[0001] 本发明涉及生物育种技术领域，具体是一种基于褐化指数高效培育抗除草剂半糯香型粳稻的育种方法。

[0002] 水稻是我国主要的粮食作物之一，我国有60％以上人口以稻米为主食。过去20年来，随着经济社会的快速发展，人民生活水平逐渐提高，消费者对稻米食味品质的要求也越来越高，市场对高品质优质粳米的消费需求日益突出。长三角地区居民历来喜欢食用香味浓郁、口感柔软的粳米(张昌泉等，江苏省水稻品质性状遗传和重要基因克隆研究进展，遗传，2021)。香味是稻米的重要品质特征之一，研究表明，水稻香味受到BADH2基因控制，该基因编码一个甜菜碱醛脱氢酶，能够分解香稻香气主要成分2‑乙酰基‑1‑吡咯啉(2‑acetyl‑1‑pyrroline，2AP)的前体物质。目前，在基因BADH2中至少存在17个变异位点，其中第7外显子8bp缺失及3bp突变和第2外显子7bp缺失是香稻资源中较为常见的2个变异位点(彭波等，水稻香味基因及其在育种中的应用研究进展，植物学报，2017；闫影，水稻香味基因分子标记的开发及应用，西北植物学报，2015)。

[0003] 随着劳动力成本及土地集中化程度的上升，直播稻在我国水稻生产上呈明显扩大态势。相对于移栽稻，直播稻田更容易滋生杂草。清除杂草有多种方法，施用除草剂无疑是最经济最有效的策略，尤其是利用广谱性、低毒高效的除草剂。然而，很多广谱性除草剂在消灭杂草的同时也给水稻造成伤害，影响其生长发育和产量。因此，培育抗广谱性除草剂的水稻显得尤为重要。咪唑啉酮类除草剂由美国氰胺公司开发，已有6个商品化品种，包括咪唑烟酯、咪唑乙烟酸、咪唑喹啉酸、甲氧咪草烟、甲基咪草烟、咪草酸，这是一类广谱性除草剂。近年来，我国学者也先后通过诱变筛选策略，获得了ALS抑制剂类除草剂抗性水稻种质(品种)(张保龙等，粳稻的ALS突变型基因及其蛋白和应用，中国专利，CN201710120061.5，2017)。为了加速这些种质在抗ALS抑制剂类除草剂水稻新品种选育中的应用，先后有学者开发了针对这些ALS突变型的功能标记(陈涛等，ALS抑制剂类除草剂抗性水稻功能标记的开发与验证，中国水稻科学，2018)。

[0004] 水稻花药培养是现今比较广泛应用于水稻育种中的一项新的生物技术，始于20世纪70年代后期。由于它具有缩短育种年限、扩大变异范围等优点，在水稻新品种培育、杂交水稻提纯复壮、新种质创制等方面得到了广泛应用。研究者们利用花药培养技术，先后育成了中花系列、龙粳系列和花育系列等粳稻品种以及后续的其他品种(李春勇等，花药培养技术在水稻育种中的应用，农业科技通讯，2014)。

[0005] 当前，在人们生活水平不断提高和劳动力成本不断上升的背景下，选育抗除草剂、优良食味粳稻新品种是解决稻田杂草和提升稻米品质最安全有效的途径。但是，如利用传统常规育种方法选育水稻新品种，获得一个相对纯系至少需要8‑10代以上，而利用双单倍体育种方法一般只需2代，大大加快了育种进程。

[0041] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

[0042] 本发明实施例中，引物序列和DNA模板合成于上海生工生物工程有限公司；Taq酶购自北京杰辉博高生物技术有限公司；1×PCR反应缓冲液购自北京百奥莱博科技有限公司；dNTP购自上海古朵生物科技有限公司。

[0043] 实施例：一种基于褐化指数高效培育抗除草剂半糯香型粳稻的育种方法，如图1‑6所示，包括以下步骤：

[0044] 步骤1：利用6—苄基氨基嘌呤(6‑BA)筛选水稻组培亲本材料，胁迫不同品种的水稻种子萌发与幼苗生长，测量过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等酶活性，计算愈伤褐化指数，获得褐化指数低的亲本材料金粳818、南粳9108、南粳5718等，再利用多酚氧化酶基因PPO等位基因功能标记对上述亲本材料进行分子鉴定，确定这些亲本材料不携带正常的多酚氧化酶基因PPO，为PPO基因缺失型，亲本多酚氧化酶基因PPO检测电泳图如图1所示，图1中，143bp为携带正常多酚氧化酶基因PPO材料，125bp为18bp缺失带型材料；

[0045] 步骤2：2018年冬季，在绿苗产率高的亲本材料中，根据亲本选配原则，选择具有遗传差异、互补性、优良性状、稳定性、适应性、亲缘关系等原则，以抗除草剂且农艺性状较好的粳稻品种金粳818为父本，香型半糯粳稻品种南粳9108为母本进行杂交配组，得F1代水稻植株；

[0046] 步骤3：2019年正季种植F2代，于3叶1心时，将咪草烟(水剂)溶液稀释1000倍按2
300L/hm 喷雾，30d后调查抗性，叶片全部枯萎或死亡为感，植株存活为抗；于喷施药剂前一天取样(叶尖2‑3cm)用于基因型检测，如图3所示；利用分子标记引物对检测暗胚乳突变基mp mp
因Wx 和香味基因badh2，PCR扩增反应体系为：2×PCR master mix10μl；10μmol/L Wx ‑Fmp
(badh2‑F、AS‑ALS‑F)引物0.5μl；10μmol/L Wx ‑R(badh2‑R、AS‑ALS‑R)引物0.5μl；样品DNA 
1.0μl；ddH2O 8.0μl；PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃(根据每对引物Tm值变化决定)退火30s，72℃延伸1min，共进行34个循环；72℃延伸5min；4℃保温mp
5min；结合综合农艺性状鉴定，筛选出暗胚乳突变基因Wx 、香味基因badh2的单株，再利用ALS基因标记检测已含有上述2个基因的单株，自交；重复以上筛选过程，自交1代，即得到F3代水稻植株；

[0047] 步骤4：利用分子标记引物对对F3代水稻植株进行PCR检测，筛选同时具有暗胚乳mp突变基因Wx 、香味基因badh2和抗除草剂基因ALS的单株；

[0048] 其中，所述分子标记引物对包括：

[0049] PPO正向引物：GTTCCCGGCGACCCTGGACA，

[0050] PPO反向引物：ACTTGACGT ACGTGGAGTGGTCGGG；

[0051] Wx正向引物：GGCTGTAAGCACACACAAACTTC，

[0052] Wxmp反向引物：GAACACACGGTCGACTCAAC，

[0053] Wxb反向引物：GAACACACGGTCGACTCAAT；

[0054] badh2正向引物：GGGAGGCGCTGAAGAGGA，

[0055] badh2反向引物：GGGTAGTCACCACCCTACCTTG；

[0056] AS‑ALS正向引物：GAGGCAATCATCGCTACTGG，

[0057] AS‑ALS反向引物：TGTCCTTGAATGCGCCCCTAC，

[0058] AS‑ALS反向引物：TGTCCTTGAATGCGCCCCTAT；

[0059] 步骤5：2021年正季种植F3代，根据分子标记鉴定结果，选择同时携带ALS、Wxmp和badh2基因的单株，在晴天下午16时，目测处于水稻剑叶与倒二叶叶枕距5cm时，颖壳大部分已接近成熟的大小，呈现淡黄绿色，雄蕊伸长达颖壳的1/2，取幼穗，采用压片染色法，用醋酸洋红观察单核靠边期的花粉，将处于单核靠边期的幼穗用保鲜膜包裹，置于6℃低温预处理10d；幼穗单核靠边期观察图如图4所示；

[0060] 步骤6：在无菌台上选取合适的幼穗剥开，用1％的次氯酸钠溶液消毒30min，灭菌水洗7次，取出花药，接种于M8培养基，28℃，暗培养30d；待愈伤组织长至2mm时，在无菌操作台上挑取质地坚硬、淡黄色颗粒状的愈伤组织，转移至分化培养基MS，每个三角瓶中接5个‑2 ‑1 ‑1愈伤组织，暗培养2d，后光照培养，光照强度30μmol·m ·s ，光照时长15h·d ，温度28℃，培养至长出4cm的花培苗；接种过程使用剪颖抖药法；M8培养基：N6培养基+植物凝胶
3.5g/L+蔗糖50g/L+2,4‑D 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L+KT 1.0mg/L+水解酪蛋白0.5g/L，调pH为
5.8；MS培养基：MS培养基+植物凝胶3.5g/L或琼脂6g/L+蔗糖30g/L+NAA 0.5mg/L+6‑BA 
2.0mg/L+MET 2.5mg/L+水解酪蛋白0.5g/L，调PH为5.8；

[0061] 花培苗炼苗、移栽步骤如下：将培养瓶放置日光温室，温度控制在27℃，打开瓶盖，加水至培养基上1cm，炼苗4d，将根部培养基清洗干净，用静置过2 d的自来水继续养苗5d，直至长出1cm的新根。将花培绿苗种植在三亚基地。2022年在南京种植168个花培H1代植株，2022年冬季，在江苏省农业科学院三亚基地种植筛选出的62个花培H2代株系；

[0062] 步骤7：农艺性状观察比较，2023年，花培3代62个株系在江苏省农科院本部基地种植，按编号顺序排列，每行10株，株行距20cm×20cm，每株系种植株数50‑100株；金粳818和南粳9108作为对照，种植于试验区两端和中间；共接种2251枚花药，获得胚状体289个，诱导率12.8％，成苗163株，成苗率56.4％，诱导、分化及幼苗表现较好，如图5所示；苗期，利用氢氧化钾(KOH)法鉴定所有株系香味，喷洒除草剂鉴定抗性；利用所述分子标记引物对具有香mp味和抗除草剂的株系进行鉴定，共获得8个DH株系同时携带基因ALS、Wx 和badh2；最后开展直链淀粉含量、胶稠度等品质性状测定，结合田间农艺性状、抗性接种鉴定结果和食味品质选出最优株系DH66。

[0063] 以上仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理在本发明的专利保护范围。