸入麻醉维持麻醉状态；

[0040] 消毒并切开兔子头皮暴露颅骨，固定兔子的颅骨于立体定位框架上，使用头部固定器约束头部，枕下后正中旁开15mm进行单侧直径为5mm的开颅术，切开硬脑膜，电凝止血，伤口边缘用局部麻醉剂浸润麻醉，在以连合间线(前连合后缘中点至后连合前缘中点的连线，AC‑PC线)‑3.6mm为中心以接近脑干，将探针对准椎基底动脉，用盐水稀释至10mg/mL并避光的孟加拉红由耳缘静脉按80mg/kg体重的剂量缓慢注入。

[0041] S3观察兔眼部颜色变化，注药后出现玫瑰红样颜色后启动冷光源，使冷光源通过探针垂直照射椎基底动脉，引发光化学反应，得到意识障碍模型。

[0042] 具体地，上述头部固定器为现有技术如ZL 200420033663.5公开的头颅固定装置，或其他类似的装置。

[0043] 该步骤具体通过以下操作：

[0044] 观察兔眼部颜色变化，通常为注药后5‑10min出现玫瑰红样颜色，随后启动冷光源，使投射光源通过光纤接近椎基底动脉(如图2所示)，垂直照射，总曝光量为30min,然后缝合硬膜，缝合皮肤，常规消毒处理，得到意识障碍模型；

[0045] 将兔子放回饲养，进行如以下各试验例，包括意识评估，通过监测不同意识程度(静息状态体态观察或唤醒反应评估意识状态)意识障碍模型的电生理状态，以及头颅核磁或者功能核磁，反应不同意识程度下生理结构或电生理结构的客观改变。

[0046] 将兔子固定于定位脑血管的立体定位框架中，并且可通过5mm颅骨窗观察到较为明显的椎基底动脉，可灵活调整探针的方向和深浅，从而精确定位到目标动脉进行光诱导血管栓塞。

[0047] 造模成功时动物的行为能力低下，反射消失，静息状态评分和唤醒评估均显示为意识受损严重，而出现评分评级为意识正常或稍微受损时的动物为不良模型，则归为制备模型失败，直接安乐死处理。

[0048] 兔的成本低廉、易于饲养、便于操作，使得一次可制备大量动物模型，提高制备成功数量较为容易；并且兔动物体型较大，进行神经功能行为评分容易，降低模型的假阳性率；兔的脑容量较大，病理改变易于观察。

[0049] 本发明所产生的意识障碍模型，可用于意识障碍方面诊断和治疗的研究。

[0050] 试验例1意识行为评估测试

[0051] 评价意识的行为反应通常是通过评价外部刺激引起的行为反应和非外部环境刺激下的自发意识行为反应，意识行为评估以有效的、可操作的行为标志区分意识状态。在人类临床意识障碍诊疗多通过主观评价方法中，通过临床评估量表定量描述患者所处的意识状态。包括使用格拉斯哥昏迷量表(Glasgow coma scale,GCS)和改良昏迷恢复量表(coma recovery scale‑revised,CRS‑R)等意识行为评估量表进行评估。

[0052] 因此本申请也针对建模动物进行意识行为评估的行为反应观察。该评估方法包括对造模动物视觉功能、听觉功能、运动功能、口颜面运动、觉醒水平、脑干反射和呼吸功能进行评估。

[0053] 在制备模型以后进行以下试验例：

[0054] 一、静息状态体态观察：

[0055] 在术后24h由专人负责观察，进行5分制评分。静息状态评分标准：0分，无神经损伤症状；1分，对侧上、下肢肌张力降低，回缩反射减弱；2分，对侧肢体瘫痪明显，后肢外展；3分，行走明显向外拖行，躯体倾向对侧；4分，不能自发行走和意识丧失。

[0056] 二、通过唤醒反应评估意识状态：

[0057] 采用以下唤醒反应评估量表：1级—无反应，表示无可见运动或行为唤醒体征；2级—部分觉醒，指示行为觉醒的体征，包括明显的尾巴或脚的有目的运动，对声音或光照等伤害性刺激有惊吓反应；第3级—广义的有目的的身体运动—仰卧位时试图纠正自己体位；第4级—有组织的运动—完全正确；

[0058] 其中静息状态评分3‑4分，唤醒反应评分1级到2级，则表示为建模成功，此时的动物处于MCS状态，只有当静息状态评分为4分，而唤醒反应评估量表1级是，被认为处于VS状态。

[0059] 试验例2：解剖和病理试验

[0060] 脑梗塞灶的解剖和病理切片观察，模型制作完成后24h处死兔断头去颅顶骨取脑，先切开脑干梗塞灶周边面积约1.5cm组织块放入10％甲醛液中固定24h后，再切去梗塞灶周边脑组织以保留梗塞灶。用游标卡尺测量每个脑梗塞灶纵、横径。再固定于甲醛液中，石蜡切片，HE染色，光镜观察。可见照射部位组织淡染，血管内皮细胞损伤。管腔内可见凝集成团的血小板。白细胞和红细胞形成的血栓堵塞血管腔。边界部位部分细胞胞浆肿胀，空泡化，部分胞体缩小。坏死灶周围可见炎性细胞浸润。

[0061] 对照例：意识障碍模型验证治疗方法试验

[0062] 对照例1：

[0063] 通过无创的经颅直流电刺激(tDCS)，改变意识相应的脑功能链接，促进意识的恢复。有研究显示经颅直流电刺激(tDCS)(0.2mA强度的重复阳极直流电作用于右侧运动皮质，每天20分钟，连续10天)在用于麻醉(异氟醚)导致大鼠意识丧失时，接受atDCS的大鼠出现行为标记(例如翻正反射的恢复)的时间加快。类似地，与假手术组相比，在atDCS治疗的大鼠中，使用的粘性胶带(或粘性点)的使用量有所减少，表明了通过atDCS使得麻醉导致意识丧失后大鼠的视觉和工作记忆得到了增强。

[0064] 1.利用行为学指标对模型的神经功能的改变进行评分，比如上一问题的两个行为评估指标，静息状态和唤醒反应状态的评价，达到静息状态量表评分3‑4分，唤醒反应评分1‑2级。

[0065] 2.病理检查：24小时内脑梗塞病灶的照射部位组织血管腔内可见凝集成团的血小板。白细胞和红细胞形成的血栓堵塞血管腔，梗塞灶多呈圆形。坏死灶内神经细胞形态改变。部分细胞胞浆肿胀、空泡化，部分胞体缩小、核固缩、碎裂、溶解。坏死灶周围可见炎性细胞浸润。此时发生的脑细胞和血管的损伤严重是不可逆的。

[0066] 3.电生理变化：将动物头部固定在头部固定器内后，移除双侧顶叶颅骨，造模前2h及模型构造完成后2h植入微丝电极并连续记录皮质脑电活动。与同一动物造模前顶、枕区的脑电表现相比，出现大量的4～6次/s，8～15μV的3Hz棘慢波爆发，脑电图的δ活动和α活动减少，偶见少量β波。可视为造模成功。

[0067] 对照例2：

[0068] 经颅磁刺激(TMS)，改变意识相应的脑功能链接，促进意识的恢复。在弥漫性TBI模型中研究了硬膜外电刺激(EES)和rTMS对运动恢复和大脑活动的影响。这些大鼠接受了为期14天的预训练，以执行旋转棒试验(RRT)任务。与假手术组相比，RRT在EES从第6天到第11天显著改善，在TMS组从第4天到第9天显著改善。作者总结这两种技术都有助于促进运动恢复和大脑活动。在最近的一项研究中，在成年雄性大鼠中诱导了中度TBI。从TBI第2天开始进行rTMS治疗。在TBI后的第7、14和28天，处死3或4只大鼠，将收获的大脑包埋在石蜡中并切片。苏木精‑伊红染色的结果显示，与对照组相比，在TBI后第28天，TMS组的相对脑实质损失较低，即使差异没有统计学意义。根据免疫组织化学染色，与对照组相比，在TMS组的脑室下区检测到显著更高水平的增殖。在第2天神经元存活率显著较高，在第7天和第14天病灶周围区凋亡率显著降低。这些发现表明高频rTMS可能促进神经发生。

[0069] 对照例3：

[0070] 有创的脊髓电刺激(SCS)，改变意识相应的脑功能链接，促进意识的恢复。脊髓电刺激技术已经在多种动物模型中得到了应用。例如，在大鼠模型中，通过植入可降解压电生物材料并利用远程可控电刺激实现受损脊髓的修复。匹兹堡大学的研究团队显示通过脊髓电刺激恢复了三只猴子部分瘫痪的手臂运动能力。这一研究展示了脊髓电刺激在恢复动物肢体运动能力方面的潜力。因此本申请的动物模型也可以作为意识障碍促醒方面的研究，验证SCS的对于意识障碍治疗的有效性研究。

[0071] 对照例4：

[0072] 脑深部电刺激(DBS)，改变意识相应的脑功能链接，促进意识的恢复。有研究通过记录清醒、睡眠和麻醉猕猴的中央外侧丘脑(CL)和额顶叶皮层的各层电生理。发现了丘脑和皮层深层的神经元对意识水平的变化最敏感，这在不同的麻醉剂和睡眠中是一致的。在使用脑深部电刺激刺激了麻醉猕猴的CL核团，结果发现有效地恢复了唤醒和类似觉醒的神经处理。证明了层特异性丘脑皮质与意识相关，并为有针对性的脑深部刺激如何缓解意识障碍提供了信息。

[0073] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。