技术领域
[0001] 本发明属于分子成像技术领域，具体涉及一种碳纤维辅助组织转染/离子化的质谱成像方法。
相关背景技术
[0002] 质谱成像(Mass Spectrometry Imaging,MSI)由于其无需标记、非靶向、高灵敏、高分辨等优势，可实现对复杂生物样本的原位可视化分析。且能够在单次实验中同时提供上千种化合物的定位信息及化学信息，通过将二者进行整合，便可表征化合物分子在组织样本中的空间分布情况。目前，质谱成像已在可视化植物、动物组织中的脂质、神经递质、蛋白质、肽类、氨基酸等代谢物方面得到了广泛应用。
[0003] 质谱离子源是质谱及质谱成像最重要的部件之一，承担着使中性的待测物质转化为离子并形成离子束的作用。目前常用于动植物组织成像的质谱成像离子源主要包括基质辅助激光解吸离子化(Matrix‑assisted laser desorption/ionization,MALDI)、解吸电喷雾离子化(Desorption electrospray ionization,DESI)。但MALDI和DESI离子源往往更适合检测极性化合物，在获得的质谱图中就会表现为极性较大、含量较高的化合物的信号峰丰度较高，从而会对一些极性较小、含量较少的化合物造成离子抑制作用。
[0004] 为了拓宽质谱成像可检测的化合物种类与范围，研究人员基于不同的质谱离子源开发了各种前处理技术，例如对于MALDI‑MSI开发了不同的基质以适应不同类型化合物的检测，但寻找与目标化合物适配的基质仍然面临较大的挑战。且基质本身较高的信号强度也会产生离子抑制效应，从而影响目标化合物的检测。此外，基质涂覆方式、结晶大小等多种因素会也影响质谱成像的空间分辨率和检测灵敏度。MALDI‑MSI还需将样本固定在靶板上进行检测，对待测样本的形态限制较大。另外，抽真空的过程还会引起中药组织切片的形变。对于DESI‑MSI来说，研究人员对DESI的喷雾溶剂进行了优化，例如开发了氯仿/四氢呋喃/乙腈溶剂体系、氯仿/乙腈/水体系等多元溶剂体系对低极性化合物进行可视化分析。然而，DESI‑MSI能够检测到的化合物种类在很大程度上都依赖于喷雾溶剂的组成，对于非极性化合物的检测仍然需要使用极性溶剂和非极性溶剂混合而成的多元溶剂体系，这在一定程度上还是会限制DESI‑MSI的检测范围。而且，由于DESI‑MSI还需在敞开式环境中对样本进行检测，极易受到外界的干扰，从而影响其离子化效率和检测灵敏度，难以获得一些低丰度化合物的空间分布信息。
[0005] 此外，用于质谱成像的样本往往采用组织冷冻切片的方式进行前处理，而很多植物类样本如叶、花瓣、花蕊等器官无法进行组织切片，从而限制了这类样本在质谱成像中的应用。而组织印记技术可将待测样本中的内源性代谢物转移到平坦坚硬的表面上，通过降低基质效应提高目标化合物的检测灵敏度。目前研究人员开发了多种印记材料如聚四氟乙烯(PTFE)、多孔石墨羰基材料、基于金纳米颗粒AuNP‑hPDA‑TDNT等载体用于富集低丰度的目标化合物，同时提高待测物的检测灵敏度。然而，目前仅将组织印记技术单独作为前处理的一个操作，尚未实现组织印记与质谱成像离子源联用，充分发挥组织印记载体的作用。
[0006] 因此，本发明以碳纤维纸转染目标样本中的待测分子，并通过对碳纤维纸进行表面修饰使其靶向富集不同极性的目标化合物，试图解决低丰度化合物在质谱成像过程中面对的离子竞争问题，并能拓宽待测样本的类型，使不能切片的样本得以进行质谱成像检测。后续在碳纤维纸上施加电压，使整个体系具备二次电离的作用，增加待测物化合物的离子化效率从而提高其在质谱中的响应。
具体实施方式
[0038] 下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修改同样落入本发明权利要求所限定的范围。
[0039] 如图1所示，实施本发明提供的一种碳纤维辅助组织转染/离子化的质谱成像方法的实验装置包括：组织样本5，所述的组织样本5适于使用冷冻切片方式获得待成像部位薄片，并附着于载玻片上获得适宜切片的待转染组织样本切片6；组织样本2，所述的组织样本2适于直接进行组织转染；压力机4，所述的压力机4适于对待转染的组织样本切片6和可直接转染组织样本2施加压力；碳纤维纸1，所述的碳纤维纸1适于对组织样本切片6和组织样本2经压力机4进行原位转染，获得附有组织印记3的待测碳纤维纸；离子源10，所述的离子源可为商用或自行搭建的质谱电离源，适于对附有组织印记3的待测碳纤维纸进行解吸附/电离；高压装置8，所述的高压装置8套设在附有组织印记3的碳纤维纸上，适于高压辅助碳纤维纸一次电离生成带电离子，提高离子产率；延长的离子传输管7，所述延长的离子传输管7用于将二次电离产生的离子传输到质谱中；二维移动平台9，所述二维移动平台用于承载待测样品组织印记3的碳纤维纸，并在成像时按照设定的步长移动。
[0040] 通过如图1所示的实验装置实施本发明提供的一种碳纤维辅助组织转染/离子化的质谱成像方法，包括如下步骤：
[0041] a)不宜切片的待测样本平置；宜切片的待测样本切片后附着于载玻片上；
[0042] b)待测平面贴于不同极性的碳纤维纸上，使用压力机转染，在碳纤维纸上形成待测印记；
[0043] c)待测印记置于质谱仪的二维移动平台上，选择合适的离子源对印记进行解吸附；
[0044] d)碳纤维纸上施加电压，对解吸附的离子进行二次电离并传输到质谱仪中；
[0045] e)二维移动平台通过设定的步长移动，对选定的样品区域进行检测。
[0046] 实验例1‑采用本发明碳纤维辅助组织转染/离子化的质谱成像方法对西红花柱头进行原位转染。
[0047] 一、实验条件。
[0048] 实验装置图如图1。
[0049] 西红花柱头平置于滤纸上，另一侧贴于碳纤维纸上，最外侧使用两块木板进行固定，置于压力机上设定压力值为1MPa；西红花柱头平置于滤纸上，另一侧贴于另一滤纸上，最外侧使用两块木板进行固定，置于压力机上设定压力值为1MPa；西红花柱头平置于滤纸上，另一侧贴于PTFE板上，最外侧使用两块木板进行固定，置于压力机上设定压力值为1MPa；
[0050] 二、实验结果。
[0051] 如图2所示，使用滤纸为转染载体不能实现原位转染，由于滤纸过强的吸附能力，导致转染的化合物移位；使用PTFE板为载体可在一定程度上实现化合物的原位转染，但观察转染印记发现存在转染不均匀的情况；使用碳纤维为转染载体可实现化合物的原位转染且转染印记较为均匀。
[0052] 实验例2‑采用本发明碳纤维辅助组织转染/离子化的质谱成像方法与质谱仪(质量分析器为四极杆‑飞行时间)联用分析使用碳纤维转染的西红花组织印记。
[0053] 一、实验条件。
[0054] 实验装置图如图1。
[0055] 西红花柱头平置于滤纸上，另一侧贴于碳纤维纸上，最外侧使用两块木板进行固定，置于压力机上设定压力值为1MPa，获得组织印记，将附有组织印记的碳纤维置于二维移动平台上，移动速度为100μm/s，使用DESI离子源对印记进行解吸和一次电离，DESI中溶剂为甲醇，流速为2ul/min，电压为3.0kV，电喷雾针与二维移动平台的角度为38°，施加在碳纤维纸印记上的电压为2.0kV。
[0056] 二、实验结果。
[0057] 如图3所示为使用DESI解吸/离子化结合碳纤维纸转染(上)和DESI解吸/离子化结合PTFE板转染(下)在西红花柱头中得到的平均质谱图，在m/z 800‑1100范围内使用碳纤维纸转染能够获得更多脂质的信号峰，在m/z 1100‑1300范围内获得了更多糖苷类的信号峰，且m/z 400‑600范围内的质谱峰信号强度更高。图4展示了该区域内所示质谱峰对对应的质谱成像图。
[0058] 实验例3‑采用本发明碳纤维辅助组织转染/离子化的质谱成像方法与质谱仪(质量分析器为四极杆‑飞行时间)联用分析使用碳纤维转染的C57小鼠脑组织印记。
[0059] 一、实验条件。
[0060] 实验装置图如图1。
[0061] 对C57小鼠脑进行冷冻切片，并将需成像切片附着于载玻片上，另一侧贴于碳纤维纸上，最外侧使用两块木板进行固定，置于压力机上设定压力值为1MPa，获得组织印记，将附有组织印记的碳纤维置于二维移动平台上，移动速度为100μm/s，使用激光烧蚀碳纤维电离离子源对印记进行解吸和电离，激光与样品之间的距离为10cm，碳纤维束尖端到脑组织样品印记之间的距离为1mm，碳纤维束中溶剂为乙腈，流速为4ul/min，电压为3.2kV，施加在碳纤维纸印记上的电压为2.0kV。
[0062] 二、实验结果。
[0063] 如图5所示为使用激光烧蚀碳纤维电离(下)与其结合碳纤维纸转染/二次电离(上)在小鼠脑中得到的平均质谱图，在m/z 50‑300范围内使用碳纤维纸转染/二次电离能够获得更多小分子代谢物的信号峰，在m/z 1100‑1300范围内获得了更多长链脂质的信号峰，且m/z 700‑1000范围内的质谱峰信号强度更高。图6展示了该区域内所示质谱峰对对应的质谱成像图。
