[0001] 本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种具有降压活性的竹多肽及其制备方法和应用。

[0002] 高血压是指以体循环动脉血压(收缩压和/或舒张压)增高为主要特征(收缩压≥140mmHg，舒张压≥90mmHg)，可伴有心、脑和肾等器官的功能或器质性损害的临床综合征，是最常见的慢性非传染性疾病。血压升高是多种疾病的导火索，会使冠心病、心力衰竭及肾脏疾患等疾病的发病风险增高，还是脑卒中的主要危险因素。由于部分高血压患者并无明显的临床症状，高血压又被称为人类健康的“无形杀手”。因此，预防和治疗高血压，成为了当今社会关注的焦点。

[0003] 人体的血压调节机制十分复杂，但主要是依靠肾素‑血管紧张素系统(RAS)和激肽酶‑激肽释放系统(KKS)协调保持稳定的。其中，基于人体肾脏中的肾素‑血管紧张素‑醛固酮(RAAS)系统的认识，人类对血管紧张素转化酶(ACE)作用机制的解析被认为是高血压治疗的重要突破。RAAS系统是由肾脏产生的压力调节系统。ACE是RAAS系统中的关键酶，它催化血管收缩性Ang II的生成，导致血管壁紧缩、血压升高；同时，ACE作用于具有血管扩张活性的缓激肽，促进其降解、失活，间接引起血压的升高。抑制ACE的活性被认为是达到降压效果的关键步骤。其降压原理主要是通过阻断RAAS系统，抑制ACE活性，从而抑制循环及局部组织血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ，使血管紧张素Ⅱ生成减少，抑制缓激肽降解，从而起到舒张血管、降低血压的作用。

[0004] 目前，广泛应用于治疗高血压的药物主要是ACE的抑制剂如卡托普利、赖诺普利、依那普利及培哚普利等。然而服用治疗高血压的药物通常会引起副作用，天然来源的ACE抑制肽因其安全性较高而备受研究者关注。自从1965年第一条ACE抑制肽被发现以来，研究人员从各种不同来源的天然蛋白质中获取了六千多条ACE抑制肽，其中来源于食品的最多。目前，分别从牛奶β‑酪蛋白和κ‑酪蛋白中提取的三肽VPP和IPP，其体内抗高血压活性已在动物实验和临床试验中得到进一步证实。然而目前报道的多肽类物质普遍存在降压效果较差的问题。

[0037] 本发明提供了一种具有降压活性的竹多肽，所述竹多肽包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的竹多肽和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽。

[0038] 在本发明中，所述竹多肽根据原料的不同可以分别称之为竹笋多肽、退笋多肽和嫩竹多肽等。

[0039] 在本发明中，所述竹多肽可以采用常规多肽合成方法直接制备得到，也可以采用本发明提供的制备方法制备得到。

[0040] 本发明提供上述技术方案所述竹多肽的制备方法，包括以下步骤：

[0041] 将竹匀浆液进行发酵，得到发酵液；

[0042] 收集所述发酵液中分子量小于3kDa的多肽，得到竹多肽。

[0043] 本发明将竹匀浆液进行发酵，得到发酵液。在本发明中，所述竹匀浆液的制备方法优选包括以下步骤：将竹原料粉碎后与水进行混合，然后匀浆，得到竹匀浆液；所述竹原料与水混合的料液比优选为1kg:(5～15)L。在本发明中，所述竹原料优选包括竹笋、退笋和嫩竹的任一种或两种以上；所述嫩竹优选包括一年生以内的竹子；所述竹笋优选包括竹笋加工剩余物。本发明对所述竹原料的来源没有特殊限定，采用本领域常规的竹原料均可。得到竹原料后，本发明优选先将竹原料依次进行去壳、清洗和切块后再进行粉碎。本发明对所述去壳、清洗、切块和粉碎的方法没有特殊限定，采用常规方法均可。本发明所述粉碎的体积3
优选为2mm 。粉碎后，本发明优选得到粉碎物料。得到粉碎物料后，本发明优选将所述粉碎物料与水进行混合，得到混合物料；所述粉碎物料与水混合的料液比优选为1kg:(5～15)L，更优选为1kg:10L。在本发明中，所述水优选包括蒸馏水。得到混合物料后，本发明优选将混合物料进行匀浆；本发明对所述匀浆的方法没有特殊限定，采用本领域常规匀浆方法均可；
本发明所述匀浆优选在室温条件下进行。匀浆完成后，本发明得到竹匀浆液。

[0044] 得到竹匀浆液后，本发明优选将所述竹匀浆液进行发酵。得到竹匀浆液后，本发明优选先将竹匀浆液灭菌后进行发酵；本发明对所述灭菌的条件没有特殊限定，采用常规灭菌方法均可。在本发明中，所述灭菌的温度优选为121℃；所述灭菌的时间优选为20min。在本发明中，所述发酵用菌剂优选包括高地芽孢杆菌ICBR‑C01；所述高地芽孢杆菌ICBR‑C01的保藏编号为CGMCCNo.29900。本发明进行发酵时，所用菌剂的接种量为竹匀浆液体积的6 8
6％～10％，更优选为8％；所用菌剂的菌活优选为1×10 ～1×10 CFU/mL，更优选为1×
7 7
10CFU/mL。进一步地，本发明进行发酵时，优选将菌活为1×10CFU/mL的菌液按竹匀浆液体积的6％～10％进行接种。本发明所述发酵优选包括有氧发酵；所述发酵的温度优选为20℃～37℃，更优选为37℃；所述发酵的时间优选为8～15h，更优选为12h；所述发酵优选伴随搅动；所述搅动的转速优选为150～200rpm，更优选为200rpm。在本发明中，所述发酵优选在控温摇床中进行。发酵完成后，本发明优选将发酵产物离心后进行过滤，得到发酵液；所述离心的转速优选为6000rpm；所述离心的时间优选为10min；离心完成后，本发明优选进行过滤；所述过滤优选采用0.22μm滤膜进行。本发明采用0.22μm滤膜进行过滤主要是滤除发酵菌以终止发酵的进行。过滤完成后，本发明取滤液得到发酵液。

[0045] 得到发酵液后，本发明收集所述发酵液中分子量小于3kDa的多肽，得到竹多肽。在本发明中，所述收集的方法优选包括离心超滤。离心超滤优选采用超滤离心管进行；所述超滤离心管的截留分子量优选为3kDa；所述离心的转速优选为10000rpm；所述离心的时间优选为20min。离心完成后，本发明收集滤液，所述竹多肽存在于滤液中。

[0046] 得到竹多肽后，本发明优选将所述竹多肽鉴定后，进行ACE抑制肽的筛选，得到具有降压活性的竹多肽。在本发明中，所述鉴定方法优选包括LC‑MS/MS检测、数据库检索和多肽组学分析。本发明对所述鉴定的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规方法均可。本发明优选通过多肽组学分析获得发酵液中新产生的多肽序列。得到多肽序列后，本发明优选通过多肽序列分析氨基酸结构，利用多肽活性预测工具筛选ACE抑制肽。

[0047] 本发明采用上述技术方案所述制备方法制备得到的竹多肽与ACE的分子对接结果较好，与相应靶点具有较好的结合能力。经ACE抑制活性测定验证，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的竹多肽和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽对ACE的IC50分别为11.4783μM和11.7883μM。所述竹多肽具有明显的ACE抑制作用。

[0048] 本发明提供了上述技术方案所述竹多肽或上述技术方案所述制备方法制备得到的竹多肽在制备降压产品中的应用。在本发明中，所述产品包括保健品和/或功能食品。本发明所述竹多肽与已报道的ACE抑制肽相比，具有明显的优势，可应用于制备具有辅助降压功能的保健品和功能食品，具有广阔的市场应用前景。

[0049] 为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0050] 实施例1

[0051] 竹笋多肽，其制备方法具体为：

[0052] 1.发酵液的制备

[0053] 将竹笋去壳清洗，切块粉碎至2mm3大小，按笋肉与蒸馏水的料液比为1kg:10L匀浆，匀浆在室温条件下进行，得到匀浆液后，将匀浆液于121℃，灭菌20min，制成竹笋匀浆液。按8％(v：v)的接种量向竹笋匀浆中接入高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)ICBR‑7
C01菌液，所述菌液的菌活为1×10CFU/mL。于37℃有氧发酵12h，发酵时置于控温摇床，摇床转速为200rpm，之后将发酵液转入离心管中6000rpm离心10min，取上清过0.22μm滤膜终止反应。

[0054] 2.低分子量肽的回收

[0055] 采用离心超滤法回收分子量小于3kDa的多肽。取0.5mL离心后上清液于2mL、截留分子量是3kDa的超滤离心管中，10000rpm离心20min，收集滤液，滤液中含有竹笋多肽。

[0056] 3.样品还原烷基化前处理

[0057] (1)取步骤2中竹笋多肽滤液样品，加入浓度为1M二硫苏糖醇溶液使竹笋多肽滤液样品中二硫苏糖醇终浓度为10mmol/L，于56℃水浴中还原1h；

[0058] (2)加入浓度为10mM碘乙酰胺溶液使其终浓度为50mmol/L，避光反应40min；

[0059] (3)使用自填脱盐柱脱盐，于45℃真空离心浓缩仪中挥干溶剂。

[0060] 4.竹笋多肽的鉴定

[0061] 采用LC‑MS/MS检测，具体条件与步骤为：

[0062] (1)液相色谱条件

[0063] ①分析柱：AcclaimTM PepMapTM RPLC C18(150μm I.D.×150mm，3μm， )；

[0064] ②流动相A：体积分数0.1％甲酸水溶液；

[0065] ③流动相B：体积分数80％乙腈(含0.1％甲酸)水溶液；

[0066] ④流速：600nL/min；

[0067] ⑤分析时间：66min；

[0068] (2)质谱条件

[0069] ①一级质谱参数：Resolution：120,000；AGCtarget：Standard；MaximumIT：20ms；Scanrange：300to 1800m/z。

[0070] ②二级质谱参数：Resolution：50,000；AGCtarget：Standard；MaximumIT：22ms；TopN：20；NCE/steppedNCE：30。

[0071] (3)LC‑MS/MS检测

[0072] 当检测发酵前的竹笋多肽时，取竹笋匀浆液过0.22μm滤膜后的滤液100μL，进行样品还原烷基化前处理后，进行LC‑MS/MS检测。LC‑MS/MS检测结果如图1所示。

[0073] 当检测发酵后的滤液中的竹笋多肽时，取步骤3还原烷基化处理后的样品，进行LC‑MS/MS检测。LC‑MS/MS检测结果如图2所示。

[0074] 其中图1为LC‑MS/MS检测发酵前总离子流图；图2为LC‑MS/MS检测发酵后总离子流图。图1和图2的横坐标轴表示的是time(min)；纵坐标轴表示的是relative abundance。

[0075] 图1中的数字从左到右依次为0.16，3.65，4.18，5.17，5.86，8.10，9.42，9.92，9.99，10.48，13.66，15.12，15.49，15.76，17.86，18.55，19.30，21.11，23.55，23.85，24.99，
27.39，27.52，29.69，30.77，32.14，34.74，34.91，36.75，38.62，41.17，43.43，43.97，
44.77，45.10，46.04，46.96，49.70，52.09，53.02，55.47。

[0076] 图2中数字从左到右依次为1.86，4.07，5.63，5.90，6.79，6.95，8.69，9.39，9.45，9.78，10.01，10.11，11.29，14.23，15.29，17.69，18.11，19.23，20.67，23.04，24.64，27.14，
28.90，30.52，30.97，32.93，33.61，34.65，36.43，36.68，39.04，40.49，42.27，42.77，
43.56，45.01，46.31，47.24，50.08，50.17，51.26，54.35，54.41，54.78，54.89，55.24。

[0077] 3)数据库检索

[0078] 质谱原始文件使用Peaks Studio10.6检索目标蛋白数据库，检索参数如下：固定修饰(Fixed  modifications)：Carbamidomethyl(C)；可变修饰(Variable modifications)：Oxidation(M)，Acetyl(Peptide N‑term)；酶(Enzyme)：None；数据库(Database)：Phyllostachys edulis；遗漏酶切位点(Maximum Missed Cleavages)：2；一级质谱误差(Peptide Mass Tolerance)：20ppm；二级质谱误差(FragmentMass Tolerance)：
0.02Da。

[0079] 4.ACE抑制肽的筛选

[0080] (1)LC‑MS/MS检测后，将原始下载数据直接提交到Peaks Studio10.6进行目标蛋白数据库检索，过滤掉常见污染蛋白及与之匹配的肽段，得到每个样品鉴定到的肽段序列结果。通过Peaks Studio10.6进行目标蛋白数据库检索和多肽组学分析，获得发酵后新产生的多肽序列。

[0081] 肽组学鉴定上述竹笋发酵前后共获得65条肽，65条肽中包括发酵前的35条肽，发酵后53条多肽，其中，发酵前后共有的肽有23条。

[0082] 其中，氨基酸序列如SEQ ID NO.1(SIHKVPL)所示的竹多肽的结构鉴定图如图3所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.2(EEHPVLL)所示的竹多肽的结构鉴定图如图4所示。其中，图3中的横坐标轴表示m/z，纵坐标轴表示％intensity，峰图上的数字为792.948；图4中的横坐标轴表示m/z，纵坐标轴表示％intensity，峰图上的数字从左到右依次为835.970、857.976。为使图3和图4便于清晰查看，提供了图11和图12，其中图11为图3的放大图；图12为图4的放大图。

[0083] 分析氨基酸结构，利用多肽活性预测工具初步筛选ACE抑制肽。

[0084] (2)从RCSB PDB数据库获取ACE对应的晶体结构(PDB ID：1O8A)。对获得的蛋白质晶体采用薛定谔软件的Protein PreparationWizard模块分别进行protein preprocess，regenerate states of native ligand，H‑bond assignment optimization，protein energy minimization，and remove waters的处理。

[0085] (3)采用Build Biopolymer from Sequence模块中的Peptide选项，对初步筛选的ACE抑制肽进行建模，并采用Protein PreparationWizard模块对多肽进行预处理。

[0086] (4)先采用薛定谔中的SiteMap模块，预测最佳的结合位点后，然后采用薛定谔中的Receptor Grid Generation模块，设置最合适的Enclosing box将预测出来的结合位点完美包裹，并在此基础上获取只适用于多肽对接的蛋白质活性位点。

[0087] (5)采用Peptide Docking模块，将处理好的多肽分别与对应蛋白进行多肽‑蛋白对接，并设置多肽对接Pose为10个，对接得分越低代表是该多肽与蛋白质的结合可能性越高。

[0088] (6)将多肽与对应蛋白的活性位点进行MM‑GBSA计算分析，MM‑GBSA dG Bind可以近似代表配体与蛋白质的结合自由能情况，结合自由能越低，表示配体与蛋白的结合稳定性越高。

[0089] (7)将对接得分及结合自由能最低的多肽‑蛋白互作复合物不同链用不同颜色进行标注，并增加Surface，展示3D立体视图。此外，采用Protein InteractionAnalysis模块确定多肽‑蛋白结合的具体区段。

[0090] 综合分析对接与MM‑GBSA结果如图5～10所示。图5为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的竹多肽与ACE的分子对接最佳构象3D视图；图6为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的竹多肽与ACE的分子对接局部图；图7为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的竹多肽与ACE的分子对接相互作用2D图；图8为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽与ACE的分子对接最佳构象3D视图；图9为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽与ACE的分子对接局部图；图10为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽与ACE的分子对接相互作用2D图。

[0091] 氨基酸序列如SIHKVPL(SEQ ID NO.1)所示的竹多肽与ACE对接得分为‑9.619，MM‑GBSA结果为‑26.96kcal/mol，对接得分很低，结合自由能较低，表明SIHKVPL与ACE结合较稳定。

[0092] 氨基酸序列如EEHPVLL(SEQ ID NO.2)所示的竹多肽与ACE对接得分为‑5.115，MM‑GBSA结果为‑21.77kcal/mol，结合自由能与对接得分均较低，表明EEHPVLL与ACE结合较稳定。

[0093] 由图5～10可得，氨基酸序列如SEQ ID NO.1(SIHKVPL)所示的竹多肽深入到ACE的活性口袋的内部，与ACE的残基ASP358、TYR523、ALA354、GLU384、HIE513、GLN281各形成一个氢键，与残基ALA356形成两个氢键。

[0094] 氨基酸序列如SEQ ID NO.2(EEHPVLL)所示的竹多肽深入到ACE的活性口袋的内部，与ACE的残基ALA354、TYR523、HIP383、SER516、ARG124、TYR62各形成一个氢键，与残基ALA356形成两个氢键，与残基TRP357形成一个π‑π键，与残基ARG522形成一个氢键和一个盐桥，与残基VAL518形成范德华力。

[0095] 实施例2

[0096] 竹笋源降压肽的ACE抑制率

[0097] 对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的竹多肽和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽分别进行按常规方法进行固相合成。

[0098] 固相合成为常规方法，具体合成顺序：从序列C端到N端，步骤如下：a.称取n当量树脂放入反应器，加入DCM(二氯甲烷)溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入序列中第一个氨基酸2n当量，加2n当量的DIEA，适量的DMF和DCM(适量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜)，DIEA(二异丙基乙胺)、DMF(二甲基甲酰胺)、DCM，氮气鼓泡反应60min。然后加入约5n当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、MeOH洗净；b.往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为2n当量)，2n当量HBTU(苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸盐)及DIEA，N2鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除Fmoc(9‑芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测；c.依步骤b的方式依次加入序列中不同的氨基酸并进行各种修饰；d.将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量(切割液和树脂大约以10mL/g的比例)的切割液(组成是95％TFA，2％乙二硫醇，2％三异丙基硅烷，1％水)，振荡，滤掉树脂；e.得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列的粗产物；

[0099] 多肽纯化：将上述得到的粗产物用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度。

[0100] 多肽冻干：纯化好的液体放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。

[0101] 多肽检测：合成好的多肽经RP‑HPLC和LC/MS鉴定纯度及分子量，确定得到的多肽纯度＞95％。

[0102] N‑(3‑(2‑呋喃酰)丙烯酰‑苯氨酰‑谷氨酰‑谷氨酸(FAPGG，λmax＝340nm，ε＝‑1 ‑12270M cm ，分子量399.40)可以被ACE酶解成N‑[3‑(呋喃)丙稀醇酰]‑2‑苯丙氨酸(FAP，λ‑1 ‑1
max＝340nm，ε＝1512M cm )和双甘氨肽(GG，在340nm处无吸收)，因此可以作为ACE的模拟底物。1mM FAPGG完全转化成FAP和GG的吸光值为0.758，因此可根据340nm吸光度的变化值计算抑制率。

[0103] 按说明采用血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂活性测定试剂盒(Solarbio BC5575)检测样品对血管紧张素转换酶(ACE)的抑制活性。同时以卡托普利作为阳性对照。

[0104] 氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的竹多肽和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽和阳性对照组对ACE的抑制活性如表1所示。

[0105] 表1两种多肽对ACE的抑制活性

[0106]

[0107] 从表1可知，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的竹多肽和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽对ACE的IC50分别为11.4783μM、11.7883μM。说明其具有较好的ACE抑制活性。

[0108] 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。