[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于半胱氨酸耗竭的工程菌及其在制备治疗肿瘤铁死亡的药物中的应用。

[0002] 铁死亡是一种铁离子依赖性的、脂质过氧化驱动的特殊细胞程序性死亡形式，在研究学者十余年的不间断探究下，发现铁死亡设计具有广泛的生物学背景，在发育、衰老、免疫、肿瘤等众多生理病理过程中均发挥重要作用。其还可应用于在肿瘤治疗领域，因肿瘤代谢重编程所引发的代谢网络(脂质合成代谢、氧化还原代谢与铁稳态代谢等)的重构，相比于正常的组织细胞，癌变后的细胞具备充分的发生铁死亡的先决条件。因此铁死亡作为一种靶向肿瘤代谢脆弱性的新型治疗策略备受研究者的青睐与关注。此外，不同于传统化疗所引发的细胞凋亡，铁死亡可以有效避开肿瘤细胞原发性与继发性的凋亡耐受，从而克服肿瘤的化疗抵抗。因此，相比于传统化疗，铁死亡治疗具备更加优异的肿瘤选择性与治疗性能，有望成为肿瘤靶向治疗的理想手段。

[0003] 铁死亡是ROS的积累导致脂质过氧化引起的，当生物膜上脂质过氧化物的产生超出铁死亡防御系统的抵御能力时就会引起过氧化脂质的累积从而引发铁死亡。基于此，当前的肿瘤铁死亡治疗策略往往是通过加速过氧化脂质的产生和抑制肿瘤铁死亡防御系统的运行联合协同作用，即利用铁基纳米载体运载铁死亡防御系统的小分子抑制药物。一方面铁基纳米材料中的铁离子会通过芬顿反应来正向诱导铁死亡的发生，另一方面运载的小分子抑制药物可以降低肿瘤细胞抵御铁死亡的能力，最终产生协同作用高效地引发铁死亡。

[0004] 但是，当前利用的铁死亡防御系统抑制药物多针对的是GPX4‑GSH的抵抗系统，作用靶点单一，但肿瘤在发生发展的过程中构建出了非常完备的防御系统，除了GPX4通路，目前还有另外三种机制参与铁死亡调控：FSP1/CoQ10/NADPH途径，DHODH途径以及GCH1/BH4途径。多条铁死亡防御通路相互代偿，难以完全且高效地阻断铁死亡防御系统的铁死亡抵抗作用，导致现有的相关研究在临床转化与应用时仍面临巨大挑战。

[0005] 通过系统全面分析肿瘤铁死亡防御系统的代谢调控网络，发现含硫复基酸半胱氨酸代谢通路是部分肿瘤抵抗铁死亡的代谢中枢，当前肿瘤细胞抵抗铁死亡的防御系统主要是依靠还原性底物GSH和CoQ10来中和氧化性的脂质过氧化物，而半胱氨酸作为GSH和CoQ10的合成底物是铁死亡防御系统运行的主要驱动力。

[0006] 目前针对半胱氨酸代谢的调控策略主要包括：饮食干预剥夺半胱氨酸、铁死亡防御系统抑制药物Erastin等和铁死亡纳米递送系统。然而，饮食干预的调控策略仅限于晚期的结肠癌(CRC)患者，对其他类型的癌症患者可操作性差，患者依从性低，起效缓慢。Erastin等作用通路单一仍无法完全阻断耗竭半胱氨酸。现有的铁死亡纳米递送系统肿瘤靶向效率不高，且对正常组织仍存在毒副作用。

[0007] 因此，亟需开发出一种更有效和全面的方法来中断铁死亡的防御机制。

[0039] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和说明书附图对本发明进行进一步详细说明。

[0040] 实施例1：重组质粒的构建

[0041] 1.1目的基因序列的构建

[0042] (1)pPept‑PelB‑CGL‑HIS序列的构建

[0043] 优化并合成CGL酶和信号肽PelB基因序列，将筛选出的乏氧感知元件pPept(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)、信号肽PelB(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)、编码CGL酶的基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)、标签HIS(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)的基因序列通过高效克隆质粒pMD‑18T进行拼接，转化至质粒受体菌DH5α中，获得重组克隆菌pMD‑18T‑pPept‑PelB‑CGL‑HIS‑DH5α，设计目的序列(pPept‑PelB‑CGL‑HIS)的PCR引物，进行全长PCR合成反应，获得含酶切位点的目的基因全长序列，回收pPept‑Pel B‑CGL‑HIS基因片段。

[0044] (2)pPept‑OmpA‑CGL‑HIS序列的构建

[0045] 构建方法同1.1(1)，不同的是，将信号肽替换成OmpA(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)，回收pPept‑OmpA‑CGL‑HIS基因片段。

[0046] (3)pPept‑L‑AsPsII‑CGL‑HIS序列的构建

[0047] 构建方法同1.1(1)，不同的是，将信号肽替换成L‑AsPsII(氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)，回收pPept‑L‑AsPsII‑CGL‑HIS基因片段。

[0048] 1.2重组质粒的合成

[0049] (1)以表达载体pBR322为基因底盘，利用双酶切连接技术将目的序列连接至表达质粒pBR322中，挑取单克隆菌落进行基因鉴定，获得含有重组质粒pBR322‑pPept‑PelB‑CGL‑HI S的DH5α菌株。如图1为重组质粒pBR322‑pPept‑PelB‑CGL‑HIS的质粒图谱。

[0050] (2)以表达载体pQE‑30为基因底盘，构建方法同1.2(1)，得到含重组质粒pQE‑30‑pPept‑OmpA‑CGL‑HIS的DH5α菌株。

[0051] (3)以表达载体pET‑28(a)为基因底盘，构建方法同1.2(1)，得到含重组质粒pET‑28(a)‑pPept‑L‑AsPsII‑CGL‑HIS的DH5α菌株。

[0052] 利用无内毒素质粒小提中量试剂盒(天根生化科技有限公司)分别从不同的重组菌中提取得到重组质粒pBR322‑pPept‑PelB‑CGL‑HIS，pQE‑30‑pPept‑OmpA‑CGL‑HIS，pET‑28(a)‑pPept‑L‑AsPsII‑CGL‑HIS。

[0053] 实施例2：半胱氨酸代谢工程菌的构建

[0054] 2.1以减毒沙门氏菌VNP20009为底盘构建工程菌。

[0055] 将提取得到的重组质粒pBR322‑pPept‑PelB‑CGL‑HIS通过电转法引入VNP20009感受态细胞中，转化后涂布至含50mg/L氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养后对阳性菌落进行PCR、酶切和测序鉴定，如图2为质粒pBR322‑pPept‑PelB‑CGL‑HIS和相应半胱氨酸代谢调控工程菌的PCR结果，目的片段大小为2100bp左右，未添加引物组没有目的条带，引物+质粒组在2100bp出有明显的条带，证明质粒构建成功，并且该条带出现在引物+细菌组，证明工程菌构建成功，获得的阳性克隆菌株即为工程菌VNP‑pBR322‑pPept‑PelB‑CGL‑HIS。

[0056] 2.2以大肠杆菌Nissle1917为底盘构建工程菌。

[0057] 构建方法同2.1，不同的是，将感受态细胞替换成大肠杆菌Nissle1917的感受态细胞，使用1.2(2)中的重组质粒。得到工程菌Nissle‑pQE‑30‑pPept‑OmpA‑CGL‑HIS。

[0058] 2.3以大肠杆菌Mg1655为底盘构建工程菌。

[0059] 构建方法同2.1，不同的是，将感受态细胞替换成大肠杆菌Mg1655的感受态细胞，采用热转化法引入1.2(3)构建的重组质粒。得到工程菌Mg1655‑pET‑28(a)‑pPept‑L‑AsPsII‑CGL‑HIS。

[0060] 实施例3：工程菌功能验证

[0061] 1.乏氧响应能力

[0062] 通过ELISA实验对工程菌乏氧响应能力的进行评估：将实施例2中得到的工程菌VNP‑pBR322‑pPept‑PelB‑CGL‑HIS，分别于不同氧气浓度梯度下诱导12h，使用Ripa裂解液处理样品利用ELISA试剂盒(江莱生物)定性分析乏氧响应产生CGL酶的效率。

[0063] 结果如图3所示，从图中可以看出，随着氧气含量的减少，工程菌的CGL表达量逐步提高。

[0064] 2.表达得到的CGL酶功能测试

[0065] 将工程菌VNP‑pBR322‑pPept‑PelB‑CGL‑HIS于乏氧条件下诱导12h，利用检测底物丙酮酸的方法通过丙酮酸检测试剂盒，基于米氏方程计算CGL酶催化分解胱氨酸与半胱氨酸的酶动力学，结果如图4所示，从图中可以看出乏氧诱导条件下工程菌可有效降解犬尿氨酸。

[0066] 采用相同的方法对工程菌Nissle‑pQE‑30‑pPept‑OmpA‑CGL‑HIS和Mg1655‑pET‑28(a)‑pPept‑L‑AsPsII‑CGL‑HIS的功能进行测试和验证，得到了类似的检测结果，说明实施例2中构建的工程菌均具有在肿瘤部位(乏氧环境中)表达CGL酶，并分解胱氨酸与半胱氨酸，而在正常组织中则基本不表达CGL酶，具有用于靶向耗竭肿瘤微环境的半胱氨酸的潜力。

[0067] 实施例4：在体评价工程菌的调控半胱氨酸性能

[0068] 将成瘤状态良好且大小相同(75mm3左右)的TNBC原位瘤模型小鼠随机分成3组，分别给予PBS(100μL)，CGL(0.2mg分散于100μL PBS)，ZZY(VNP‑pBR322‑pPepT‑PelB‑CGL‑HIS7
记作ZZY，10 CFU ZZY分散于100μL PBS中)；所有治疗组均采用瘤内注射。使用半胱氨酸检测试剂盒测定不同时间点肿瘤组织中的半胱氨酸含量，以监测半胱氨酸的消耗情况，监测的时间点为12h，24h，48h，72h。将上述时间点中的小鼠进行处死，收集肿瘤组织，研磨匀浆后收集上清液进行半胱氨酸定量。结果如图5所示，在瘤内给药12小时后，CGL组的半胱氨酸清除效果优于ZZY，但两者在24小时的效果相同。然而，随着时间的推移，用CGL治疗的肿瘤组织中半胱氨酸水平逐渐回升，而用ZZY治疗的肿瘤组织中半胱氨酸水平一直很低，表明工程菌ZZY可以持续有效地消耗半胱氨酸，从而抑制半胱氨酸代谢。

[0069] 实施例5：多功能生物膜工程化修饰工程菌

[0070] 本实施例用于说明本发明提供的工程菌生物膜工程化修饰的方法及其修饰效果。生物膜包括红细胞膜、肿瘤细胞膜、巨噬细胞膜等或为杂合膜，例如红细胞和巨噬细胞杂合等。

[0071] 为了进一步提高工程菌的靶向性及抗吞噬能力，采用构建原位TNBC小鼠模型的原位肿瘤细胞膜与巨噬细胞膜对实施例2得到的工程菌VNP‑pBR322‑pPepT‑PelB‑CGL‑HIS进行包膜修饰(采用薄膜挤出法，即，将巨噬细胞膜与肿瘤细胞膜均匀混合后与工程菌共挤出以进行修饰)，将得到的工程菌记作ZZY@MT(M：巨噬细胞膜，T：肿瘤细胞膜)。

[0072] 通过SEM与TEM的直接观测生物膜的包覆修饰，结果详见图6。图6示出相比于未经修饰的ZZY，ZZY@MT的形貌不会因为多功能生物膜的修饰而发生变化，利用TEM和SEM对于ZZY@MT与ZZY的形貌、结构等信息进行分析，可明显发现ZZY@MT的外部包覆一层脂双层膜状结构。

[0073] 利用绿色荧光蛋白GFP对工程菌进行标记，Anti‑CD47标记多功能融合膜，通过共聚焦显微镜对染色结果进行分析，结果详见图7。图7示出工程化修饰的工程菌ZZY@MT的染料Merge情况良好，证明巨噬细胞膜与三阴乳腺癌膜的混合情况良好，且成功修饰到了工程菌表面。

[0074] 随后，在细胞水平进行表征，利用共聚焦小皿培养分别巨噬细胞和肿瘤细胞，孵育GFP标记的工程菌ZZY@MT或者ZZY，采用流式细胞仪进行表征，结果详见图8。图8示出多功能生物膜修饰后的工程菌表现出很好的免疫逃逸与肿瘤靶向性能。

[0075] 为了进一步提高工程菌的长效循环能力，采用提取的红细胞膜对实施例2得到的工程菌VNP‑pBR322‑pPepT‑PelB‑CGL‑HIS进行包膜修饰(采用薄膜挤出法，即，将红细胞膜与工程菌共挤出以进行修饰)，将得到的工程菌可记作ZZY@R(R：红细胞膜)。

[0076] 为了进一步提高工程菌的长效循环能力和抗吞噬能力，采用提取的红细胞膜与巨噬细胞膜对实施例2得到的工程菌ZZY进行包膜修饰(采用薄膜挤出法，即，将红细胞膜与巨噬细胞膜均匀混合后与工程菌共挤出以进行修饰)，将得到的工程菌可记作ZZY@RM(R：红细胞膜，M：巨噬细胞膜)。

[0077] 本领域技术人员可以根据实际需要选择所需的生物膜修饰材料，故不再赘述。

[0078] 采用相同的方法对工程菌ZZY@R和ZZY@RM的修饰效果进行测试和验证，得到了类似的检测结果，说明选择的目的生物膜很好地修饰到了工程菌表面，且具有相应的性能。

[0079] 实施例6：工程菌的体内靶向富集效果评价

[0080] 将成瘤状态良好且大小相同(75mm3左右)的TNBC原位瘤模型小鼠随机分成4组：ZZY，ZZY@M(巨噬细胞膜修饰)，ZZY@T(TNBC肿瘤细胞膜修饰)，ZZY@MT，均通过尾静脉注射的
7
方式打入10CFU的工程菌。所有小鼠在指定的时间点处死并进行分析(12h、24h、48h、72h各
1只)。分别取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和肿瘤组织在玻璃均质器中均质。用LB培养基连续稀释，取50μL稀释液加入带有抗生素的LB‑Amp琼脂平板中，在37℃孵育过夜，细菌计数并计算每克组织中的工程菌含量。72h肿瘤组织菌涂板的菌落计数结果详见图9。图9示出可看出包覆了混合细胞膜的细菌在肿瘤处的富集地较多，证明包覆了混合膜的细菌靶向性能较好。

[0081] 采用相同的方法对工程菌Nissle‑pQE‑30‑pPept‑OmpA‑CGL‑HIS和Mg1655‑pET‑28(a)‑pPept‑L‑AsPsII‑CGL‑HIS的靶向性进行测试和验证，得到了类似的检测结果，说明本发明提供的工程菌具有良好的肿瘤靶向性，并且可以在肿瘤部位有效定植。

[0082] 实施例7：半胱氨酸代谢调控工程菌用于TNBC的治疗

[0083] 将成瘤状态良好且大小相同(75mm3左右)的TNBC原位模型小鼠随机分成四组：(1)PBS组:治疗开始尾静脉注射100μL PBS：(2)WT@MT组(巨噬细胞与TNBC肿瘤细胞杂合膜修饰7
的野生VNP20009型)：治疗开始尾静脉注射10CFU工程菌：(3)ZZY@MT组(巨噬细胞与TNBC肿
7
瘤细胞杂合膜修饰的工程菌)：治疗开始尾静脉注射10CFU工程菌；(4)ZZY@MT+DFO组：治疗
7
开始尾静脉注射10CFU工程菌，同时腹腔注射适量铁死亡抑制剂DFO。各组在治疗期间荷瘤小鼠的肿瘤生长情况如图10所示，可见ZZY@MT组表现出良好的三阴性乳腺癌抑制效果。

[0084] 实施例8：半胱氨酸代谢调控工程菌用于TNBC转移模型的免疫联合治疗

[0085] 4T1‑luc细胞(带荧光素酶(Luciferase)标签的4T1小鼠乳腺癌细胞)在RPMI‑1640细胞培养基中生长至指数生长期后用0.5％胰酶消化，接着800rpm离心5min，去除上清培养5
液后用PBS洗涤2次后进行细胞计数，每只小鼠尾静脉缓慢注入100μL细胞悬液，即2×10个/只。接种后小鼠饲养于清洁级动物房中，通过IVIS成像系统监测肿瘤生长并进行治疗。

[0086] 小鼠随机分成四组：(1)PBS组：治疗开始尾静脉注射100μL PBS；(2)PD‑L1组：治疗开始每三天腹腔注射PD‑L1溶液(12.5mg/kg)；(3)ZZY@MT组(ZZY@MT：巨噬细胞与TNBC肿瘤7
细胞杂合膜修饰的工程菌)：治疗开始尾静脉注射10CFU工程菌；(4)ZZY@MT+PD‑L1组(ZZY@
7
MT：巨噬细胞与TNBC肿瘤细胞杂合膜修饰的工程菌)：治疗开始尾静脉注射10CFU工程菌，同时每三天腹腔注射PD‑L1溶液(12.5mg/kg)。

[0087] 各组在治疗期间通过IVIS表征荷瘤小鼠肿瘤生长情况，结果详见图11。可以看出，工程菌联合免疫治疗组对转移型三阴性乳腺癌表现抑制。

[0088] 实施例9：半胱氨酸代谢调控工程菌用于术后复发型TNBC的免疫联合治疗[0089] 为模拟临床TNBC术后的残余复发，在左侧乳腺原位成瘤，记作原发性肿瘤，在成瘤3
状态良好且大小相同(75mm左右)时进行统一手术切除，小鼠随机分成四组：(1)PBS组：治疗开始尾静脉注射100μL PBS；(2)PD‑L1组：治疗开始每三天腹腔注射PD‑L1溶液(12.5mg/kg)；(3)ZZY@MT组(ZZY@MT：巨噬细胞与TNBC肿瘤细胞杂合膜修饰的工程菌)：治疗开始尾静
7
脉注射10CFU工程菌；(4)ZZY@MT+PD‑L1组(ZZY@MT：巨噬细胞与TNBC肿瘤细胞杂合膜修饰
7
的工程菌)：治疗开始尾静脉注射10 CFU工程菌，同时每三天腹腔注射PD‑L1溶液(12.5mg/kg)。

[0090] 各组在治疗期间荷瘤小鼠的肿瘤生长情况如图12所示，可见工程菌联合免疫治疗组对复发型三阴性乳腺癌表现抑制，显著提高了小鼠生存率。

[0091] 实施例10：生物膜修饰的半胱氨酸代谢调控工程菌用于肺癌的治疗

[0092] Lewis‑luc细胞(带荧光素酶(Luciferase)标签的Lewis小鼠肺癌细胞)在DMEM细胞培养基中生长至指数生长期后用0.5％胰酶消化，接着800rpm/min离心5min，去除上清培养液后用PBS洗涤2次后进行细胞计数，每只C57BL/6小鼠接种100μL于小鼠肺部处，即5×6
10个/只。接种后小鼠饲养于清洁级动物房中，通过IVIS成像系统监测肿瘤生长并进行治疗。

[0093] 小鼠随机分成2组：(1)PBS组：治疗开始尾静脉注射100L PBS；(2)工程菌组(ZZY@T，经Lewis肺癌细胞膜包膜修饰的工程菌VNP‑pBR322‑pPepT‑PelB‑CGL‑HIS)：工程菌静脉8
注射10 CFU(位于指数生长期，溶于100μL PBS)，给药两次，间隔3天；治疗结束后第三天处死小鼠，在无菌环境下取荷瘤小鼠的肿瘤，称重记录。

[0094] 各组在治疗期间荷瘤小鼠生存曲线如图13所示，可见工程菌组表现出良好的肺癌抑制效果。

[0095] 实施例11：多功能生物膜修饰的半胱氨酸代谢调控工程菌用于胰腺癌的治疗[0096] Panc02‑luc细胞(带荧光素酶(Luciferase)标签的Panc02小鼠胰腺导管腺癌细胞)在RPMI‑1640细胞培养基中生长至指数生长期后用0.5％胰酶消化，接着800rpm/min离心5min，去除上清培养液后用PBS洗涤2次后进行细胞计数，每只C57BL/6小鼠接种100μL于6
小鼠胰腺部位处，即5×10个/只。接种后小鼠饲养于清洁级动物房中。接种后小鼠饲养于清洁级动物房中，通过IVIS成像系统监测肿瘤生长并进行治疗。小鼠随机分成2组：(1)PBS组：治疗开始尾静脉注射100L PBS；(2)工程菌组(ZZY@RT，经红细胞与Panc02胰腺导管腺癌
8
细胞杂合膜修饰的工程菌VNP‑pBR322‑pPepT‑PelB‑KYNase)：工程菌静脉注射10CFU(位于指数生长期，溶于100μL PBS)，给药两次，间隔3天。

[0097] 通过IVIS表征胰腺癌小鼠肿瘤生长情况，结果如图14所示。可见，工程菌组表现出良好的胰腺癌抑制效果。