[0001] 本申请属于DNA材料制备技术领域，具体涉及一种用于制备DNA三维纳米材料的方法和DNA三维纳米材料。

[0002] 脱氧核糖核酸(英文DeoxyriboNucleic Acid，缩写为DNA)，DNA携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。DNA纳米材料是基于碱基配对原理制备的，具有高度的生物相容性和可编程性。

[0003] DNA纳米材料已被广泛应用于生物和医学领域，如细胞募集、类器官构建、蛋白质捕获和信号检测。DNA材料可以分为二维DNA材料和三维DNA材料等。二维DNA材料包括DNA适配体，DNA纳米网。但是，二维的DNA材料的功能单一，不能适应体内复杂的微环境。三维DNA材料包括DNA四面体，DNA超分子水凝胶等。三维DNA材料的构建依赖重金属离子，生物相容性差。而且，三维DNA材料的制备工艺复杂，稳定性差，不能长久储存。

[0038] 为了使本申请的申请目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本申请，并非为了限定本申请。

[0039] 为了简便，本申请仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。

[0040] 在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“一种或多种”中的“多种”的含义是两种及其两种以上。

[0041] 本申请的上述申请内容并不意欲描述本申请中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇申请中的多处，通过一系列实施例提供了指导，这些实施例可以以各种组合形式使用。在各个实例中，列举仅作为代表性组，不应解释为穷举。

[0042] 生物医学组织工程为许多疾病带来了新的治疗策略，其中设计具有生物学功能和优良性能的材料是组织工程一项重要任务。在过去的几十年里，DNA纳米材料已成为工程自组装材料中使用最广泛的分子构建块之一，广泛应用于生物和医学领域，如细胞募集、类器官构建、蛋白质捕获和信号检测等。

[0043] DNA纳米材料可以通过调整DNA分子使数百个短DNA寡核苷酸及长单链DNA折叠成各种纳米级二维或三维结构，以实现不同的功能。DNA纳米材料是基碱基配对原理制备的，具有高度的生物相容性和可编程性。DNA纳米材料已被广泛应用于生物和医学领域，如细胞募集、类器官构建、蛋白质捕获和信号检测。

[0044] 用于生物医学组织工程的材料需要兼顾生物相容性和功能性，与其他材料相比，核酸具有较高的生物相容性以及可编程性，但构建具有特定纳米结构的并满足要求的DNA纳米材料具有较高的难度。二维结构的DNA材料合成比较简单，但不足以满足对材料性能的需求。DNA材料可以分为二维DNA材料和三维DNA材料。二维材料如DNA适配体，DNA纳米网。三维DNA材料如DNA四面体，DNA超分子水凝胶等。但是，二维的DNA材料的功能单一，不能适应体内复杂的微环境。三维材料的构建依赖重金属离子，生物相容性差。而且，三维DNA材料的制备工艺复杂，稳定性差，不能长久储存。

[0045] 目前，DNA折纸和DNA交联网络是构建DNA材料的重要方法。DNA折纸是一种可以将长DNA链折叠成各种形状的3D纳米材料的技术，如DNA纳米花。DNA纳米花已被用于细胞成像和靶向给药。DNA交联网络可用于创建用于生物医学应用的凝胶样材料。这种方法制得的材料可以用于捕获骨髓间充质干细胞(BMSC)和特异性T细胞。然而，DNA纳米花的制备通常依赖重金属离子，如Co和Mn离子，来形成DNA‑无机杂化超结构。这种方法复杂、不稳定而且难以控制。此外，重金属离子可能因其参与和残留而引起细胞毒性，从而限制了纳米花的医学应用。而DNA交联网络高度无序，保质期短，因为它们的结构完全依赖于非共价键。因此，需要一种能够克服这些缺点的方法，实现DNA三维材料的制备。

[0046] 用于制备DNA三维纳米材料的方法

[0047] 第一方面，本申请实施例提供了一种用于制备DNA三维纳米材料的方法，包括：

[0048] S100.提供DNA环状模板，包括：第一环状DNA模板、第二环状DNA模板和第三环状DNA模板，其中，第一环状DNA模板、第二环状DNA模板和第三环状DNA模板分别包括：间隔分布的多个第一碱基序列段和间隔分布的多个第二碱基序列段，第一环状DNA模板中的第一碱基序列段和/或第二碱基序列段分别能与第二环状DNA模板和第三环状DNA模板中至少部分碱基序列段匹配；

[0049] S200.根据DNA环状模板，在DNA聚合酶的作用下进行反应，制得至少部分碱基与DNA环状模板互补的DNA长单链，其中，DNA长单链包括第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链；第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链分别包含：间隔分布的多个第一结合位点和间隔分布的多个第二结合位点；第一DNA单链中的第一结合位点和/或第二结合位点分别能与第二DNA单链和第三DNA单链的至少部分碱基互补结合；

[0050] S300.将包含第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链的混合物以每2‑4℃/min的速度从90‑97℃冷却到25‑37℃并反应，以使至少部分第一结合位点、至少部分第二结合位点与其对应的DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链中的结合位点结合，在DNA拓扑异构酶的作用下，制得DNA三维纳米材料。

[0051] 根据本申请实施例，通过DNA环状模板合成第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链，上述DNA单链中间隔分布有结合位点，可以与其他DNA结合，合成具有一定交联结点的DNA三维纳米材料。在DNA拓扑异构酶的作用下，搭配相应的反应条件，使具有一定交联结点的DNA三维纳米材料发生进一步的构象变化或超螺旋化，使DNA三维纳米材料的结构更加稳定，便于后期纯化、保存和使用，避免了相关技术中的DNA三维纳米材料结构不稳定，只能现用现备。

[0052] 根据本申请实施例，第一DNA单链中的至少部分碱基与第一环状DNA模板碱基互补，第二DNA单链中的至少部分碱基与第二环状DNA模板碱基互补，第三DNA单链中的至少部分碱基与第三环状DNA模板碱基互补。

[0053] 本申请的方法，利用了DNA长单链在溶液中具有自发聚合和发散的性能，通过对反应条件的精确控制DNA拓扑异构酶的作用，实现对不同纳米构象的稳定制备。

[0054] 根据本申请实施例，DNA聚合酶可以包括BST DNA聚合酶和Phi29DNA聚合酶。BST DNA聚合酶，Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的一部分，来源于E.coli菌株。利用基因重组技术，在大肠杆菌中进行表达后经多次纯化分离而得。该酶具有5′→3′DNA聚合酶活性，但不具有5′→3′外切核酸酶活性。Phi29 DNA聚合酶源自Bacillus subtilis噬菌体Phi29。该酶具有卓越的链置换和连续合成特性，可连续合成多达70,000个碱基的DNA片段，并具有3’→5’外切酶校正活性。

[0055] 在一些实施例中，S100中，第一环状DNA模板、第二环状DNA模板和第三环状DNA模板中，第一碱基序列段和第二碱基序列段之间的碱基间距为10bp，可选为5‑20bp。在一些实施例中，S100中，第一环状DNA模板、第二环状DNA模板和第三环状DNA模板中，第一碱基序列段之间的碱基间距为50bp，可选为20‑100bp。在一些实施例中，S100中，第一环状DNA模板、第二环状DNA模板和第三环状DNA模板中，第二碱基序列段之间的碱基间距为100bp，可选为100‑500bp。

[0056] 根据本申请实施例，通过控制第一碱基序列段和第二碱基序列段之间的碱基距离，可以调控后续DNA长单链间的第一结合位点和第二结合位点之间的距离，有助于使DNA三维纳米材料在特定的距离内进行结合，有利于提高DNA三维纳米材料的稳定性。

[0057] 在一些实施例中，S200中，第一结合位点和第二结合位点分别包括一段碱基序列。在任意一个第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链中，第一结合位点和第二结合位点之间的距离为10bp，可选为5‑20bp。在任意一个第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链中，第一结合位点之间的距离为500bp，可选为20‑100bp。在一些实施例中，第一结合位点和第二结合位点的间距为100bp，可选为100‑500bp。

[0058] 根据本申请实施例，控制第一结合位点和第二结合位点之间的距离在上述范围或控制第一结合位点之间的距离或控制第一结合位点和第二结合位点的碱基序列长度在上述范围，有助于使DNA三维纳米材料具有稳定的连接空隙或稳定的连接位点，有助于提高DNA三维纳米材料的稳定性。

[0059] 在一些可选的实施方式中，S100中，DNA环状模板的制备方法包括：

[0060] 分别提供第一DNA单链原料和第二DNA单链原料，其中，第一DNA单链原料和第二DNA单链原料分别包括间隔分布的至少一个第一碱基序列段和至少一个第二碱基序列段；

[0061] 将第一DNA原料单链、第二DNA原料单链和碱基序列连接段混合，在T4 2DNA连接酶的作用下，制得DNA环状模板。

[0062] 在一些实施例中，S100中，第一DNA单链原料和第二DNA单链原料可以为DNA短链。第一DNA单链原料和第二DNA单链原料(Loop部分)的碱基长度范围可以为20‑200bp。第一DNA单链原料和第二DNA单链原料可以通过上海Sangon公司获得。碱基序列连接段(linker部分)的碱基的长度范围可以为10‑100bp。可以合成预定长度的DNA环状模板。采用上述原料制得DNA环状模板，有利于得到设计的DNA长单链，并降低制得DNA长单链的成本。

[0063] 在一些可选的实施方式中，S200中，根据DNA环状模板，在引物的参与下制得至少部分碱基与DNA环状模板互补的DNA长单链包括：

[0064] 将DNA环状模板进行扩增，在BST DNA聚合酶的作用下进行反应，用以实现滚环复制，反应的温度为52‑62℃，反应的时间为24‑48小时，制得至少部分碱基与DNA环状模板互补的DNA长单链。

[0065] 根据本申请实施例，采用上述方法制得的DNA长单链具有结合位点，有助于提高DNA三维纳米材料的稳定性。

[0066] 在一些实施例中，S200中，在任意一个第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链中，第一结合位点和第二结合位点不同。在第一环状DNA模板、第二环状DNA模板和第三环状DNA模板之间，第一结合位点和第二结合位点的间距可以相同。

[0067] 在一些实施例中，S300中，DNA三条长链以每2‑4℃/min的速度从90‑97℃冷却到25‑37℃并反应。可选的冷却的速度可以为2℃/min、3℃/min和4℃/min.冷却的目标稳定可以为30℃，31℃，32℃，33℃，34℃，35℃，36℃，37℃中的任意数值或其组成的范围，最后用DNA拓扑异构酶稳固其形态。在上述反应条件下，可以更有效地使第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链中的位点结合，同时使结合后的DNA材料发生超螺旋化，提高DNA三维纳米材料的稳定性。

[0068] 在一些实施例中，S300中，第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链的总质量与DNA拓扑异构酶的质量的比例为1：(1‑10)。上述物质的摩尔比值在上述范围，有利于实现DNA三维纳米材料超螺旋化，并提高其稳定性。

[0069] 在一些可选的实施方式中，在S300中，制得结DNA纳米网格复合结构的第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链的长度较长，具有的较多的结合位点(包括第一结合位点和第二结合位点)，结合位点具有刚性，具有较多的结合位点，DNA长单链呈刚性，不易发生卷曲，因而易生成DNA纳米网格复合结构，且在结合位点的结合与DNA拓扑异构酶的配合作用下，提升了结构的稳定，便于保持保存。

[0070] 在一些可选的实施方式中，S300中，制得结构稳定的DNA纳米花形复合结构的第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链的长度较短，具有的结合位点(包括第一结合位点和第二结合位点)数量较少，结合位点具有刚性，DNA长单链易发生卷曲，因而易生成DNA纳米花形复合结构，且在结合位点的结合与DNA拓扑异构酶的配合作用下，提升了结构的稳定，便于保持保存。

[0071] 在一些可选的实施方式中，在S300中，第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链的摩尔比为1：(0.1‑50)：(0.1‑50)。可选为1：1：1.控制第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链的摩尔比在上述范围，在节约原料的前提下，有利于制得比例较高的DNA三维纳米材料。

[0072] 在一些可选的实施方式中，在S300中，DNA三维纳米材料包括DNA纳米花形复合结构或DNA纳米网格复合结构中的一种或几种。

[0073] 在一些可选的实施方式中，在S300中，将包含第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链的混合物，在DNA拓扑异构酶和金属离子的作用下，以每2‑4℃/min的速度从90‑97℃冷却到25‑37℃并反应，以使至少部分第一结合位点、至少部分第二结合位点与其对应的DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链中的结合位点结合，制得DNA纳米花形复合结构，其中，金属离子包括镁离子、钙离子、钾离子和钠离子中的一种或几种。

[0074] 根据本申请实施例，将上述原料的混合物在DNA拓扑异构酶和金属离子的作用下，以每2‑4℃/min的速度从90‑97℃冷却到25‑37℃并反应，可使第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链实现位点结合和自发变构，从而使DNA纳米花形复合结构具有稳定的结构。

[0075] 在一些实施例中，在S300中，将包含第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链的混合物，在DNA拓扑异构酶的作用下，以每2‑4℃/min的速度从90‑97℃冷却到25‑37℃并反应，以使至少部分第一结合位点、至少部分第二结合位点与其对应的DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链中的结合位点结合，制得DNA纳米网格复合结构。根据本申请实施例，在制备过程中，第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链自身的聚合作用，对金属离子的联结作用依赖较弱，可以不采用金属离子，使制得的纳米材料具有制备简易，且存储稳定性高。

[0076] 在一些实施例中，在S300中，将包含第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链的混合物，以每2‑4℃/min的速度从90‑97℃冷却到25‑37℃并反应，以使至少部分第一结合位点、至少部分第二结合位点与其对应的DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链中的结合位点结合，制得包含DNA纳米花形复合结构和DNA纳米网格复合结构的DNA三维纳米材料。根据本申请实施例，在制备过程中，第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链自身的聚合作用，对金属离子的联结作用依赖较弱，可以不采用金属离子，不采用DNA拓扑异构酶，制得包含DNA纳米花形复合结构和DNA纳米网格复合结构的DNA三维纳米材料。

[0077] 在一些可选的实施方式中，在S300中，DNA纳米花形复合结构的体积为0.0001‑100立方微米；可选为≥20立方微米；可选地，DNA纳米花形复合结构呈球形颗粒外观，内部具有层叠花瓣形片层。

[0078] 在一些可选的实施方式中，DNA纳米花形复合结构的直径为200‑5000nm。

[0079] 在一些可选的实施方式中，DNA纳米网格复合结构在投影面的面积为100μm2‑1mm2；可选地，DNA纳米网格复合结构呈网格层状外观。

[0080] 由本申请采用滚环扩增的方法合成的DNA长链，DNA长单链可以交联形成纳米网前体和纳米花前体。在拓扑酶的作用下，纳米网前体固定为DNA纳米网格复合结构。而在轻金属离子和DNA拓扑异构酶的作用下，纳米花前体转化为具有拓扑结构的DNA纳米花形复合结构。DNA三维纳米材料经过冻干后可在低温干燥环境中以存储长达六个月以上，具有成本低，可广泛应用的特点，解决了现有DNA三维材料需要即用即配的缺陷。

[0081] DNA三维纳米材料

[0082] 第二方面，本申请实施例提供了一种DNA三维纳米材料，通过第一方面的方法制得。

[0083] 根据本申请的实施例，DNA三维纳米材料包括DNA纳米花形复合结构或DNA纳米网格复合结构中的一种或几种。

[0084] 利用DNA三维纳米材料具有自发拉伸和卷曲的特性，使DNA三维纳米材料在不同的实验条件下可以呈现纳米网或纳米球的形态。DNA纳米网格复合结构可以用作纳米DNA适体，DNA纳米层，招募干细胞，对适配体的增强作用。可以用于定向募集干细胞。DNA纳米花形复合结构可应用于成像，药物靶向递送，摄取细胞等方面。DNA花形复合结构对荧光分子的携带作用，可以在短时间内大量携带荧光分子进入细胞。

[0085] DNA三维纳米材料具有下列用途：

[0086] 1)组织工程修复。可以将该材料附着于组织工程修复的材料上。增强干细胞的附着与迁移能力。将干细胞定植到固定的部位。

[0087] 2)提高活细胞荧光染料的递送效率。可以用于特定的核酸活细胞染料。可以极大地提升小荧光分子的递送效率。

[0088] 3)小分子药物的递送。可以通过挂载活性小分子，将分子递送到细胞内，增加细胞内有效浓度。

[0089] 实施例

[0090] 下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。

[0091] 实施例1

[0092] 1、DNA纳米结构的设计。通过在oxDNA

[0093] (https://sulcgroup.github.io/oxdna‑viewer/#)和NUPACK

[0094] (https://www.nupack.org)模拟设计DNA材料原料，通过上海Sangon获得若干组第一DNA单链原料和第二DNA单链原料，具体如Loop1.1，Loop1.2，Loop2.1，Loop2.2，Loop3.1，Loop3.2。并根据第一DNA单链原料和第二DNA单链原料设计出碱基序列连接段，如Linker1.1、Linker1.2、Linker2.1、Linker2.2、Linker3.1和Linker3.2。

[0095] 2、合成环状DNA模板：将四条DNA短链，每组中的Loop1.1，Loop1.2、Linker1.1、Linker1.2的混合物以每2分钟2℃的速度从95℃冷却到37℃，并在37℃下反应10分钟。加入T4 DNA连接酶，在16℃下进行10小时。制备第一DNA环状模板，如图11所示。

[0096] 将四条DNA短链，每组中的Loop2.1，Loop2.2、Linker2.1、Linker2.2的混合物以每2分钟2℃的速度从95℃冷却到37℃，并在37℃下反应10分钟。加入T4 DNA连接酶，在16℃下进行10小时，制备第二DNA环状模板，如图12所示。

[0097] 将四条DNA短链，每组中的Loop3.1，Loop3.2、Linker3.1和Linker3.2.的混合物以每2分钟2℃的速度从95℃冷却到37℃，并在37℃下反应10分钟。加入T4 DNA连接酶，在16℃下进行10小时，制备第三DNA环状模板，如图13所示。

[0098] 表1相关碱基序列。

[0099]

[0100]

[0101] 3、DNA长单链的制备：分别将各类环状DNA模板与其对应的引物(Primer1、Primer2和Primer3)、dNTp，在BST DNA聚合酶的作用下，在62℃反应24‑48小时进行PCR扩增，制得DNA长单链，包括第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链。

[0102] 实施例2

[0103] 本实施例与实施例1的不同之处在于：第一DNA单链原料和第二DNA单链原料不同，Loop1.1，Loop1.2，Loop2.1，Loop2.2，Loop3.1，Loop3.2。并根据第一DNA单链原料和第二DNA单链原料设计出碱基序列连接段，如Linker1.1、Linker1.2、Linker2.1、Linker2.2、Linker3.1和Linker3.2。上述序列如表2所示。

[0104]

[0105]

[0106] 实施例3DNA纳米网格复合结构

[0107] 本实施例的第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链是分别按照上述实施例1或实施例2的方法得到，添加的量如下：4nM环状DNA模板、20nM primer、56nM dNTP和4U Bst DNA聚合酶混合物制备得到。反应条件为62℃和48小时。将含三种DNA长链的溶液以相等摩尔比例混合。将混合物以每2分钟2℃的速度从95℃冷却到37℃，并在37℃下反应10分钟，以将DNA长链自组装成没有拓扑结构的前体DNA纳米网。通过与DNA拓扑异构酶在37℃下反应15分钟，获得具有稳定拓扑结构的纳米网，即本申请的DNA纳米网格复合结构。本实施例的制备方法流程示意图如图1所示。

[0108] 纯化与贮存：通过使用3倍液体体积的异丙醇分别去除可溶性杂质来纯化。异丙醇和DNA高维材料的混合物在‑20℃下孵育20分钟，然后以12000rpm离心5分钟，取出上清液，然后在真空中冷冻干燥，以获得纯DNA高维材料的粉末，然后于真空冻干机中冻干，储存于干燥低温环境中。冷冻后，使用电镜进行观察，得到如图2所示的显微结构。

[0109] 实施例4DNA纳米花形复合结构

[0110] 本实施例的第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链是分别按照上述实施例1或实施例2的方法得到，添加的量如下：1nM环状DNA模板、5nM primer、3.5nM dNTP和1U Bst DNA聚合t酶混合物制备得到。反应条件为62℃，持续12小时。随后，将三种DNA长链溶液按相等摩尔比例混合，并将MgCl2溶液加入到10nM的最终浓度，然后以每2分钟2℃的速率从95℃冷却到37℃，并在37℃下反应10分钟，以将DNA长链自组装成没有拓扑结构的前DNA纳米花。通过与DNA拓扑异构酶I在37℃下反应15分钟，获得具有稳定拓扑结构的纳米花，即本申请实施例的DNA纳米花形复合结构。本实施例的制备方法流程示意图如图3所示。

[0111] 纯化与贮存：通过使用3倍液体体积的异丙醇分别去除可溶性杂质来纯化。异丙醇和DNA高维材料的混合物在‑20℃下孵育20分钟，然后以12000rpm离心5分钟，取出上清液，然后在真空中冷冻干燥，以获得纯DNA高维材料的粉末，然后于真空冻干机中冻干，储存于干燥低温环境中。冷冻后，使用电镜进行观察，得到如图4所示的显微结构。

[0112] 实施例5包含DNA纳米花形复合结构或DNA纳米网格复合结构双模态纳米材料[0113] 本实施例的第一DNA单链、第二DNA单链和第三DNA单链是分别按照上述实施例1或实施例2的方法得到，添加的量如下：2nM环状DNA模板、10nM RCA引物、14nM dNTP、2U Bst酶混合物组成。反应条件为62℃，持续24小时(图S5b)。随后，将三种DNA长链溶液以相等摩尔比例混合。将混合物以每2分钟2℃的速度从95℃冷却至37℃，并在37℃下保持10分钟，制得包含DNA纳米花形复合结构或DNA纳米网格复合结构双模态纳米材料。本实施例的制备方法流程示意图如图5所示。

[0114] 纯化与贮存：通过使用3倍液体体积的异丙醇分别去除可溶性杂质来纯化。异丙醇和DNA高维材料的混合物在‑20℃下孵育20分钟，然后以12000rpm离心5分钟，取出上清液，然后在真空中冷冻干燥，以获得纯DNA高维材料的粉末，然后于真空冻干机中冻干，储存于干燥低温环境中。将制得的包含DNA纳米花形复合结构或DNA纳米网格复合结构双模态纳米材料溶于水溶液中，使用电镜进行观察，得到如图6所示的显微结构。

[0115] 对比例1

[0116] 本对比例与实施例3的不同之处在于：没有采用DNA拓扑异构酶参与反应。

[0117] 对比例2

[0118] 本对比例与实施例4的不同之处在于：没有采用镁离子和DNA拓扑异构酶参与反应。

[0119] 应用例1对骨髓间充质干细胞的定向募集

[0120] 将1nM含有Apt19s的探针和实施例3制得的DNA纳米网格复合结构以质量浓度比1:6混合，以便将适配体挂载到网上，组装成功能化的DNA纳米网。将功能化的DNA纳米网和等浓度的APT19s用紫外固定到培养皿中央直径为1cm的区域内。我通过光镜和结晶紫染色观察，可以观察到在固定功能化DNA纳米网的区域有明显的细胞聚集，说明了干细胞向固定DNA的区域募集并且功能化DNN的招募效果要明显高于单纯的APT19s。

[0121] 此外，将对比例1制得的DNA纳米网格复合结构与1nM含有Apt19s的探针以同样的实验条件进行制备，可以观察到细胞募集效果强于单纯APT19S组小于纯DNA纳米网组，说明了纯DNA纳米网的定向招募能力是最强的。

[0122] 应用例2对细胞荧光定位探针摄取的增强作用

[0123] 将实施例4制得的实施例DNA纳米花形复合结构与来源于Sangon的20ng/μl的DNA荧光探针混合，通过在25℃下，孵育1h。带正电荷的携带DNA探针的DNA纳米花颗粒的尺寸为4313nm。将培养后的混合物加入1ml培养基中，作用于来源于小鼠的动物的ATDC5软骨前体
5
细胞(浓度为10/L)，使用具有超微分辨率的成像系统，观察效果。可以观察到DNA纳米花可以在30分钟内携带大量探针进入细胞，并表现出强烈的荧光信号。

[0124] 另外，只采用20ng/μlDNA荧光探针的组别效果较差。

[0125] 此外，将对比例2制得的DNA纳米花形复合结构与1nM含有Apt19s的探针以同样的实验条件进行制备，可以观察到对比例2中的没有拓扑异构酶和镁离子处理后的结构其进入细胞的效果远差于实施例3的纳米花形复合结构组，说明了实施例3组是携带小分子DNA进入细胞的最佳形态。

[0126] 分析原因可能在于：DNA纳米花形复合结构上有大量DNA探针的结合位点，可以同时携带大量DNA探针进入细胞，通过观察到的共聚焦荧光显微镜拍摄的实验效果，可以反应实施例4中的DNA纳米花形复合结构与对比例2中的结构更加稳定，从而出现了上述效果。

[0127] 经实验证明，20ng/μl的DNA纳米花浓度是将探针携带到细胞中的最佳浓度。

[0128] 测试部分

[0129] 稳定性检测：将实施例3‑4和对比例1‑2制得的DNA三维纳米材料进行冻干成为粉末后，用电镜进行观察，之后常温保存6个月，并将其溶于水中，使水中的DNA三维纳米材料的浓度一致。并使用冷冻断裂电镜对保存6个月在水溶液中的DNA三维纳米材料进行检测。得到如表3所示的结果，如图8‑11所示的图片。

[0130] 表3

[0131]

[0132] 从图中可知，图8‑9依次为实施例3和4中的DNA三维纳米材料储存前冻干形态和储存后溶于水的图片，从图中可知，其结构稳定，保存良好，保持其原有功能结构。图10‑11依次为未使用DNA拓扑异构酶对比例1‑2中的DNA三维纳米材料常温保存前后分别溶于水的图片。从表3和图可知，对比例1‑2保存6个月后已不具有原来的结构，已经发生很大程度的降解，这种情形下需要即配即用，不能保存，而实施例3‑4的DNA三维纳米材料储存后结构稳定，仍然可以使用。

[0133] 以上，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以权利要求的保护范围为准。