技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体是水稻耐盐性基因SAT14及其应用。
相关背景技术
[0002] 水稻是我国第一大口粮作物，我国有60%以上的人口以大米为主食。据统计，我国约有盐碱地9000多万公顷，是不可多得的土地后备资源，综合利用潜力巨大。水稻是盐敏感植物，普通水稻在盐碱地难以实现高产，限制了我国水稻种植面积的进一步扩大。改良水稻耐盐性，对于提升盐碱地的利用率，扩充有限耕地资源，增加粮食总量，保障我国口粮绝对安全等方面具有重要意义。
[0003] 因此，鉴定水稻耐盐基因，继而利用现代分子育种手段改良水稻耐盐性，对于扩大水稻在盐碱地种植面积、实现水稻在盐碱地高产稳产，是本领域技术人员亟需解决的问题。
具体实施方式
[0016] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0017] 实施例：1、水稻SAT14基因过表达载体的构建
1.1、目的片段扩增：根据rap‑db网站（https://rapdb.dna.affrc.go.jp/）公布的SAT14基因序列设计扩增SAT14基因全长序列的特异性扩增引物。引物序列如下：
OESAT14‑F：5’‑caggagctcggtaccATGGAGGGTGGAGGCGCAAA
OESAT14‑R：5’‑catggatccggtaccGGAAGCAGTCGGAATGGCAC
以野生型中花11的cDNA为模板，扩增目的基因的全长cDNA。
[0018] 1.2、过表达载体构建：使用KpnI酶切过表达载体pUbi‑Flag，回收产物经过重组酶连接后，转化至大肠杆菌DH5α感受态，待长出单克隆后，测序验证。测序正确后得到pUbi‑SAT14‑Flag过表达载体，其质粒示意图如图1所示。
[0019] 2、水稻SAT14基因敲除载体构建根据CRISPR‑Cas9系统原理，使用在线基因敲除靶位点预测和引物设计网站CRISPRdirect（https://crispr.dbcls.jp/），在SAT14基因上选择靶位点并设计引物，参照已发表的CRISPR/Cas9基因编辑系统提供的方法构建基因编辑载体，得到SAT14‑Cas9基因敲除载体，其质粒示意图如图2所示。具体步骤详见参考文献（Ma X ,Zhang Q ,Zhu Q ,Liu W ,Chen Y ,Qiu R ,Wang B ,Yang Z ,Li H ,Lin Y ,Xie Y ,Shen R ,Chen S ,Wang Z,Chen Y ,Liu Y .A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient ,High‑Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants .Molecular Plant ,2015,
8:1274‑1284）。
[0020] 3、转基因植株的构建3.1、水稻愈伤遗传转化：取2μl pUbi‑SAT14‑Flag、SAT14‑Cas9质粒分别加入到农杆菌EHA105感受态中，冰浴5分钟，液氮速冻5分钟，37℃水浴5分钟，冰浴5分钟。向感受态中加入750μl 无抗LB培养液，28℃摇床培养2小时；吸取50μl菌液涂布在相应抗性的LB固体平板上，28℃培养箱中培养2天。筛选鉴定阳性菌落。
[0021] 3.2、通过农杆菌介导转化中花11的愈伤组织，获得T0代转基因植株，并对SAT14基因表达量进行分析。
[0022] 其中所涉及的各种培养基（诱导培养基、筛选培养基、分化培养基、LB培养液）均为常规培养基。
[0023] 结果表明，相对于野生型，过表达转基因植株OESAT14中SAT14基因的表达量显著提高；敲除转基因植株CrSAT14中SAT14基因的表达量降低，鉴定图如图3所示。
[0024] 4、过表达株系和敲除株系耐盐性评价将野生型中花11和转基因材料种子浸种催芽、播种、利用营养液水培14天，利用含有120mM NaCl的营养液处理水稻植株，处理7天后，换为正常营养液培养7天，统计各个株系生长情况。研究发现，经过盐胁迫下：野生型中花11长到2‑3叶期，SAT14过表达株系在2叶期干枯死亡；SAT14敲除株系长到4‑5叶期，鉴定结果如图4所示，表明SAT14负调控水稻耐盐性。
[0025] 以上仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理在本发明的专利保护范围。
