[0001] 本发明涉及用于降低编码FUS RNA结合蛋白(也称为肉瘤融合蛋白(Fused in Sarcoma))的FUS基因的表达的反义寡核苷酸(AON)。本发明提供了通过施用AON和包含靶向
FUS的AON的治疗组合物来治疗、预防或改善与FUS致病性变异、FUS蛋白病(FUS 
proteinopathy)或FUS高表达相关的疾病影响的方法。FUS基因中的致病性变异发现于肌萎
缩侧索硬化症(ALS)患者亚群中以及额颞叶变性(FTLD)的罕见病例中。本发明可用于治疗、预防或改善FUS‑ALS或FUS‑FTLD或散发性ALS的影响。

[0002] 以下对背景技术的讨论仅旨在促进对本发明的理解。该讨论并非承认或认可所提及的任何材料在本申请的优先权日时是或曾经是公知常识的一部分。

[0003] FUS

[0004] FUS编码一种普遍表达的526个氨基酸的蛋白质，属于RNA结合蛋白的FET家族。FUS在正常生理条件下主要定位于细胞核，但会跨越至细胞质，在核质运输中起作用。FUS在多种细胞过程中发挥作用，包括转录、前体mRNA剪接、RNA运输和翻译调节。FUS还参与DNA修复机制，包括DNA双链断裂修复期间的同源重组和非同源末端连接。另外，FUS在旁斑
(paraspeckle)和应激颗粒的形成中发挥作用，提供针对多种类型应激的细胞防御。

[0005] 多达10％的肌萎缩侧索硬化症(ALS)患病个体具有至少一名其他患病家庭成员，并被定义为患有家族性ALS(fALS)；已经发现几乎所有这些病例都以常染色体显性方式遗
传。其余90‑95％的ALS病例发生在没有家族病史的人群中；这些个体被认为患有散发性ALS(sALS)。FUS中的致病性变异是造成大约5％的fALS病例和少于1％的sALS病例的原因。

[0006] 目前已在ALS患者中鉴定了超过50种常染色体显性FUS变体。大多数是错义突变，但在极少数的情况下，插入、缺失、剪接和无义突变也有报道。许多致病性变体聚集在核定位信号内，并导致FUS重新分布到细胞质中。其他发生于富甘氨酸和精氨酸区域、朊病毒样结构域和3′UTR中。某些区域内的变体似乎增加了蛋白质形成固体聚集体的倾向，这指向了在FUS相关ALS中起作用的多种病理机制。

[0007] FUS是自动调节的(autoregulated)，其中一种机制涉及蛋白与其自身前体mRNA结合以抑制外显子7的表达。外显子7跳跃剪接变体中的移码会导致一个提前终止密码子，从
而转录本遭受无义介导的衰变。在FUS‑ALS和FUS‑额颞叶变性(FTLD)中，FUS错误定位至细胞质可能损害自动调节，这可能导致过度表达。有一些证据表明，FUS胞质错误定位也可能发生在没有FUS突变的ALS病例中。

[0008] 受损的细胞功能也可能是致病性FUS变体的直接结果，据报道这些变体会引起剪接缺陷、DNA损伤并损害FUS的自动调节。另外，有迹象表明FUS‑ALS中存在疾病传播的机制，可能是由其朊病毒样蛋白结构域介导的。

[0009] 关于FUS‑ALS中功能丧失或功能获得机制引起疾病的程度的争论仍在继续。FUS功能丧失理论假设FUS的病理性细胞质重新分布使其不能在细胞核中执行其功能。来自小鼠
模型的证据表明FUS的丢失不足以引起ALS。然而，当使用果蝇Fus敲低模型时，研究结果是矛盾的，其中在FUS直系同源物Cabeza敲低后，出现了神经元变性和运动缺陷。

[0010] 有强有力的证据表明，功能获得机制在FUS‑ALS中起作用。据报道，过表达野生型人FUS的转基因小鼠模型出现了运动神经变性的侵袭性表型和细胞质FUS积累的证据。关于毒性是否主要由FUS聚集体直接介导，还是通过FUS重新分布后细胞质中可溶性FUS的增加
介导，仍存在争论。细胞质FUS分布也会改变应激颗粒动力学。FUS的聚集倾向并非纯粹的病理性，而是对正常细胞功能很重要。有人提出FUS聚集可能是一种补偿机制，保护细胞免受可溶性细胞质FUS中潜在毒性增加的影响。

[0011] FUS变体与早发性和青少年ALS相关，其表现为持续进行性肌肉萎缩和无力，在大多数情况下，对呼吸肌的影响将疾病发作后的生存期限制在3年以内。目前的治疗方案是基于症状管理和呼吸支持，唯一批准的药物仅能延长几个月的生存期或仅在某些患者中提供
适度的益处。目前缺乏减缓或暂停疾病进展的有效治疗。

[0012] 由于FUS聚集、过量表达或细胞质错误定位引起的毒性功能获得的有力的证据，FUS的敲低可能在治疗患有致病性FUS突变、FUS高表达或FUS蛋白病的患者中具有治疗潜
力。几名患者在同情用药(compassionate use)的基础上接受了FUS靶向AON的研究，该治疗(ION363)目前正在进行3期临床试验(NCT04768972)。本发明包括利用与NCT04768972中试
验的AON不同的作用机制和不同的化学组成的AON。

[0013] FUS蛋白病

[0014] 降低FUS表达可应用于预防和治疗与FUS蛋白病(或FUS高表达)相关的疾病，包括FUS‑ALS和FUS‑FTLD以及散发性ALS。降低FUS表达还可以应用于预防和治疗具有致病性FUS突变的患者的其他神经系统病症，包括：额颞叶痴呆。

[0015] 降低FUS表达也可能应用于预防和治疗与FUS蛋白病(或FUS高表达)相关的其他神经系统病症，包括慢性创伤性脑病(CTE)和多聚谷氨酰胺重复障碍，包括亨廷顿舞蹈病
(HD)、1型脊髓小脑性共济失调(SCA1)、3型脊髓小脑性共济失调(SCA3)和神经元核内包涵
体疾病(NIIBD)。降低FUS表达也可能应用于预防和治疗其他神经系统病症或肌肉疾病，包
括额颞叶痴呆(FTD)、阿尔茨海默氏病(AD)、特发性震颤(ET)、帕金森氏病(PD)、包涵体肌病(IBMY)、包涵体肌炎(IBM)、皮质基底节变性(CBD)和核上性麻痹(PSP)。

[0016] 尽管进行了大量的研究，但是仍然需要开发和鉴定用于神经系统病症如ALS的有效治疗。

[0017] 正是在这种背景下开发了本发明。具体而言，本发明旨在提供一种改善与FUS蛋白病或FUS高表达相关的疾病中FUS蛋白病的方法。

[0042] 本发明提供了一种预防或治疗方法，用于使用AON疗法改善或减缓与FUS蛋白病或FUS高表达相关的疾病(包括具有致病性FUS突变或聚集的那些疾病，包括ALS、FTLD、CTE、HD、SCA1、SCA3和NIIBD)症状的进一步进展。更具体地，本发明提供了靶向编码FUS前体mRNA的核酸分子的分离或纯化的AON，其中所述AON具有如下核碱基序列：(a)选自包含SEQ ID 
NO:1至SEQ ID NO:30(包括SEQ ID NO:30)或其变体的列表，或(b)与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:30(包括SEQ ID NO:30)也与之结合的靶FUS前体mRNA或其变体中的至少1个或多个连续
核碱基互补的序列，以及(c)其中AON抑制人FUS的表达。

[0043] 为了方便起见，以下部分一般性概括了本文所用术语的各种含义。在此讨论之后，讨论了关于本发明的组合物、药物的用途和方法的一般方面，随后通过具体实施例来说明本发明的各种实施方案的特性及其使用方法。
1.定义

[0044] 下面提供了在说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语和短语的含义。如果在本领域中术语的使用与本文提供的其定义之间存在明显差异，则以说明书中提供的
定义为准。

[0045] 本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，本文所述的发明容易于变化和修改。本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指
示的所有步骤、特征、制剂和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两个或多个的任何和所有组合。

[0046] 本文中引用的每篇文件、参考文献、专利申请或专利均明确地通过引用整体并入本文，这意味着读者应当将其作为本文的一部分阅读和考虑。本文中引用的文件、参考文
献、专利申请或专利未在本文中重复仅仅是出于简明的原因。然而，所引用的材料或包含在该材料中的信息都不应被理解为是公知常识。

[0047] 本文中提到的任何产品或本文中引用的任何文件中提及的任何产品的制造商说明书、描述、产品规格和产品说明书均以引用的方式并入本文中，并可用于实施本发明。

[0048] 本发明的范围不限于本文所述的任何具体实施方案。这些实施方案仅用于例证的目的。如本文所述，功能等同的产品、制剂和方法显然在本发明的范围内。

[0049] 除了操作实施例或另有说明的情况外，本文中使用的表示成分数量或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当与百分比结合使用时，术语“约”可以指±1％。

[0050] 本文所述的发明可包括一个或多个数值范围(例如，尺寸、浓度等)。数值的范围将被理解为包括该范围内的所有值，包括限定该范围的值，以及与该范围相邻的值，其导致与紧邻限定该范围的边界的值相同或基本上相同的结果。例如，本领域技术人员将理解，范围的上限或下限的10％变化可以是完全合适的，并且被本发明所涵盖。更具体地，范围的上限或下限的变化将是5％或本领域普遍认可的，以较大者为准。

[0051] 在本申请中，除非另外特别说明，单数的使用也包括复数。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用表示“和/或”。此外，使用术语“包括(including)”以及其他形式，例如“包括(includes、included)”不是限制性的。此外，除非另有明确说明，否则术语如“要素”或“组分”涵盖包含一个单元的要素和组分以及包含多于一个亚单元的要素和组分。此外，术语“部分”的使用可以包括部分的一部分或整个部分。

[0052] 在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”或其变体如“包含(comprises或comprising)”将被理解为暗示包括所述的整体或整体的组，但不排除任何其他整体或整体的组。

[0053] 本文所用的术语“施用”是指通过一种方法或途径将组合物置于个体体内，该方法或途径导致组合物至少部分定位在其所需的作用部位，从而产生所需的效果。本文所述的化合物或组合物可通过本领域已知的任何合适途径施用，包括但不限于口服或胃肠外途
径，包括鞘内、静脉内、肌内、皮下、经皮、气道(气雾剂)、肺部、鼻腔、直肠和局部(包括口腔和舌下)施用。

[0054] 本文所用的所选术语的其他定义可在本发明的具体实施方式中找到并适用于全文。除非另有定义，否则本文所用的所有其他科学和技术术语具有与本发明所属领域的普
通技术人员通常理解的相同的含义。

[0055] 现在将参考以下非限制性描述和实施例讨论本发明的特征。2.实施方案

[0056] 本发明的实施方案一般涉及改进的反义化合物及其方法或用途，其被特别设计以抑制FUS的表达，包括野生型FUS和任何致病性变体。FUS错误定位到细胞质与FUS蛋白病或
FUS高表达相关的疾病(包括ALS和FTLD)有关。

[0057] 不受理论束缚，本发明基于这样的理解：抑制患有与致病性FUS突变、FUS高表达或FUS蛋白病相关的疾病的患者的FUS表达，可能会具有减缓症状的进展和/或提高这些患者存活的作用。这是因为FUS致病性变体的表达与许多神经系统疾病(包括ALS和FTLD)相关。
因此，敲低FUS可能在治疗患有致病性FUS突变、FUS高表达或FUS蛋白病(包括ALS和FTLD)的患者中具有治疗潜力。可从该疗法获益的患者可能在FUS基因中存在突变或在FUS蛋白中存
在错误折叠。然而，未表现出FUS突变或错误折叠的患者也可能对抑制FUS基因的治疗有反
应。
A.反义寡核苷酸

[0058] 本发明提供了一种或多种分离或纯化的AON，其靶向编码FUS前体mRNA的核酸分子，其中AON具有选自包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:30(包括SEQ ID NO:30)的列表的核碱
基序列(如下表1所示)，并且其中AON抑制人FUS的表达。优选地，AON是磷酰二胺吗啉代寡聚物。

[0059] 更一般地，本发明提供了分离的或纯化的反义寡核苷酸，其靶向编码FUS前体mRNA的核酸分子，其中AON具有如下的核碱基序列：
a.选自包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:30(包括SEQ ID NO:30)的列表，或
b.与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:30(包括SEQ ID NO:30)也与之结合的靶FUS前体
mRNA中的至少1个或多个连续核碱基互补的序列，以及
c.其中AON抑制人FUS的表达。

[0060] 优选地，AON是磷酰二胺吗啉代寡聚物。

[0061] 表1.AON序列参考点(0)，其设定在5'和3'剪接位点的第一个碱基处；因此，“+”指外显子内的核
苷酸结合，“‑”表示内含子内的核苷酸结合。

[0062] 在本发明的任何AON中，本文提供的序列中的尿嘧啶(U)可被胸腺嘧啶(T)替代。此外，在本发明的任何AON中，本文提供的序列的胸腺嘧啶(T)可被尿嘧啶(U)替代。
表2.引物序列
SEQ ID 引物 序列
35 FUS1F GTACTCAGCGGTGTTGGAAC 
36 FUS 5R GCTTTGCTGCTGTCCACCAT 
37 FUS 6R CCACTACTCATGGAGGATTG 
38 FUS 8R GCTTGAAGTAATCAGCCACAG 
39 FUS 6F CAGTGGTGGCTATGAACCCA 
40 FUS10R GTCAATAGCTGCTTTAGCTG 
41 TBP 2F AGCGCAAGGGTTTCTGGTTT 
42 TBP 3R GGAGTCATGGGGGAGGGATA

[0063] 本发明的某些AON被设计成与人FUS前体mRNA中外显子2、3、4、5、6和7内的合适序列互补。在优选的实施方案中，本发明的AON被设计成与人FUS前体mRNA的外显子7内的合适序列互补并诱导外显子跳跃。最优选地，本发明的AON靶向外显子7。最优选地，AON选自SEQ ID NO:22至27和30。

[0064] 在另一个优选的实施方案中，本发明的AON被设计成与外显子4内的合适序列互补。在一个实施方案中，AON是SEQ ID NO:28。

[0065] 在另一个优选的实施方案中，本发明的AON被设计成与外显子5内的合适序列互补。在一个实施方案中，AON是SEQ ID NO:29。

[0066] 在另一个优选的实施方案中，本发明的AON被设计成与外显子7内的合适序列互补。在一个实施方案中，AON是SEQ ID NO:30。

[0067] 术语“反义寡聚物”和“反义化合物”和“反义寡核苷酸”或“AON”可互换使用，指的是环状亚基的线性序列，每个环状亚基都具有碱基配对部分，通过亚基间键连接，所述亚基间键连接允许碱基配对部分通过沃森‑克里克碱基配对与核酸(通常为RNA)中的靶序列杂交，以在靶序列内形成核酸:寡聚物异源双链体。环状亚基基于核糖或另一种戊糖，或者在优选的实施方案中，基于吗啉代基(参见下文吗啉代寡聚物的描述)。寡聚物可以具有与靶
序列精确或接近的序列互补性；寡聚物末端附近的序列变异通常优于内部的变异。还考虑
了肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和2'‑O‑甲基寡核苷酸，以及本领域已知的其他反义药物。

[0068] 术语“寡核苷酸”包括多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，其中RNA通过转录DNA模板制备或获得。根据本发明，核酸可以作为单链或双链以及线性或共价环状闭合分子存在。

[0069] “分离的”是指材料大体上或基本上不含在其天然状态下通常伴随的成分。例如，本文所用的“分离的多核苷酸”或“分离的寡核苷酸”可以指已经纯化的多核苷酸或从天然存在状态下其侧翼的序列中去除的多核苷酸，例如从基因组中与该片段相邻的序列中去除的DNA片段。术语“分离”当涉及细胞时是指从来源个体(例如，患有多核苷酸重复疾病的个体)纯化细胞(例如，成纤维细胞、淋巴母细胞)。在mRNA或蛋白质的情况下，“分离”是指从来源例如细胞中回收mRNA或蛋白质。

[0070] AON可以说是“针对”或“靶向”与其杂交的靶序列。在某些实施方案中，靶序列包括含有聚腺苷酸化位点的区域和周围区域。靶序列通常是包括mRNA的AUG起始密码子、翻译抑制寡聚物或预加工mRNA的剪接位点、剪接抑制寡聚物(SSO)的区域。剪接位点的靶序列可包括具有位于预加工mRNA中正常剪接受体接点下游1至约25个碱基对处的5'端的mRNA序列。优选的靶序列是预加工mRNA的任何区域，其包括剪接位点或完全包含在外显子编码序列内
或跨越剪接受体或供体位点。当寡聚物以上述方式靶向靶标的核酸时，更通常地说是“靶
向”生物学相关靶标，例如蛋白质、病毒或细菌。

[0071] 如本文所用，“足够长度”或“足够序列互补性”是指与靶FUS前体mRNA中的至少1个、更通常1‑30个连续核碱基互补的AON。在一些实施方案中，足够长度的反义物包括靶FUS前体mRNA中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续核碱基。在其他实施方案中，足够长度的反义物包括靶FUS前体mRNA中的至少16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核碱基。优选地，足够长度的寡核苷酸长度为约10至约50个核苷酸，包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、
38、39和40个或更多个核苷酸的寡核苷酸。在一个实施方案中，足够长度的寡核苷酸的长度为10至约30个核苷酸。在另外的实施方案中，足够长度的寡核苷酸的长度为15至约25个核
苷酸。在另外的实施方案中，足够长度的寡核苷酸的长度为20至30个或20至50个核苷酸。在另外的实施方案中，足够长度的寡核苷酸的长度为22至28、25至28、24至29或25至30个核苷酸。

[0072] 在某些实施方案中，AON与靶RNA具有足够的序列互补性，从而以有效的方式阻断靶RNA(例如前体mRNA)的区域。在一些实施方案中，FUS前体mRNA的这种阻断用于诱导外显
子跳跃。在一些实施方案中，靶RNA是靶前体mRNA(例如，FUS基因前体mRNA)。

[0073] 如本文所用，术语“互补的”或“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列5'‑A‑G‑T‑3'与序列"'‑T‑C‑A‑5'互补。互补性可以是“部分的”，其中根据碱基配对规则仅匹配一些核酸的碱基。或者在核酸之间可以存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。因此，本文所用的“互补”序列是指与靶RNA或DNA序列具有一定互补性的寡核苷酸序列。

[0074] 为了本发明的目的，核苷酸序列的互补序列是能够与所示核苷酸序列形成双链DNA或RNA分子的核苷酸序列，并且其可以通过根据Chargaff规则(A<>T；G<>C；A<>U)用它们的互补核苷酸替换所示的核苷酸并按照5'到3'方向读取(即，与所表示的核苷酸序列相反
的方向)从所示的核苷酸序列中得出。这还包括DNA/RNA的合成类似物(例如，2’F‑ANA寡聚物)。

[0075] 术语“同源性”或“同一性”是指互补性的程度。在寡核苷酸序列和靶RNA或DNA的互补序列之间可以存在部分同源性或完全序列同一性。部分相同的序列是至少部分地与靶RNA或DNA杂交的寡核苷酸，导致部分异源双链体的形成，并导致靶RNA或DNA的部分或全部
降解。完全相同的序列是与靶RNA或DNA完全杂交的寡核苷酸，导致完全异源双链体的形成，并导致靶RNA或DNA部分或全部降解。

[0076] 在某些实施方案中，AON可以与靶序列100％互补，或可以包括错配，例如以适应变体，只要在寡核苷酸和靶序列之间形成的异源双链体足够稳定以经受住细胞核酸酶的作用和可能在体内发生的其他降解模式。因此，某些寡核苷酸可能具有约或至少约70％的序列
互补性，例如，寡核苷酸和靶序列之间的70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列互补性。

[0077] 错配(如果存在)通常对杂交双链体的末端区域的不稳定性小于中间区域。根据双链体稳定性的公知原理，允许的错配数目将取决于寡核苷酸的长度、双链体中G:C碱基对的百分比和双链体中错配的位置。尽管这种AON不必100％互补于靶序列，但它能有效地稳定
和特异性地结合靶序列，从而调节裂解因子与靶前体RNA的结合。

[0078] AON和靶序列之间形成的双链体的稳定性是结合Tm和双链体对细胞酶促裂解的易感性的函数。寡核苷酸相对于互补序列RNA的Tm可通过常规方法测定，如描述于Hames等人，Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,(1985),107‑108或描述于Miyada C.G.和
Wallace R.B.,(1987),Methods Enzymol.154,94‑107中的方法。在某些实施方案中，AON可以具有相对于互补序列RNA的高于体温的结合Tm，并且优选地高于约45℃或50℃。也包括
60‑80℃或更高范围的Tm。

[0079] 变体的其他示例包括在SEQ ID NOS:1‑30中的任意一个的全长上具有约或至少约70％(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性或同源性)序列同一性或同源性的AON。

[0080] 在优选的实施方案中，本发明的AON被设计成与人FUS前体mRNA的外显子4、5或7内的合适序列互补，并诱导外显子跳跃。

[0081] 在另一个优选的实施方案中，本发明的AON被设计成与外显子7内的合适序列互补。

[0082] 优选地，提供了能够结合选定的靶位点以诱导FUS基因转录本或其部分中的外显子跳跃的AON。在一个方面，AON诱导FUS基因转录本中外显子2、3、4、5、6或7的跳跃。最优选地，AON诱导外显子7的跳跃。

[0083] AON优选选自表1中提供的那些。例如，本发明中使用的AON选自包含SEQ ID NO:1‑30的列表。最优选地，AON选自包含SEQ ID NO:22至27和30的列表。
B.使用方法

[0084] 本发明还提供了抑制FUS表达的方法，该方法包括步骤：(a)提供一种或多种如本文所述的AON，以及
(b)使寡聚物与靶核酸位点结合。

[0085] 更具体地，AON可以选自表1中列出的那些AON。所述序列优选地选自SEQ ID NO:1‑30中的任意一个或多个及其组合或混合物。这包括在严格杂交条件下能与这些序列杂交的
序列、与其互补的序列、含有修饰碱基、修饰骨架以及其功能性截短或延伸的序列，这些序列具有或调节FUS基因转录本中的RNA加工活性。

[0086] 优选地，本发明中使用的AON选自包含SEQ ID NO:22至27和30的列表。最优选地，AON选自包含SEQ ID NO:30的列表。

[0087] 在一个优选的实施方案中，本方法中使用的AON诱导FUS前体mRNA的可变剪接。在一个方面，AON通过诱导FUS前体mRNA中的外显子跳跃来诱导可变剪接。优选地，AON诱导外显子2、3、4、5、6或7的跳跃。最优选地，AON诱导外显子7的跳跃。在另一个实施方案中，AON可以通过一些其他机制降低FUS的表达。

[0088] 一种组合(1)旨在降低FUS表达的AON(SEQ ID NO:1‑30)的治疗策略将降低细胞质FUS过表达的影响。在一个方面，本发明旨在提供一种改善患有与FUS蛋白病或FUS高表达相关的疾病的个体中FUS蛋白病或FUS高表达的方法。
靶序列和选择性杂交

[0089] 当每个分子中足够数量的相应位置被可彼此氢键连接的核苷酸占据时，寡聚物与DNA、cDNA或RNA彼此互补。因此，“特异性杂交”和“互补”是用于表示足够程度的互补性或配对的术语，使得寡聚物和DNA、cDNA或RNA靶标之间发生稳定和特异性的结合。本领域中应理解，AON的序列不需要与其靶序列的序列100％互补才能进行特异性杂交。当化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA产物的正常功能时，AON是可特异性杂交的，并且在需要
特异性结合的条件下(即在体内测定或治疗的情况下在生理条件下，以及在体外测定的情
况下在进行测定的条件下)，具有足够的互补性以避免AON与非靶序列发生非特异性结合。

[0090] 选择性杂交可以在低、中或高严格条件下进行，但优选在高严格条件下进行。本领域技术人员将认识到，除了碱基组成、互补链的长度和杂交核酸之间的核苷酸碱基错配的数目之外，杂交的严格性还将受诸如盐浓度、温度或有机溶剂的条件影响。严格的温度条件一般包括超过30℃的温度、通常超过37℃的温度、优选超过45℃的温、优选至少50℃，通常
60℃‑80℃或更高。严格的盐条件通常低于1000mM、通常低于500mM、优选低于200mM。然而，参数的组合比任何单个参数的测量重要得多。严格的杂交条件的示例是65℃和0.1x SSC
(1x SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH 7.0)。因此，本发明的AON可以包括与表1或表2中提供的序列选择性杂交的寡聚物。

[0091] 在给定的离子强度和pH下，Tm是50％的靶序列与互补多核苷酸杂交的温度。这种杂交可能发生在AON与靶序列“接近”或“基本”互补的情况下，也可能发生在AON与靶序列完全互补的情况下。

[0092] 通常，当在至少约14个核苷酸的区段(stretch)上与反义寡聚物的核苷酸有至少约55％同一性、优选至少约65％、更优选至少约75％和最优选至少约90％、95％、98％或
99％同一性时，将发生选择性杂交。如所述，同源性比较的长度可以是更长的区段，并且在某些实施方案中，通常是至少约9个核苷酸的区段，通常至少约12个核苷酸，更通常至少约
20个，通常至少约21、22、23或24个核苷酸，至少约25、26、27或28个核苷酸，至少约29、30、31或32个核苷酸，至少约36或更多个核苷酸。

[0093] 因此，在一些实施方案中，本发明的AON序列优选与本文序列表中所示序列具有至少75％、更优选至少85％、更优选至少86％、87％、88％、89％或90％同源性。更优选地，具有至少91％、92％、93％、94％或95％，更优选地至少96％、97％、98％或99％的同源性。通常，反义寡聚物的长度越短，获得选择性杂交所需的同源性越大。因此，当本发明的AON由少于约30个核苷酸组成时，与本文序列表中列出的AON相比，优选同一性百分比大于75％，优选大于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％。核苷酸同源性比较可以通过序列比较程序进行，例如GCG Wisconsin Bestfit程序或GAP(Deveraux等人，1984，Nucleic Acids Research 12,387‑395)。这样，可以通过在比对中插入空位来比较与本文引用的长度相似或基本上不同的序列，这种空位可以通过例如
GAP使用的比较算法来确定。

[0094] 本发明的AON可以具有同源性降低的区域以及与靶序列精确同源的区域。寡聚物不必具有其全长的精确同源性。例如，寡聚物可以具有与靶序列相同的至少4或5个碱基的
连续区段，优选与靶序列相同的至少6或7个碱基的连续区段，更优选与靶序列相同的至少8或9个碱基的连续区段。寡聚物可以具有与靶序列相同的至少10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25或26个碱基的区段。寡聚物序列的剩余区段可以间歇地与靶序列相同；例如，剩余序列可以具有相同的碱基，随后是不相同的碱基，随后是相同的碱基。或者(或同样)，寡聚物序列可具有几个相同序列的区段(例如3、4、5或6个碱基)，其间散布着不完全同源的区段。这样的序列错配优选没有或几乎没有裂解修饰活性的损失。
生理反应

[0095] 在一个方面，本发明的方法诱导个体的生理反应。优选地，所述方法降低FUS的表达。

[0096] 术语“调节(以及其各种词性)”包括将一个或多个可计量参数“增加”或“减少”任选地限定的和/或统计学上显著的量。术语“增加(以及其各种词性)”、“增强(以及其各种词性)”或“刺激(以及其各种词性)”通常是指相对于无AON或对照化合物引起的反应，一种或多种AON或组合物在细胞或个体中产生或引起更大的生理反应(即下游效应)的能力。

[0097] “增强(以及其各种词性)”或“增加(以及其各种词性)”或“刺激(以及其各种词性)”通常是指与无反义化合物或对照化合物引起的反应相比，一种或多种反义化合物或组合物在细胞或个体中产生或引起更大的生理反应(即下游效应)的能力。“增加的”或“增强的”量通常是“统计学上显著的”量，并且可以包括比无反义化合物(不存在试剂)或对照化合物产生的量增加1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多倍(例如500、
1000倍)(包括在1之间和1以上的所有整数和小数点)，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。

[0098] 术语“减少(以及其各种词性”通常是指相对于无AON或对照化合物引起的反应，一种或多种AON或组合物在细胞或个体中产生或引起的降低的生理反应(即下游效应)的能力。术语“降低”或“抑制”通常可以涉及本发明的一种或多种反义化合物“减少”相关的生理或细胞反应(例如本文所述的疾病或病症的症状)的能力，如根据诊断领域的常规技术所测
量的。相关的生理或细胞反应(体内或体外)对本领域技术人员来说是显而易见的，并且可
以包括FUS相关病症的症状或病理的减轻。与无反义化合物或对照组合物产生的反应相比，反应中的“减少”可以是统计学上显著的，并且可以包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、
8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、
35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的减少，包括其间的所有整数。

[0099] 相关的生理或细胞反应(体内或体外)对本领域技术人员是显而易见的，并且可以包括FUS表达量的减少。“增加的”或“增强的”量通常是统计学上显著的量，并且可以包括比无AON(不存在试剂)或对照化合物产生的量增加1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、
40、50或更多倍(例如500、1000倍)(包括在1之间和1以上的所有整数和小数点，例如1.5、
1.6、1.7、1.8)。术语“降低”或“抑制”通常可以涉及一种或多种AON或组合物“减少”相关的生理或细胞反应(例如本文所述的疾病或病症的症状)的能力，如根据诊断领域的常规技术
所测量的。相关的生理或细胞反应(体内或体外)对本领域技术人员是显而易见的，可以包
括与FUS蛋白病或FUS高表达相关的疾病如ALS或FTLD的症状或病理的减轻。与无AON或对照
组合物产生的反应相比，反应中的“减少”可以是统计学上显著的，并且可以包括1％、2％、
3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、
19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％或100％的减少，包括其间的所有整数。
修饰的AON

[0100] 在一些实施方案中，AON具有天然存在的核酸分子的化学组成，即AON不包括修饰的或取代的碱基、糖或亚基间键。

[0101] 在优选的实施方案中，本发明的AON是非天然存在的核酸分子，或“寡核苷酸类似物”。例如，非天然存在的核酸可以包括一个或多个非天然碱基、糖和/或亚基间键，例如相对于在天然存在的核酸分子中发现的碱基、糖和/或键已经被修饰或取代的碱基、糖和/或
键。下面描述示例性修饰。在一些实施方案中，非天然存在的核酸包括多于一种类型的修
饰，例如糖和碱基修饰、糖和键修饰、碱基和键修饰或碱基、糖和键修饰。例如，在一些实施方案中，AON含有非天然(例如，修饰或取代)的碱基。在一些实施方案中，AON含有非天然(例如，修饰或取代)的糖。在一些实施方案中，AON含有非天然(例如，修饰或取代)亚基间键。在一些实施方案中，AON含有一种以上类型的修饰或取代，例如非天然碱基和/或非天然糖、
和/或非天然亚基间键。

[0102] 因此，包括非天然存在的AON，其具有(i)修饰的骨架结构，例如不同于天然存在的寡核苷酸和多核苷酸中发现的标准磷酸二酯键的骨架，和/或(ii)修饰的糖部分，例如吗啉代部分而不是核糖或脱氧核糖部分。寡核苷酸类似物支持能够通过沃森‑克里克碱基配对与标准多核苷酸碱基氢键键合的碱基，其中类似物骨架以允许寡核苷酸类似物分子与标准
多核苷酸(例如单链RNA或单链DNA)中的碱基之间以序列特异性方式进行这种氢键键合的
方式提供碱基。优选的类似物是具有基本上不带电荷的含磷骨架的那些类似物。

[0103] 一种用于产生AON的方法是甲基化2'羟基核糖位置并掺入硫代磷酸酯骨架产生了表面上类似于RNA但对核酸酶降解更具抗性的分子，尽管本发明的领域的技术人员将知道
可用于本发明的目的其他形式的合适骨架。

[0104] 为了避免在与反义寡聚物形成双链体期间前体mRNA的降解，可以对该方法中使用的AON进行调整，以尽量减少或防止内源性核糖核酸酶(RNase)H的裂解。可以根据已知技术制备不激活RNase H的反义分子(参见，例如，美国专利号5,149,797)。这种反义分子可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列，仅包含在空间上阻碍或阻止核糖核酸酶H与包含该寡
核苷酸作为其一个成员的双链体分子的结合的任何结构修饰，该结构修饰基本上不阻碍或
破坏双链体的形成。因为参与双链体形成的寡核苷酸部分与参与核糖核酸酶H结合的寡核
苷酸部分有很大的不同，所以可以获得许多不激活核糖核酸酶H的反义分子。这种特性是高度优选的，因为用未甲基化的寡聚物处理RNA(无论是胞内的还是含有核糖核酸酶H的粗提
取物中)都会导致前体mRNA:AON双链体的降解。能够绕过或不诱导此类降解的任何形式的
修饰的AON均可用于本方法中。核酸酶抗性可以通过修饰本发明的AON来实现，使得其包含
部分不饱和的脂肪族烃链和一个或多个极性或带电基团，包括羧酸基团、酯基团和醇基。

[0105] 当与RNA双链化(duplexed)时不被细胞核糖核酸酶H裂解的AON的一个示例是2′‑O‑甲基衍生物。这种2′‑O‑甲基‑寡核糖核苷酸在细胞环境和动物组织中是稳定的，它们与RNA的双链体比它们的核糖或脱氧核糖对应物具有更高的Tm值。或者，本发明的核酸酶抗性AON可以具有至少一个最后3'‑末端氟化的核苷酸。或者，本发明的核酸酶抗性AON具有在至少两个最后3'‑末端核苷酸碱基之间连接的硫代磷酸酯键，优选具有在最后四个3'‑末端核苷酸碱基之间连接的硫代磷酸酯键。

[0106] 减少RNA裂解也可通过替代性寡核苷酸化学实现(参见，例如，美国专利号5,149,797)。例如，AON可以选自包括以下的列表：氨基磷酸酯或磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)；
PMO‑X；PPMO；肽核酸(PNA)；硫代磷酰胺酯吗啉代寡聚物(TMO)；锁核酸(LNA)和衍生物，包括α‑L‑LNA；2'‑氨基LNA；4'‑甲基LNA和4'‑O‑甲基LNA；亚乙基桥连核酸(ENA)及其衍生物；硫代磷酸酯寡聚物；三环‑DNA寡聚物(tcDNA)；三环硫代磷酸酯寡聚物；2'O‑甲基‑修饰的寡聚物(2'‑Ome)；2'‑O‑甲氧基乙基(2'‑MOE)；2'‑氟(2′‑fluoro)，2'‑氟阿拉伯(2′‑fluroarabino)(FANA)；未锁定核酸(UNA)；己糖醇核酸(HNA)；环己烯基核酸(CeNA)；2'‑氨基(2'‑NH2)；2'‑O‑亚乙基胺或上述物质的任意组合作为混合物或作为gapmer。PMO的关键益处是增加的安全特性(safety profile)。它们的中性电荷使它们不易受蛋白质相互作用
的影响，从而降低血小板活化和免疫活化。这也减少了核酸酶的降解。它们还已经在DMD患者中安全使用超过5年。

[0107] 在一个方面，本发明的修饰AON可以与肽缀合。优选地，AON是PPMO，即通过酰胺、马来酰亚胺或点击化学(优选使用无铜点击化学，例如通过环辛炔连接)与肽部分化学缀合的PMO寡核苷酸，并且包括合适的接头，例如可裂解的或pH敏感的接头。肽部分可以通过3'或
5'末端连接。最优选地，肽部分是能够提高AON穿透细胞并到达细胞核的能力的肽。例如，肽部分可以是富含精氨酸的肽、阳离子肽和/或选自来源于生物多样性微生物基因组的肽文
库的肽(Hoffman等人，Sci Rep,8,1,12538)。所述肽可以含有或不含非天然氨基酸和/或化学修饰的氨基酸。

[0108] 细胞穿透肽已被添加到磷酰二胺吗啉代寡聚物中以增强细胞摄取和核定位。不同的细胞穿透肽已显示影响摄取效率和靶组织特异性，如Jearawiriyapaisarn等人，(2008),Mol.Ther.,16(9),1624–1629所显示的。术语“细胞穿透肽”和“CPP”可互换使用，指阳离子细胞穿透肽，也称为转运肽、运送载体肽或肽转导结构域。如本文所示，所述肽具有在给定细胞培养群体的100％细胞内诱导细胞穿透的能力，并且在全身施用后允许体内多种组织
内的大分子易位。所述肽还能够在局部递送至组织或器官后增强细胞摄取。

[0109] 为了进一步提高递送效率，上述修饰的核苷酸通常与脂肪酸/脂质/胆固醇/氨基酸/碳水化合物/多糖/纳米颗粒等缀合至糖或核碱基部分。这些缀合的核苷酸衍生物也可
以用于构建AON以诱导外显子跳跃。反义寡聚物诱导的人FUS基因转录本的可变剪接可以使
用硫代磷酸酯骨架上的寡核糖核苷酸、PNA、2'‑Ome或2'‑MOE修饰的碱基。尽管2'‑Ome AON用于寡聚物设计，但由于当作为阳离子脂质复合物递送时它们在体外有效摄取，这些化合
物易受核酸酶降解影响，并且被认为不是体内或临床应用的理想选择。当使用替代化学方
法来产生本发明的AON时，本文提供的序列的尿嘧啶(U)可以被胸腺嘧啶(T)替代。

[0110] 例如，这类反义分子可以是寡核苷酸，其中至少一个或全部核苷酸间桥连的磷酸酯残基是修饰的磷酸酯，例如甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯(methyl phosphorothioate)、磷酰吗啉酯(phosphoromorpholidate)、磷酰哌嗪酯(phosphoropiperazidate)和氨基磷酸
酯(phosphor amidate)。例如，核苷酸间桥连磷酸酯残基中的每隔一个可以如描述的那样
进行修饰。在另一个非限制性示例中，这类反义分子是其中至少一个或全部核苷酸含有2'
低级烷基部分(例如，Ci‑C4、直链或支链的、饱和或不饱和的烷基，如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1‑丙烯基、2‑丙烯基和异丙基)的分子。例如，核苷酸中的每隔一个可以如描述的那样进行修饰。

[0111] 可用于本发明的AON的具体示例包括含有修饰的骨架或非天然亚基间键的寡核苷酸。

[0112] 具有修饰的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的寡核苷酸和在骨架中不具有磷原子的寡核苷酸。在其核苷间骨架中不具有磷原子的修饰的寡核苷酸也可被认为是
寡核苷。

[0113] 在其他反义分子中，核苷酸单位的糖和核苷间键，即骨架，都被新的基团取代。保留碱基单元以便与适当的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，即已显示具有优异杂交特性的寡核苷酸模拟物，被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含有酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架替代。核碱基被保留并且直接或间接地结合至
骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。

[0114] 修饰的寡核苷酸也可以含有一个或多个取代的糖部分。寡核苷酸还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。含有修饰或取代碱基的寡核苷酸包括其中核酸中最常见的一个或多个嘌呤或嘧啶碱基被较不常见或非天然碱基取代的寡核苷酸。

[0115] 嘌呤碱基包含与咪唑环稠合的嘧啶环；腺嘌呤和鸟嘌呤是核酸中最常见的两种嘌呤核碱基。这些嘌呤可以被其他天然存在的嘌呤取代，包括但不限于N6‑甲基腺嘌呤、N2‑甲基鸟嘌呤、次黄嘌呤和7‑甲基鸟嘌呤。

[0116] 嘧啶碱基包含六元嘧啶环；胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶是核酸中最常见的嘧啶碱基。这些可以被其他天然存在的嘧啶取代，包括但不限于5‑甲基胞嘧啶、5‑羟甲基胞嘧啶、假尿嘧啶和4‑硫尿嘧啶。在一个实施方案中，本文所述的寡核苷酸含有胸腺嘧啶碱基代替尿嘧啶。

[0117] 其他修饰或取代的碱基包括但不限于2,6‑二氨基嘌呤、乳清酸、胍丁胞苷(agmatidine)、赖氨酸、2‑硫代嘧啶(例如2‑硫代尿嘧啶、2‑硫代胸腺嘧啶)、G形夹(G‑clamp)及其衍生物、5‑取代的嘧啶(例如5‑卤代尿嘧啶、5‑丙炔基尿嘧啶、5‑丙炔基胞嘧啶、
5‑氨基甲基尿嘧啶、5‑羟甲基尿嘧啶、5‑氨基甲基胞嘧啶、5‑羟甲基胞嘧啶、Super T)、7‑脱氮鸟嘌呤、7‑脱氮腺嘌呤、7‑氮杂‑2,6‑二氨基嘌呤、8‑氮杂‑7‑脱氮鸟嘌呤、8‑氮杂‑7‑脱氮腺嘌呤、8‑氮杂‑7‑脱氮‑2,6‑二氨基嘌呤、Super G、Super A和N4‑乙基胞嘧啶或其衍生物；
N2‑环戊基鸟嘌呤(cPent‑G)、N2‑环戊基‑2‑氨基嘌呤(cPent‑AP)和N2‑丙基‑2‑氨基嘌呤(Pr‑AP)、假尿嘧啶或其衍生物；和简并或通用碱基，如2,6‑二氟甲苯或不存在碱基如脱碱基位点(例如1‑脱氧核糖、1,2‑二脱氧核糖、1‑脱氧‑2‑O‑甲基核糖；或其中环氧已被氮取代的吡咯烷衍生物(氮杂核糖))。Super A、Super G和Super T的衍生物的示例可以在美国专
利6,683,173(Epoch Biosciences)中找到。cPent‑G、cPent‑AP和Pr‑AP在掺入siRNA时显示降低免疫刺激作用(Peacock H等人,J.Am.Chem.Soc.2011,133,9200)。假尿嘧啶是尿嘧啶
的天然存在的异构化形式，具有C‑糖苷而不是如尿苷中常规的N‑糖苷。与含尿苷mPvNA相比，含假尿苷的合成mRNA可具有增加的安全特性(参见WO 2009127230)。

[0118] 某些修饰或取代的核碱基特别可用于增加本发明AON的结合亲和力。这些包括5‑取代的嘧啶、6‑氮杂嘧啶和N‑2、N‑6和O‑6取代的嘌呤，包括2‑氨基丙基腺嘌呤、5‑丙炔基尿嘧啶和5‑丙炔基胞嘧啶。5‑甲基胞嘧啶取代已显示可以使核酸双链稳定性提高0.6‑1.2℃，并且是目前优选的碱基取代，尤其是与2'‑O‑甲氧基乙基糖修饰相结合时。

[0119] 在一些实施方案中，修饰或取代的核碱基可用于促进AON的纯化。例如，在某些实施方案中，AON可以含有三个或更多个(例如3、4、5、6或多个)连续的鸟嘌呤碱基。在某些AON中，一系列三个或多个连续的鸟嘌呤碱基可导致寡核苷酸的聚集，使纯化复杂化。在这样的AON中，一个或多个连续的鸟嘌呤可以被肌苷取代。肌苷取代一系列三个或多个连续鸟嘌呤碱基中的一个或多个鸟嘌呤可以减少AON的聚集，从而促进纯化。

[0120] 在一个实施方案中，AON的另一种修饰涉及将一个或多个部分或缀合物化学连接至寡核苷酸，以增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。这些部分或基团包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分、胆酸、硫醚，例如己基‑5‑三苯甲基硫醇、硫代胆固醇、脂族链例如十二烷二醇(dodecandiol)或十一烷基残基(undecyl residues)、磷脂例如二‑十六烷
基‑rac‑甘油或三乙基铵1,2‑二‑O‑十六烷基‑rac‑甘油基‑3‑H‑膦酸酯、聚胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈基部分、或十八烷基胺或己基氨基‑羰基‑氧基胆固醇部分。

[0121] 不必对给定化合物中的所有位置均一地修饰，并且实际上，可将上述修饰中的多于一种掺入化合物中或甚至掺入寡核苷酸内的单个核苷处。本发明还包括作为嵌合化合物
的AON。在本发明的上下文中，“嵌合”反义化合物或“嵌合体”是反义分子，特别是寡核苷酸，其含有两个或多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个单体单元组成，即，在寡核苷酸化合物的情况下为核苷酸。这些寡核苷酸通常含至少一个其中寡核苷酸被修饰以增加对核
酸酶降解的抗性、增加细胞摄取的区域，以及用于增加与靶核酸的结合亲和力的附加区域。

[0122] 根据本发明使用的反义分子可以通过公知的固相合成技术方便地和常规地制备。用于这种合成的设备由多家供应商出售，包括例如Applied Biosystems(加利福尼亚福斯
特市)。一种在修饰的固相支持物上合成寡核苷酸的方法描述于美国专利4,458,066。

[0123] 在另一个非限制性示例中，这种AON是其中至少一个或全部核苷酸含有2'低级烷基部分(例如，C1‑C4、直链或支链的、饱和或不饱和的烷基，如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1‑丙烯基、2‑丙烯基和异丙基)的分子。例如，核苷酸中的每隔一个可以如描述的那样进行修饰。

[0124] 虽然上述AON是本发明AON的优选形式，但本发明包括其他寡聚反义分子，包括但不限于诸如下文所述的寡聚模拟物。

[0125] 另一种优选的化学物质是磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)低聚化合物，其不被任何已知的核酸酶或蛋白酶降解。这些化合物不带电荷，当与RNA链结合时不激活核糖核酸酶H
活性，并且已经显示在体内施用后发挥持续的裂解因子结合调节作用(Summerton和
Weller，Antisense Nucleic Acid Drug Development,1997；7,187‑197)。优选地，本发明的AON是磷酰二胺吗啉代寡聚物。

[0126] 修饰的寡聚物也可以含有一个或多个取代的糖部分。寡聚物还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。某些核碱基对于增加本发明的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包括5‑取代的嘧啶、6‑氮杂嘧啶和N‑2、N‑6和O‑6取代的嘌呤，包括2‑氨基丙基腺嘌呤、5‑丙炔基尿嘧啶和5‑丙炔基胞嘧啶。5‑甲基胞嘧啶取代已显示可以使核酸双链稳定性提高0.6‑1.2℃，尤其是与2'‑O‑甲氧基乙基糖修饰相结合时。在一个实施方案中，寡核苷酸的至少一个嘧啶碱基包含5‑取代的嘧啶碱基，其中嘧啶碱基选自胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。在一个实施方案中，5‑取代的嘧啶碱基是5‑甲基胞嘧啶。在另一个实施方案中，寡核苷酸的至少一个嘌呤碱基包含N‑2、N‑6取代的嘌呤碱基。在一个实施方案中，N‑2、N‑6取代的嘌呤碱基是2,6‑二氨基嘌呤。

[0127] 在一个实施方案中，AON仅包括一个或多个5‑甲基胞嘧啶取代，或包括一个或多个5‑甲基胞嘧啶取代与另一种修饰如2'‑O‑甲氧基乙基糖修饰组合。在又一个实施方案中，AON仅包括一个或多个2,6‑二氨基嘌呤取代，或包括一个或多个2,6‑二氨基嘌呤取代与另一种修饰组合。

[0128] 在一些实施方案中，AON化学连接至一个或多个部分(例如聚乙二醇部分)或缀合物(例如富含精氨酸的细胞穿透肽),以增强AON的活性、细胞分布或细胞摄取。在一个示例
性实施方案中，富含精氨酸的多肽在其N‑末端或C‑末端残基与反义化合物的3'或5'末端共价偶联。此外，在一个示例性实施方案中，反义化合物由吗啉代亚基和含磷的亚基间键组
成，所述键将一个亚基的吗啉代氮连接至相邻亚基的5'环外碳。

[0129] 另一方面，本发明提供了一种表达载体，其整合了上述AON，例如SEQ ID NO:1‑30的AON。在一些实施方案中，表达载体是修饰的逆转录病毒或非逆转录病毒载体，例如腺相关病毒载体。用于测量AON活性的测定

[0130] AON及其变体的活性可以根据本领域的常规技术进行测定。例如，可以通过用于检测转录的核酸或蛋白质的同种型和/或表达的多种公知方法中的任何一种来评估调查的
RNA和蛋白质的同种型形式和表达水平。这些方法的非限制性示例包括RNA同种型的RT‑
PCR，随后是PCR产物的大小分离、核酸杂交方法例如Northern印迹和/或使用核酸阵列；检测细胞内的RNA转录本的荧光原位杂交；核酸扩增方法；检测蛋白质的免疫学方法；蛋白质纯化方法；以及蛋白质功能或活性测定。

[0131] 可以通过从细胞、组织或生物体制备RNA/cDNA(即，转录的多核苷酸)，并将RNA/cDNA与参考多核苷酸(其为所测定核酸的互补物)或其片段进行杂交来评估RNA表达水平。
在与互补多核苷酸杂交之前，可以任选地使用多种聚合酶链式反应或体外转录方法中的任
一种来扩增cDNA；优选地，不对其进行扩增。还可以使用定量PCR检测一种或多种转录本的表达以评估转录本的表达水平。
制造AON的方法

[0132] 根据本发明使用的AON可以通过公知的固相合成技术方便地制备。用于这种合成的设备由多家供应商出售，包括例如Applied Biosystems(加利福尼亚福斯特市)。一种在
修饰的固相支持物上合成寡聚物的方法描述于美国专利号4,458,066中。

[0133] 可以另外或替代地使用本领域已知的用于这种合成的任何其他方法。使用类似的技术制备寡聚物如硫代磷酸酯和烷基化衍生物是众所周知的。在一个这样的自动化实施方
案中，二乙基亚磷酰胺用作起始材料，并且可以如Beaucage等人(1981)Tetrahedron 
Letters,22:1859‑1862所述进行合成。

[0134] 本发明的AON是体外合成的，不包括生物来源的反义组合物或设计用于指导反义寡聚物体内合成的遗传载体构建体。本发明的分子可以与其他分子、分子结构或化合物的
混合物混合、包封、缀合或以其他方式缔合，形成例如脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其他制剂，用于帮助摄取、分布和/或吸收。
载体(vector)

[0135] 还包括能够表达本发明的寡聚的、FUS靶向序列的载体递送系统，例如表达包含本文所述的SEQ ID NO:1‑30中的任一项或多项的多核苷酸序列的载体。

[0136] “载体”或“核酸构建体”是指多核苷酸分子，优选源自例如质粒、噬菌体、酵母或病毒的DNA分子，多核苷酸可插入或克隆到其中。载体优选含有一个或多个独特的限制性位点，并且能够在包括靶细胞或组织或祖细胞或其组织的确定的宿主细胞中自主复制，或者
能够整合到确定宿主的基因组，使得克隆序列可再现。

[0137] 因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如线性或闭合环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何确保自我复制的手段。或者，载体可以是这样的载体，当被引入宿主细胞时，它被整合到基因组中并与它被整合到其中的染色体一起复制。C.治疗方法

[0138] 本发明的AON也可以用作预防或治疗剂，其可以用于治疗疾病的目的。因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗有效量的与可药用运送载体、稀释剂或赋形剂混合的与
FUS前体mRNA中的选定靶标结合以减少如本文所述的FUS表达的AON。

[0139] FUS在细胞质中产生并被输入细胞核。本发明的AON可以导致FUS的减少，这可以减少与FUS聚集、过表达、错误定位或致病性FUS变体相关的病理。

[0140] “有效量”或“治疗有效量”是指以单一剂量或一系列剂量的一部分施用于哺乳动物个体的治疗化合物如反义寡聚物的量，其有效产生所需的治疗效果。

[0141] 因此，本发明提供了一种治疗、预防或改善与FUS蛋白病或FUS高表达相关的疾病影响的药物、预防或治疗组合物，该组合物包含：
a)一种或多种如本文所述的AON，和
b)一种或多种药学上可接受的运送载体和/或稀释剂。

[0142] 优选地，与FUS蛋白病或FUS高表达相关的疾病为FUS‑ALS或FUS‑FTLD。

[0143] 还提供了一种治疗、预防或改善与FUS蛋白病或FUS高表达相关的疾病影响的方法，该方法包括以下步骤：向个体施用有效量的一种或多种AON或包含一种或多种如本文所述的AON的药物组合物。

[0144] 本发明提供了一种治疗、预防或改善与FUS蛋白病或FUS高表达相关的疾病影响的方法，该方法包括以下步骤：向个体施用有效量的一种或多种AON或包含一种或多种如本文所述的AON的药物组合物。

[0145] 还提供了一种治疗、预防或改善ALS影响的方法，该方法包括以下步骤：向个体施用有效量的一种或多种AON或包含一种或多种如本文所述的AON的药物组合物。

[0146] 本发明的方法可以与其他治疗方法联合施用，用于治疗、预防或减缓与FUS蛋白病或FUS高表达相关的疾病及其症状的进展。另外的治疗可以包括针对与FUS蛋白病或FUS高
表达相关的疾病相关的其他靶标的AON。

[0147] 在另一方面，遗传或其他生物标志物可以用于鉴定最有可能通过本发明的AON对FUS抑制反应良好的患者。已经在ALS基因和周围基因区域内鉴定了与ALS疾病风险相关的
遗传结构变异。这些变异可以用作遗传生物标志物以鉴定可能对本发明的方法有反应的患
者。非遗传生物标志物也可以用于鉴定可能对本发明的方法有反应的患者。

[0148] 本发明提供了用于治疗、预防或改善通过生物标志物鉴定的个体中FUS‑ALS或FUS‑FTLD的影响的方法，该方法包括步骤：
a)测试个体中与ALS相关的生物标志物的存在以鉴定可能对FUS抑制有反应的患
者；以及
b)如果发现所述个体表达所述生物标志物，则向所述个体施用有效量的一种或多
种AON或包含一种或多种AON的药物组合物。

[0149] 本文还提供了如本文所述的纯化和分离的AON用于治疗、预防或改善与FUS蛋白病或FUS高表达相关的疾病影响的用途。

[0150] 本文还提供了如本文所述的纯化和分离的AON用于治疗、预防或改善FUS‑ALS或FUS‑FTLD的影响的用途。

[0151] 优选地，本发明中使用的AON选自表1提供的AON列表，或更优选地选自SEQ ID NO:22至27和30。

[0152] 本发明还提供了一种治疗方法，包括组合(1)被设计用于降低FUS表达的AON(SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:30)以降低细胞质FUS过表达的影响。在一个实施方案中，本发明旨在提供一种改善患有与FUS相关的疾病的个体中FUS蛋白病或FUS高表达的方法。

[0153] 组合物可以包含约1nM至1000μM的本发明的每种期望的反义寡聚物。优选地，组合物可以包含约1μM至500μM、10μM至500μM、50μM至750μM、10μM至500μM、1μM至100μM、1μM至50μM、优选25μM至100μM之间的本发明的每种反义寡聚物。组合物还可以优选包含约1nM至500nM、10nM至500nM、50nM至750nM、10nM至500nM、1nM至100nM、1nM至50nM、最优选50nM至
100nM之间的本发明的每种反义寡聚物。

[0154] 组合物可以包含约1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、20nM、50nM、75nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、
700nM、750nM、800nM、850nM、900nM、950nM或1000nM的本发明的每种期望的反义寡聚物。

[0155] 本发明还提供了一种或多种AON，其适于以适合于递送至个体的形式辅助预防性或治疗性治疗、预防或改善与FUS蛋白病或FUS高表达相关的疾病或病理的症状。

[0156] 短语“药学上可接受的”是指生理上可耐受的分子实体和组合物，并且当施用于个体时通常不产生过敏或类似的不良反应，例如胃不适等。术语“运送载体”是指与化合物一起施用稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这类药物运送载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等。优选使用水或盐溶液以及葡萄糖和甘油水溶液作为运送载体，特别是对于注射溶液而言。合适的药物运送载体描述于Martin,Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，Mack 
Publishing Co.,Easton,PA,(1990)。

[0157] 包含一种或多种AON的药物组合物可以在一系列治疗方案中施用于个体。例如，药物组合物可以每小时、每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每六个月一次和每年一次施用。本领域技术人员可以根据待治疗病症的性质确定适当的方案。
D.药物的制备

[0158] 在一个实施方案中，本发明提供了与FUS RNA中的选定靶标结合的AON在制备用于治疗、预防或改善与FUS蛋白病或FUS高表达相关的疾病影响的药物中的用途。因此，提供了本文所述的一种或多种AON在制备用于治疗、预防或改善与FUS蛋白病或FUS高表达相关的
疾病的影响的药物中的用途。优选地，所述疾病是FUS‑ALS或FUS‑FTLD。

[0159] 本发明提供了如本文所述的纯化和分离的反义寡核苷酸在制备用于治疗、预防或改善与FUS蛋白病或FUS高表达相关的疾病影响的药物中的用途。

[0160] 本发明还提供了如本文所述的纯化和分离的反义寡核苷酸在制备用于治疗、预防或改善FUS‑ALS或FUS‑FTLD的影响的药物中的用途。

[0161] 还提供了本文描述的一种或多种AON在制造药物中的用途，所述药物用于在表达与可能对FUS抑制有反应的患者相关的生物标志物的个体中治疗、预防或改善与FUS蛋白病
或FUS高表达相关的疾病的影响。

[0162] 优选地，用于制造药物的AON选自表1提供的AON列表，或更优选地选自SEQ ID NO:22至27和30。
E.药物组合物

[0163] 在本发明的一种形式中，提供了包含治疗有效量的一种或多种本发明的AON以及药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或运送载体的药物组合物。这样的组合物包括各种缓冲液含量(例如Tris‑HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂以及添加剂，例如清洁剂和增溶剂(例如吐温80、聚山梨酸酯80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)和填充物质(例如乳糖、甘露醇)。该材料可以掺入到聚合化合物如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制剂中，或掺入到脂质体中。也可使用透明质
酸。这些组合物可以影响本发明蛋白质和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见，例如Martin，Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版(1990,Mack Publishing Co.,Easton,PA 18042)第1435‑1712页，通过引用并入本文。组合物可以制备成液体形式，或者可以是干燥粉末，例如冻干形式。

[0164] 应当理解，根据本发明提供的药物组合物可以通过本领域已知的任何方式施用。优选地，用于施用的药物组合物通过注射、口服、局部或通过肺部或鼻腔途径施用。AON更优选地通过鞘内、静脉内、动脉内、腹膜内、肌内或皮下施用途径递送。合适的途径可以由本领域技术人员根据治疗个体的状况来确定。血管或血管外循环、血液或淋巴系统以及脑脊液
是一些可以引入AON的非限制性部位。可以采用直接CNS递送，例如，脑室内或鞘内施用可以用作施用途径。

[0165] 用于局部施用的制剂包括其中本公开的寡聚物与局部递送剂混合的那些，所述局部递送剂例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂。脂质和脂质体包括中性(例如二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰基磷脂酰胆碱)阴性(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子(例如二油酰四甲基氨基丙基
DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。对于局部或其他施用，本公开的寡聚物可以被包封在脂质体中或可以与其形成复合物，特别是阳离子脂质体。或者，寡聚物可以与脂质复合，特别是与阳离子脂质复合。脂肪酸和酯、其药学上可接受的盐及其用途进一步描述于美国专
利号6,287,860和/或1999年5月20号提交的美国专利申请序列号09/315,298中。

[0166] 在某些实施方案中，本公开的AON可以通过经皮法递送(例如，通过将AON掺入例如乳液中，其中此类AON任选地包装到脂质体中)。这种经皮和乳液/脂质体介导的用于递送
AON的递送方法描述于本领域例如美国专利号6,965,025中。

[0167] 本文所述的AON也可以经由可植入装置递送。这种装置的设计是本领域公认的过程，例如，美国专利6,969,400中描述的合成植入物设计。

[0168] 用于口服施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒、微粒、纳米颗粒、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或小片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是期望的。口服制剂是其中本公开的寡聚物与一种或多种渗透增强剂、表面活性剂和螯合剂联合施用的那些。表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。胆汁酸/盐和脂肪酸及其用途进一步描述于美国专利号6,287,860中。在一些实施方案中，本公开提供了渗透增强剂的组合，例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。示例性的组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。其他渗透增强剂包括聚氧乙烯‑9‑月桂基醚、聚氧乙烯‑
20‑鲸蜡基醚。本公开的寡聚物可以以包括喷雾干燥颗粒的颗粒形式口服递送，或络合以形成微米或纳米颗粒。寡聚物络合剂和它们的用途进一步描述于美国专利号6,287,860中。寡聚物的口服制剂及其制备详细描述于1999年5月20日提交的美国6,887,906,09/315,298
和/或US20030027780中。

[0169] 用于肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，其还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂，例如但不限于渗透增强剂、运送载体化合物和其他药学上可接受的运送载体或赋形剂。

[0170] 治疗有效量的AON的递送可以通过先前公布的方法来实现。例如，AON的细胞内递送可以通过包含AON和有效量嵌段共聚物的混合物的组合物来进行。这种方法的一个示例
描述于美国专利申请US20040248833。将AON递送至细胞核的其他方法描述于Mann CJ等人，(2001)Proc,Natl.Acad.Science,98(1)42‑47，以及Gebski等人，(2003)Human Molecular Genetics,12(15):1801‑1811中。US 6,806,084中描述了通过表达载体将核酸分子以裸露
DNA或与脂质运送载体复合的形式引入细胞的方法。

[0171] 在某些实施方案中，本发明的AON和包含它们的治疗组合物可以通过经皮法递送(例如，通过将AON掺入例如乳液中，其中此类AON任选地包装到脂质体中)。这种经皮和乳
液/脂质体介导的用于递送AON的递送方法描述于本领域例如美国专利号6,965,025。

[0172] 可能需要在胶体分散体系中递送AON。胶体分散体系包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束、脂质体和脂质体制剂。
这些胶体分散体系可用于制备治疗药物组合物。

[0173] 脂质体是人工膜囊泡，其用作体外和体内递送媒介物。这些制剂可具有净阳离子、阴离子或中性电荷特征，并具有用于体外、体内和离体递送方法的有用特征。已经表明，大的单层囊泡可以包封相当大百分比的含有大分子的水性缓冲液。RNA和DNA可以包裹在含水内部，并以生物活性形式递送至细胞(Fraley等人,1981,Trends Biochem.Sci.,6,77)。

[0174] 为了使脂质体成为有效的基因转移媒介物，应存在以下特征：(1)以高效包封目的AON，同时不损害其生物活性；(2)与非靶细胞相比，优先且基本上结合靶细胞；(3)以高效率将囊泡的水性内容物递送至靶细胞的细胞质；以及(4)精确并有效的表达遗传信息
(Mannino等人，1988Biotechniques，6,682)。脂质体的组合物通常是磷脂的组合，特别是高相变温度磷脂，通常与类固醇，尤其是胆固醇组合。也可使用其他磷脂或其他脂质。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其被认为与带负电荷的DNA分子相互作用以形成稳定的复合物。认为pH敏感或带负电荷的
脂质体捕获会DNA而不是与其复合。阳离子和非阳离子脂质体都已用于将DNA递送至细胞。

[0175] 脂质体还包括“空间稳定的”脂质体，术语在本文中是指包含一种或多种特殊脂质的脂质体，当掺入到脂质体中时，相对于缺乏这种特殊脂质的脂质体，其导致循环寿命增加。空间稳定的脂质体的示例是其中脂质体的形成囊泡的脂质部分的一部分包含一种或多
种糖脂或用一种或多种亲水性聚合物如聚乙二醇(PEG)部分衍生的那些。脂质体及其用途
进一步描述于美国6,287,860中。

[0176] AON可以使用本领域公认的技术(例如转染、电穿孔、融合、脂质体、胶体聚合颗粒和病毒和非病毒载体以及本领域已知的其他手段)引入细胞中。所选择的递送方法将至少取决于待处理的细胞和细胞的位置，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。例如，可以通过在表面上具有特异性标志物以引导脂质体的脂质体、直接注射到包含靶细胞的组织
中、特异性受体介导的摄取等来实现定位。

[0177] 如本领域已知的，AON可以使用例如涉及脂质体介导的摄取、脂质缀合物、聚赖氨酸介导的摄取、纳米颗粒介导的摄取和受体介导的胞吞的方法，以及其他非胞吞的递送模
式来递送，所述非胞吞的递送模式例如显微注射、透化(例如链球菌溶血素‑O透化、阴离子肽透化)、电穿孔和本领域已知的各种非侵入性非胞吞递送方法(参见Dokka和Rojanasakul
的综述，Advanced Drug Delivery Reviews 44,35‑49，其全文以引用方式并入)。

[0178] AON也可以与其他药学上可接受的运送载体或稀释剂组合以制备药物组合物。合适的运送载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。该组合物可以配制成用
于肠胃外、肌内、静脉内、皮下、眼内、口服或经皮施用。

[0179] 所述的施用途径仅作为指导，因为熟练的从业人员将能够容易地确定任何特定动物和病症的最佳施用途径和任何剂量。

[0180] 已经尝试了多种将功能性新基因材料在体外和体内导入细胞的方法(Friedmann(1989)Science,244,1275‑1280)。这些方法包括将待表达的基因整合到修饰的逆转录病毒中(Friedmann(1989)同上；Rosenberg(1991)Cancer Research 51(18),增刊:5074S‑
5079S)；整合到非逆转录病毒载体中(Rosenfeld等人，(1992)Cell,68,143‑155；Rosenfeld等人，(1991)Science,252,431‑434)；或通过脂质体递送与异源启动子‑增强子元件连接的转基因(Friedmann(1989)，同上；Brigham等人，(1989)Am.J.Med.Sci.,298,278‑281；Nabel等人，(1990)Science,249,1285‑1288；Hazinski等人，(1991)Am.J.Resp.Cell 
Molec.Biol.,4:206‑209；以及Wang和Huang(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),84,7851‑
7855)；偶联到配体特异性的、基于阳离子的转运系统(Wu和Wu(1988)J.Biol.Chem.,263,
14621‑14624)或使用裸露DNA、表达载体(Nabel等人，(1990),同上)；Wolff等人，(1990)Science,247,1465‑1468)。将转基因直接注射到组织中仅产生局部表达(Rosenfeld(1992)同上)；Rosenfeld等人，(1991)同上；Brigham等人，(1989)同上；Nabel(1990)同上；和
Hazinski等人，(1991)同上)。Brigham等人的研究小组((1989)Am.J.Med.Sci.298,278‑281和Clinical Research(1991)39(摘要))报道了在静脉内或气管内施用DNA脂质体复合物
后，仅在小鼠肺部进行体内转染。人类基因治疗程序的综述文章的一个示例是：Anderson,(1992)Science 256,808‑813；Barteau等人，(2008),Curr Gene Ther.,8(5),313‑23；
Mueller等人，(2008).Clin Rev Allergy Immunol.,35(3),164‑78；Li等人，(2006)Gene Ther.,13(18),1313‑9；Simoes等人，(2005)Expert Opin Drug Deliv.,2(2),237‑54。

[0181] 本发明的AON包括任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐，或任何其他化合物，其在施用于包括人类在内的动物后，能够(直接或间接)提供其生物活性代谢物或残留物。
因此，作为示例，本公开还涉及本发明化合物的前药和药学上可接受的盐、此类前药的药学上可接受的盐和其他生物等效物。

[0182] 术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的生理学上和药学上可接受的盐：即保留母体化合物的所需生物活性并且不会给母体化合物带来不期望的毒理学作用的盐。对于寡聚物，药学上可接受的盐的优选示例包括但不限于(a)与阳离子如钠、钾、铵、镁、钙、多胺如精胺和亚精胺等形成的盐；(b)与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐；(c)与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的盐；和(d)由元素阴离子如氯、溴和碘形成的盐。本发明的药物组合物可以以多种方式施用，这取决于是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。施用可
以是局部的(包括眼部和粘膜，以及直肠递送)、肺部的(例如通过吸入或吹入粉末或气溶胶(包括通过喷雾器、气管内、鼻内、表皮和经皮))、口服或肠胃外的。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内例如鞘内或心室内施用。具有至少一个2'‑O‑甲氧基乙基修饰的寡聚物被认为对口服施用特别有用。优选地，AON通过皮下或静脉内途径递送。

[0183] 本发明的药物制剂可以方便地以单位剂型存在，可以按照制药工业中公知的常规技术制备。这些技术包括将活性成分与药物运送载体或赋形剂结合的步骤。一般来说，制剂的制备是将活性成分与液体运送载体或细分的固体运送载体或两者均匀且紧密地混合，然
后，如果需要，将产品成型。

[0184] 以下实施例仅是说明性的，无论如何不以任何方式限制本公开的其余部分。包括这些实施例仅用于例证本发明。它们不应被理解为对如上所述的本发明的宽泛概述、公开
或描述的限制。无需进一步的详细描述，相信本领域技术人员可以使用前面的描述最大程
度地利用本发明。在上述和以下实施例中，所有温度都以摄氏度未校正地列出；并且除非另有说明，所有的份数和百分比都是按重量计的。
实施例
实施例
实施例1‑AOs的设计

[0185] 外显子2、3、4、5、6和7靶向的剪接转换AON被设计为结合外显子内的外显子剪接位点和剪接增强子结合位点，如通过在线剪接预测工具所预测的。这些外显子中任何一个的跳跃都将导致转录本阅读框的移位，导致随后外显子中的提前终止密码子。已知具有提前
终止密码子的转录本通过无义介导的衰变而衰变，这是在所有真核细胞中起作用的RNA监
视机制。AON的序列、基因坐标和SEQ ID列于表1中。

[0186] AON具有2'‑O‑甲基糖修饰和硫代磷酸酯(PS)骨架化学。AON命名法是基于Mann等人，(The Journal of Gene Medicine,2002.4(6):第644‑654页)的描述，其中描述了物种、基因、外显子数、受体或供体靶向和退火坐标，其中“‑”表示内含子位置，“+”指定了距离剪接位点的外显子位置，如本文所述。

[0187] 具有2'‑O‑甲基修饰的AON和PS骨架购自TriLink Biotechnologies公司(美国加尼福尼亚州圣迭戈)或ChemGenes公司(美国特拉华州威尔明顿)。磷酰二胺吗啉代寡聚物
(PMO)购自Genetools LLC(美国俄勒冈州法洛马斯)。
实施例2‑AO的筛选和优化

[0188] 在用2'‑O‑甲基AON转染之后进行FUS转录本的RT‑PCR分析。将AON转染后FUS敲低或外显子跳跃的水平与对照处理和未处理样品的水平进行比较。对照序列包括靶向无关基因的AON，SMN：Ctrl AON 1(SEQ ID NO 31:CACCUUCCUUCUUUUUGAUU)扰码序列：Ctrl AON 4(SEQ ID NO 34:CCUCUUACCUCAGUUACAAUUUAUA)和阴性对照寡聚物，具有GeneTools对照序
列：Ctrl AON 2(SEQ ID NO 32:GGAUGUCCUGAGUCUAGACCCUCCG)和Ctrl AON 3(SEQ ID NO 
33:GGATGTCCTGAGTCTAGACCCTCCG)。

[0189] 材料和方法

[0190] 成纤维细胞的转染

[0191] 按照既定技术繁殖正常人真皮成纤维细胞，将15,000个细胞接种到24孔板中的10％FBSDMEM中，并在转染前于37℃孵育24小时。所有AON均使用Lipofectamine 3000(3μl每毫升转染体积)(Life Technologies,澳大利亚墨尔本)按照制造商的方案进行转染，并
将AON转染细胞孵育24小时。

[0192] 转录本分析

[0193] 使用MagMAX‑96总RNA分离试剂盒(包括DNase处理(Life Technologies))根据生产商的说明书提取RNA。使用带有Platinum Taq聚合酶的一步法Superscript III RT‑PCR
试剂盒(Life Technologies)，根据生产商的说明进行RT‑PCR。产物在FUS外显子1至5、1至
6、1至8或6至10处扩增。引物序列可见表2。在适用的情况下，将结果标准化为外显子2至3扩增的无关管家对照基因(TBP)的转录水平。

[0194] PCR产物在Tris‑醋酸‑EDTA缓冲液中的2％琼脂糖凝胶上进行分离，并在凝胶成像系统(Vilber Lourmat，德国埃伯哈德采尔)上捕获图像。使用Image J进行光密度分析，通过标准化为管家基因并与对照处理或未处理样品比较来确定转录本敲低的百分比。

[0195] 在50和25nM浓度下测试了靶向外显子2的两个AON，AON 1和2(SEQ ID:1和2)。用RT‑PCR从外显子1至6扩增FUS转录本。没有观察到外显子2跳跃或转录本敲低。最初使用
Lipofectamine3000进行转染，在人成纤维细胞系中以200和50nM浓度测试靶向外显子3的
AON 3至5(SEQ ID:3、4和5)和4个AON 6至9(SEQ ID:6、7、8和9)。在24小时孵育后收集RNA，并从外显子1至5扩增。在AON 3和5中观察到一些外显子3跳跃，在AON 7和9中观察到一些外显子4跳跃。用AON 8转染后，全长转录本被完全敲低。在第二个实验中，使用50nM和10nM浓度，观察到相似的敲低和外显子跳跃模式(图1a)。在转染了AON 8(SEQ ID:8)的细胞中，使用外显子1中的正向引物和外显子6或8中的反向引物，检测到外显子4和5同时跳跃以及外
显子3、4和5跳跃以及外显子3、4、5和7跳跃的FUS转录本(图1b)。这通过Sanger测序得到证实(图1c)。虽然单独的外显子3、4或5跳跃或3个外显子一起跳跃将导致框外转录(out of 
frame transcript)，但是仅外显子4和5一起跳跃将使阅读框完整并且可以防止转录本经
由NMD途径降解。

[0196] 用从外显子1至8经RT‑PCR扩增的FUS转录本筛选了几个外显子5和6靶向AON。在50和25nM浓度下测试了五个靶向外显子5的AON(SEQ ID:10、11、12、13和14)。几个外显子5靶向的AON(SEQ ID:11、12和13)引起外显子5跳跃(图2A)。凝胶上出现了一些较浅的条带，其大小与外显子5和4或外显子5和6一起跳跃一致。用AON 11(SEQ ID:11)处理的细胞具有最
大的FUS敲低和外显子5跳跃，并且多个跳跃条带(multiple skipped bands)比用AON 12和
13处理的细胞少。这种多外显子跳跃是不希望的，因为外显子5和4或5和6的跳跃导致产物
完整地离开转录本的阅读框，并且预期不会通过NMD途径降解。

[0197] 将AON 11序列上下游各微步移(microwalk)5个碱基(SEQ ID：15和16)，并在2个实验中以200nM至3nM的浓度范围进行测试。AON 16(SEQ ID:16)处理的细胞显示全长转录本
的最大敲低。对于所有3种AON，外显子5的一些跳跃是明显的。亮条带表示在AON 11处理的细胞中存在外显子4和5的跳跃，而在AON 16处理的细胞中看到亮条带，表示外显子5和6的
跳跃。AON 16处理的细胞产生了全长转录本的最大敲低(图2b)。

[0198] 在50和25nM浓度下测试了五个靶向外显子6的AON，AON 17至21(SEQ ID:17、18、19、20和21)。AON 17和18不引起外显子跳跃或转录本敲低。AON 19引起多种多外显子跳跃，检测到的条带大小与跳跃外显子5、外显子5+7、外显子5+6、外显子4+5+6、外显子4+5+6+7、外显子3+4+5+6和外显子3+4+5+6+7的产物一致，但没有外显子6单独跳跃的证据。AON 20诱导外显子6的跳跃，亮条带也明显与外显子6+7跳跃一致。AON 21产生外显子跳跃，检测到的条带与外显子6、外显子5+6和外显子6+7跳跃的大小一致。由外显子6靶向AON产生的多外显子跳跃是不期望的，因为这些转录本中的几种，包括外显子5+6、5+7、6+7和3+4+5+6跳跃转录本，将使转录本的阅读框完整并且将预期不会经由NMD而衰减。

[0199] 最初测试了两个FUS外显子7靶向的AON，AON 22和23(SEQ ID:22和23)。它们在在3个单独的实验中进行了测试，浓度范围低至1nM。当用50nM浓度的AON 22和AON 23处理时，两种AON都能够诱导外显子7的跳跃，其中约37％和36％的转录本显示外显子7跳跃(图3a)。
在一些对照样品中也看到一些外显子7跳跃。这并不出乎意料，因为外显子7跳跃是FUS自动调节的一种机制。AON 22和23也进行了组合测试，然而跳跃效率没有提高(图3a)。

[0200] 将AON 22和23上下游各微步移5个碱基，得到AON 24至27(SEQ ID:24、25、26和27)。这些在2个实验中进行测试。代表性的凝胶图像可见于图3b。选自两个实验的前4个候选物在第三次实验中进行了测试，其浓度范围更广(图3c)。AON 26诱导最大的外显子7跳
跃，在100nM浓度时检测到总转录本的约68％。通过对从琼脂糖凝胶的底部条带提取和扩增的DNA进行Sanger测序，证实了外显子7跳跃(图3d)。
实施例3‑PMO的筛选

[0201] AON 8(靶向外显子4)、AON 16(靶向外显子5靶向)和AON 26(靶向外显子7)被合成为PMO，以获得AON 28、29和30(SEQ ID:28、29和30)。AON 28在2个实验中进行了测试。通过核转染法以100和50μM浓度(核转染期间的浓度)转染成纤维细胞，并在孵育12、24和72小时后收集细胞。用RT‑PCR从外显子1至8扩增FUS转录本(图4a)。观察到与产生2'‑O‑甲基PS AON(AON 8)相同的外显子跳跃模式。以最高浓度转染12小时后最强的条带是跳跃的外显子
3、4、5和7的转录本。在较低浓度下，外显子4和5跳跃条带变得更突出。这在两种浓度下也随时间增加(图4a)。使用抗FUS/TLS抗体(4h11)(Santa Cruz Biotechnology)和抗β‑肌动蛋白抗体A5441(Sigma‑Aldrich)作为管家蛋白，使用Western印迹分析转染3天后收集的样品的FUS蛋白水平。在用AON 28转染后，与对照处理的细胞相比，蛋白水平没有降低(图4c)。

[0202] 通过核转染将外显子5靶向的PMO AON 29(SEQ ID 29)和外显子7靶向的PMO AON 30(SEQ ID 30)以100μM和25μM转染成纤维细胞，并在孵育1、3和5天后收集。用RT‑PCR从外显子1至8扩增FUS转录本(图4b)。AON 29处理的细胞在100μM时显示全长转录本的敲低，但在25μM时则不显示。与此AON序列的2'‑O‑甲基形式所见的情况相反，在24小时时，凝胶上明显的主要跳跃带是外显子4和5的跳跃转录本，只有一条微弱的带对应于外显子5的跳跃转
录本。AON 29没有大大降低FUS蛋白质水平(图4d)。AON 30处理的细胞在两种浓度下都表现出全长转录本的减少。与2'‑O‑甲基形式的序列相比，敲低程度更大，但凝胶上未发现外显子7跳跃转录本(图4b)。如果转录本降解非常有效，则可能会发生这种情况。Western印迹显示AON 30确实导致FUS蛋白的大量减少(图4d)。
实施例4‑进一步测试前导外显子7靶向的PMO(AON 30)

[0203] 在人成纤维细胞中的3个独立实验中测试了AON 30(SEQ ID 30)。用RT‑PCR从外显子6到10扩增FUS转录本，并且与对照相比FUS水平降低，在图5a中可以看到代表性的凝胶图像。FUS蛋白质通过Western印迹定量，转染5天后100μM的FUS蛋白质水平降低到对照水平的
13％(p＝0.0018)，50μM的FUS蛋白质水平降低到26％(p＝0.012)。代表性的蛋白质印迹可见于图5b中，来自3个实验的光密度分析见于图5c中。

[0204] AON 30在神经元样SH‑SY5Y细胞中进行了3次独立实验测试。使用Neon转染系统(Thermo Fisher Scientific)通过电穿孔以25和5μM浓度(电穿孔期间尖端的浓度)转染细
胞。在孵育5天后分析RNA和蛋白质。FUS RNA表达在25μM浓度几乎完全被抑制至对照水平的
3.8％，在5μM浓度几乎完全抑制至11％。代表性的凝胶图像可见于图6a，来自3个实验的光密度分析可见于图6c。在最后6小时的孵育中加入放线菌酮(50μg/ml)导致外显子7跳跃的
转录本在凝胶上变得可见，表明这些转录本在翻译过程中被NMD降解。5天后，通过Western印迹测量的蛋白质水平为对照水平的12％和17％(图6b，c)。