[0001] 本发明属于生物医学工程及医用材料领域，尤其涉及一种基于生物正交反应的水凝胶膜片及其制备方法。

[0002] 水凝胶是在水溶液中通过化学和/或物理交联而形成的三维网络聚合物。水凝胶常具有高吸水性和保水性，它高度水合的性质与细胞外基质类似，这赋予了水凝胶极好的生物相容性。

[0003] 根据水凝胶发生凝胶化时的作用力分类：1)物理水凝胶，是指通过物理缠结、氢键和疏水相互作用等物理作用形成凝胶状态的一类水凝胶；现阶段常用的物理水凝胶有如Matrigel和BME，这些属于天然水凝胶来源于动物组织，含有大量天然组织成分，便于细胞黏附性生长。然而，动物来源的水凝胶成分复杂，存在批次间差异，机械性质不可调难以满足不同细胞的培养需求，存在免疫原性无法满足植入需求。2)化学水凝胶，是指通过化学键交联形成复杂的三维网络结构的水凝胶，化学水凝胶的形成是不可逆的，性质比物理水凝胶更加稳定。然而，由于化学水凝胶形成过程中存在化学反应，会对细胞造成毒性，且难以实现模块化定制的需求。因此，现阶段能用于生物医学领域中的水凝胶组织膜片的种类有限。现阶段商业售卖的化学水凝胶主要是光固化水凝胶，有GelMA、HAMA等。使用时需要光引发剂，通过光引发的自由基聚合反应形成水凝胶。然而，光引发剂引发的自由基聚合反应会造成细胞损伤。

[0004] 因此，现阶段物理水凝胶的理化性质可调范围窄、存在批次间差异、动物来源不可体内移植等问题，以及光固化水凝胶在使用过程中需要使用光引发剂，光引发剂引发的自由基聚合反应会造成细胞损伤的问题。

[0005] 近20年，生物正交点击化学发展迅速，并广泛运用于生物材料领域。相比与其它化学法，生物正交点击化学反应更温和、反应速度快、不需要催化剂、细胞相容性更好。采用可相互反应的正交化学反应对分别偶联到材料上，然后将修饰过的材料简单混合进行反应，即能形成水凝胶。通过调节材料的种类、浓度、分子量、化学计量比、反应条件等，可制备具有不同理化性质的水凝胶膜片，实现水凝胶膜片的模块化定制。

[0093] 下面结合具体实施例及附图，对本发明做进一步说明：

[0094] 关于本发明基于生物正交点击化学反应的水凝胶膜片的制备方法如下：

[0095] 步骤(1)四嗪修饰化合物的合成

[0096] 四嗪修饰化合物具体包括明胶四嗪、透明质酸四嗪、胶原蛋白四嗪、聚乙二醇四嗪、海藻酸四嗪、RGD四嗪；

[0097] 步骤(2)降冰片烯修饰化合物的合成

[0098] 降冰片烯修饰化合物具体包括明胶降冰片烯、透明质酸降冰片烯、胶原降冰片烯、聚乙二醇降冰片烯、海藻酸降冰片烯、RGD降冰片烯。

[0099] 步骤(3)四嗪化合物混合溶液的制备

[0100] 分别称取步骤(1)中四嗪修饰化合物溶于缓冲溶液中，混合均匀，得到四嗪化合物混合溶液；

[0101] 步骤(4)降冰片烯化合物混合溶液的制备

[0102] 分别称取步骤(2)中降冰片烯修饰化合物溶于缓冲溶液中，混合均匀，得到降冰片烯化合物混合溶液；

[0103] 步骤(5)水凝胶膜片的制备

[0104] 将步骤(3)中的四嗪化合物混合溶液和步骤(4)中的降冰片烯化合物混合溶液混合均匀，移入容器中，37℃下静止0.5‑3小时后，置于4℃下10‑30分钟，即可取出所述的水凝胶膜片。

[0105] 下述为四嗪修饰化合物和降冰片烯化合物合成的实施例1‑3：

[0106] 实施例1

[0107] 其中，关于四嗪修饰化合物中明胶四嗪、透明质酸四嗪、胶原蛋白四嗪、聚乙二醇四嗪、海藻酸四嗪、RGD四嗪的具体合成方法分别如下：

[0108] 关于明胶四嗪(Gel‑Tz)的合成方法为：

[0109] 步骤1：在40℃下，称取100mg的B型明胶溶于8mL、pH为9.0的PBS缓冲溶液中，充分搅拌溶解得到明胶溶液；

[0110] 步骤2：称取81.9mg的甲基四嗪活性酯(Tz‑NHS)溶于2mL的DMSO溶液中，待其完全溶解后逐滴加入步骤1制备的明胶溶液中，使得Tz‑NHS和明胶中氨基的摩尔比NHS:NH2＝1.0，在40℃、250rpm搅拌下反应12小时，加入40mL的纯水终止反应，将反应液移至8‑14kDa的透析袋中透析3天，冷冻干燥48h后，即得到粉色海绵状明胶四嗪(Gel‑Tz)，4℃保存备用。

[0111] 关于胶原蛋白四嗪(Col‑Tz)的合成方法为：

[0112] 步骤i：在常温、250rpm搅拌的条件下，将100mg的重组人源化III型胶原蛋白溶于8mL、pH为9.0的PBS缓冲溶液中，充分搅拌溶解得到胶原蛋白溶液；

[0113] 步骤ii：称取59.5mg的甲基四嗪活性酯(Tz‑NHS)溶于2mL的DMSO溶液中，待其完全溶解后逐滴加入步骤i的胶原蛋白溶液中，使得Tz‑NHS和胶原蛋白中氨基的摩尔比NHS:NH2＝1.0，在常温、250rpm搅拌下反应12小时，加入40mL的纯水终止反应，将反应液移至截留分子量为8‑14kDa的透析袋中透析3天，冷冻干燥48h后，即得到粉色海绵状的胶原蛋白四嗪(Col‑Tz)，4℃保存备用。

[0114] 关于透明质酸四嗪(HA‑Tz)的合成方法为：

[0115] 步骤I：在常温、250rpm搅拌的条件下，将100mg、分子量为10‑15kDa的透明质酸钠溶于8mL、pH为6.5的MES缓冲溶液中，过夜搅拌使其完全溶解得到透明质酸钠溶液；

[0116] 步骤II：称取142.7mg、1.24mmol的N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)和237.7mg、1.24mmol的1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)‑碳二亚胺盐酸盐(EDC)，在搅拌的条件下加入步骤I制备的透明质酸钠溶液，使得NHS、EDC和透明质酸中COOH的摩尔比NHS:EDC:COOH＝5:5:1，搅拌进行活化反应0.5小时，得到活化后的透明质酸钠溶液；

[0117] 步骤III：称取47.83mg的盐酸甲基四嗪胺(Tz‑NH2)，溶于2mL的DMSO溶液中，逐滴加入步骤II中得到的活化透明质酸钠溶液中，使得摩尔比NH2：COOH＝1.0，在常温下、搅拌反应24小时，加入40mL的纯水终止反应，将反应液移至截留分子量为8‑14kDa的透析袋中透析3天、冻干，即得到粉色海绵状透明质酸四嗪(HA‑Tz)，4℃保存备用。

[0118] 关于海藻酸四嗪(Alg‑Tz)的合成方法为：

[0119] 步骤①：在常温、搅拌的条件下，将100mg的海藻酸钠溶于8mL、pH为6.5、100mM的MES缓冲溶液中，搅拌过夜使其完全溶解得到海藻酸钠溶液；

[0120] 步骤②：称取290.5mg、2.5mmoL的N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)和484.0mg、2.5mmoL的1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)‑碳二亚胺盐酸盐(EDC)，在常温、搅拌的条件下加入步骤①制备的海藻酸钠溶液中，使得NHS、EDC和海藻酸中COOH的摩尔比NHS:EDC:COOH＝5:5:1，搅拌进行活化反应0.5小时，得到活化后的海藻酸钠溶液；

[0121] 步骤③：称取120mg的盐酸甲基四嗪胺(Tz‑NH2)，溶于2mL的DMSO溶液，逐滴加入步骤②中得到的活化海藻酸钠溶液中，使得摩尔比NH2:COOH＝1.0，在常温、搅拌反应24小时，加入40mL的纯水终止反应，将反应液移至截留分子量为8‑14kDa的透析袋中透析3天、冻干，即得到粉色海绵状海藻酸四嗪(Alg‑Tz)，4℃保存备用。

[0122] 关于聚乙二醇四嗪(PEG‑Tz)的合成方法为：

[0123] 步骤a：在常温、搅拌的条件下，将100mg、分子量10kDa的四臂聚乙二醇氨基溶于9mL、pH为9.0的PBS缓冲溶液中，250rpm下搅拌10分钟使其完全溶解得到四臂聚乙二醇氨基溶液；

[0124] 步骤b：称取13.1mg的甲基四嗪活性酯(Tz‑NHS)，溶于1mL的DMSO溶液中，待其完全溶解后逐滴加入步骤a的四臂聚乙二醇氨基溶液中，使得NHS和四臂聚乙二醇中氨基的摩尔比NHS:NH2＝1.0，在常温、搅拌下反应16小时，加入40mL的纯水终止反应，将反应液移至截留分子量为8‑14kDa的透析袋中透析3天、冻干，即得到粉色海绵状聚乙二醇四嗪(PEG‑Tz)，4℃保存备用。

[0125] 关于RGD四嗪(RGD‑Tz)的合成方法为：

[0126] 步骤A：在常温、搅拌的条件下，将11mg的线性RGDS四肽溶于3mL、pH为8.5的PBS缓冲溶液中，使其完全溶解得到RGD溶液；

[0127] 步骤B：称取100mg的NHS‑PEG‑Tz(分子量为2K)溶于8mL、pH为8.5的PBS缓冲溶液中，在搅拌的条件下加入步骤A制备的RGD溶液，使得NHS和RGD中氨基的摩尔比NHS:NH2＝1.0，在常温、搅拌下反应2小时，加入40mL的纯水终止反应，将反应液移至截留分子量为
1.5kDa的透析袋中透析2天、冻干，即得到粉色海绵状RGD四嗪(RGD‑Tz)，4℃保存备用。

[0128] 其中，关于降冰片烯修饰化合物包括明胶降冰片烯、透明质酸降冰片烯、胶原蛋白降冰片烯、聚乙二醇降冰片烯、海藻酸降冰片烯、RGD降冰片烯的合成方法如下：

[0129] 关于明胶降冰片烯(Gel‑Nb)的合成方法为：

[0130] 步骤1：在40℃下，将100mg的B型明胶溶于9.5mL、pH为9.0的PBS缓冲溶液中，充分搅拌溶解得到明胶溶液；

[0131] 步骤2：称取412.0mg的降冰片烯二酸酐(Nb‑COOH)粉末，并在搅拌下加入步骤1的明胶溶液中，使得摩尔比Nb‑COOH:NH2＝10.0,降冰片烯二酸酐溶解过程中，监测反应液的pH值并用10M的NaOH溶液调整反应液的pH呈9.0，在40℃、搅拌下反应12小时，加入40mL的纯水终止反应，将反应液移至截留分子量为8‑14kDa的透析袋中透析2天、冻干，即得到白色海绵状的明胶降冰片烯(Gel‑Nb)，4℃保存备用。

[0132] 关于胶原蛋白降冰片烯(Col‑Nb)的合成方法为：

[0133] 步骤i：在常温、搅拌的条件下，将100mg的重组人源化III型胶原蛋白溶于9.6mL、pH为9.0的PBS缓冲溶液中，充分搅拌溶解得到胶原蛋白溶液；

[0134] 步骤ii：称取298.8mg的降冰片烯二酸酐(Nb‑COOH)粉末，并在搅拌下加入步骤i的胶原蛋白溶液中,使得摩尔比Nb‑COOH:NH2＝10.0，降冰片烯二酸酐溶解过程中，监测反应液的pH值并用10M的NaOH溶液调整反应液的pH呈9.0，在常温、搅拌下反应24小时，加入40mL的纯水终止反应，将反应液移至截留分子量为8‑14kDa的透析袋中透析2天、冻干，即得到白色海绵状的胶原蛋白降冰片烯(Col‑Nb)，4℃保存备用。

[0135] 关于透明质酸降冰片烯(HA‑Nb)的合成方法为：

[0136] 步骤I：在常温、搅拌的条件下，将100mg、分子量为10‑15kDa的透明质酸钠溶于10mL、pH为6.5、100mM的MES缓冲溶液中，搅拌过夜使其完全溶解得到透明质酸钠溶液；

[0137] 步骤II：称取143.7mg、1.24mmol的N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)和192.3mg、1.24mmol的1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)‑碳二亚胺盐酸盐(EDC)，在搅拌的条件下加入步骤I制备的透明质酸钠溶液，使得摩尔比NHS:EDC:COOH＝5:5:1，搅拌进行活化反应0.5小时，得到活化后的透明质酸钠溶液；

[0138] 步骤III：量取31.8μL的5‑降冰片烯‑2‑甲胺(Nb‑NH2)溶液，并在搅拌下逐滴加入步骤II溶液，使得摩尔比Nb‑NH2:COOH＝1.0，搅拌反应16小时，加入40mL的纯水终止反应，将反应液移至截留分子量为8‑14kDa的透析袋中透析4天、冻干，即得到白色海绵状透明质酸降冰片烯(HA‑Nb)，4℃保存备用。

[0139] 关于海藻酸降冰片烯(Alg‑Nb)的合成方法为：

[0140] 步骤①：在常温、搅拌的条件下，将100mg的海藻酸钠溶于10mL、pH为6.5、100mM的MES缓冲溶液中，搅拌过夜使其完全溶解得到海藻酸钠溶液；

[0141] 步骤②：称取290.5mg、2.5mmoL的N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)和484.0mg、2.5mmoL的1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)‑碳二亚胺盐酸盐(EDC)，在搅拌的条件下加入步骤①制备的海藻酸钠溶液中，使得摩尔比NHS:EDC:COOH＝5:5:1，搅拌进行活化反应0.5小时，得到活化后的海藻酸钠溶液；

[0142] 步骤③：量取62.4μL的5‑降冰片烯‑2‑甲胺(Nb‑NH2)溶液，并在搅拌下逐滴加入步骤②溶液，使得摩尔比Nb‑NH2:COOH＝1.0，搅拌反应24小时，加入40mL的纯水终止反应，将反应液移至截留分子量为8‑14kDa的透析袋中透析4天、冻干，即得到白色海绵状海藻酸降冰片烯(Alg‑Nb)，4℃保存备用。

[0143] 关于聚乙二醇降冰片烯(PEG‑Nb)的合成方法为：

[0144] 步骤a：在常温、搅拌的条件下，将100mg、分子量10kDa的四臂聚乙二醇氨基溶于9.8mL、pH为9.0的PBS缓冲溶液中，搅拌10分钟使其完全溶解得到四臂聚乙二醇氨基溶液；

[0145] 步骤b：称取11.2mg的降冰片烯二酸酐(Nb‑COOH)粉末，在搅拌的条件下加入步骤a制备的四臂聚乙二醇氨基溶液，使得摩尔比Nb‑COOH:NH2＝1.0，降冰片烯二酸酐溶解过程中，监测反应液的pH值并用10M的NaOH溶液调控溶液的pH呈9.0，在常温、搅拌下反应16小时，加入40mL的纯水终止反应，将反应液移至截留分子量为8‑14kDa的透析袋中透析3天、冻干，即得到白色海绵状的聚乙二醇降冰片烯(PEG‑Nb)，4℃保存备用。

[0146] 关于RGD降冰片烯(RGD‑Nb)的合成方法为：

[0147] 步骤A：在常温、搅拌的条件下，将11mg的线性RGDS四肽(0.05mmoL的NH2)溶于3mL、pH为8.0的PBS缓冲溶液中，使其完全溶解得到RGD溶液；

[0148] 步骤B：称取100mg的NHS‑PEG‑Nb(分子量2k)溶于8mL、pH为8.0的PBS缓冲溶液中，在搅拌的条件下滴加入步骤A制备的RGD溶液，使得摩尔比NHS:NH2＝1.0，在无菌、常温、搅拌的条件下反应2小时，之后在4℃下采用截留分子量为1.5kDa的透析袋中透析2天、冻干，即得到白色海绵状RGD降冰片烯(RGD‑Nb)，4℃保存备用。

[0149] 结合附图对于实施例1中的产品做出分析如下：

[0150] 图4A‑B为本发明实施例1中制备的Col‑Tz的紫外可见吸收光谱和Col‑Nb的核磁图谱。由图4A紫外可见吸收光谱中Col‑Tz溶液在525nm处Abs＝0.164,带入标曲方程Y＝0.3985*X‑0.02315得X＝0.470，即Tz摩尔浓度为0.470mM。Col‑Tz:Tz＝1:1，Col的氨基摩尔数为1.82mmol/g，质量浓度为1mg/mL，Dof为0.470÷1.82×100％＝25.8％，由此计算得到产物Col‑Tz的接枝率为25.8％。由图4B核磁图谱计算得到Col‑Nb的接枝率为61.3％；

[0152] 图5A‑B为本发明实施例1中制备的HA‑Tz、HA‑Nb的核磁图谱和同样条件下重复3批次合成的HA‑Tz的接枝率。由图5A计算得到HA‑Tz的接枝率为13.8％，得到HA‑Nb的接枝率为15.3％。3批次合成的HA‑Tz的接枝率分别为13.8％、15.3％和16.5％。可见，本发明合成方法得到的HA‑Tz批次间差异可控。

[0153] 图6为本发明实施例1中制备的Alg‑Tz和Alg‑Nb的核磁图谱。由此计算得到Alg‑Tz的接枝率为24.8％，Alg‑Nb的接枝率为29.9％。

[0154] 图7A‑B为本发明实施例1中制备的PEG‑Tz和PEG‑Nb的核磁图谱，及同样条件下重复2批次合成的接枝率。由图7A计算得到PEG‑Tz的接枝率为72.0％，PEG‑Nb的接枝率为68.2％。2批次合成的PEG‑Tz的接枝率分别为72.0％和74.5％；由图7B看出2批次合成的PEG‑Nb的接枝率分别为68.7％和70.1％；可见，本发明合成方法得到的PEG‑Tz和PEG‑Nb批次间差异可控。

[0155] 图8A‑B为本发明实施例1中制备的RGD‑Nb的核磁图谱及同样条件下重复3批次合成RGD‑Nb的接枝率。由图8A核磁图中NHS消失峰计算得到RGD‑Nb的接枝率为96.0％。由图8B看出3批次合成的RGD‑Nb的接枝率分别为96.0％、94.5％和89.3％；可见，本发明合成方法得到的RGD‑Nb批次间差异可控。

[0156] 实施例2

[0157] 其中，关于四嗪修饰化合物中明胶四嗪、透明质酸四嗪、胶原蛋白四嗪、聚乙二醇四嗪、海藻酸四嗪的具体合成方法分别如下：

[0158] 关于明胶四嗪(Gel‑Tz)的合成方法为：

[0159] 步骤1：在50℃下，称取200mg的A型明胶溶于8mL、pH为8.0的PBS缓冲溶液中，充分搅拌溶解得到明胶溶液；

[0160] 步骤2：同实施例1，区别在于：摩尔比NHS:NH2＝0.5，在50℃、250rpm搅拌下反应6小时。

[0161] 关于胶原蛋白四嗪(Col‑Tz)的合成方法为：

[0162] 步骤i：在常温、250rpm搅拌的条件下，将100mg的重组人源化III型胶原蛋白溶于8mL、pH为8.0的PBS缓冲溶液中，充分搅拌溶解得到胶原蛋白溶液；

[0163] 步骤ii：同实施例1，区别在于：摩尔比NHS:NH2＝3.0，在常温、250rpm搅拌下反应24小时。

[0164] 关于透明质酸四嗪(HA‑Tz)的合成方法为：

[0165] 步骤I：在常温、250rpm搅拌的条件下，将500mg、分子量为400.2kDa的透明质酸钠溶于8mL、pH为5.5的MES缓冲溶液中，过夜搅拌使其完全溶解得到透明质酸钠溶液；

[0166] 步骤II：同实施例1，区别在于：摩尔比NHS:EDC:COOH＝1:1:1，搅拌进行活化反应1.0小时；

[0167] 步骤III：同实施例1，区别在于：摩尔比NH2：COOH＝0.5，在常温下、搅拌反应12小时。

[0168] 关于海藻酸四嗪(Alg‑Tz)的合成方法为：

[0169] 步骤①：在常温、搅拌的条件下，将500mg的海藻酸钠溶于8mL、pH为5.5、100mM的MES缓冲溶液中，搅拌过夜使其完全溶解得到海藻酸钠溶液；

[0170] 步骤②：同实施例1，区别在于：摩尔比NHS:EDC:COOH＝1:1:1，搅拌进行活化反应1.0小时；

[0171] 步骤③：同实施例1，区别在于：称取300mg的盐酸甲基四嗪胺，摩尔比NH2:COOH＝0.5，在常温、搅拌反应12小时。

[0172] 关于聚乙二醇四嗪(PEG‑Tz)的合成方法为：

[0173] 步骤a：在常温、搅拌的条件下，将200mg、分子量为5kDa的四臂聚乙二醇氨基溶于9mL、pH为8.0的PBS缓冲溶液中，250rpm下搅拌10分钟使其完全溶解得到四臂聚乙二醇氨基溶液；

[0174] 步骤b：同实施例1，区别在于：摩尔比NHS:NH2＝0.5，在常温、搅拌下反应8小时。

[0175] 关于RGD四嗪(RGD‑Tz)的合成方法为：

[0176] 步骤A：在常温、搅拌的条件下，将22mg的线性RGDS四肽溶于3mL、pH为8.0的PBS缓冲溶液中，使其完全溶解得到RGD溶液；

[0177] 步骤B：同实施例1，区别在于：PBS缓冲溶液pH为8.0，摩尔比NHS:NH2＝0.5，在常温、搅拌下反应12小时。

[0178] 其中，关于降冰片烯修饰化合物包括明胶降冰片烯、透明质酸降冰片烯、胶原蛋白降冰片烯、聚乙二醇降冰片烯、海藻酸降冰片烯、RGD降冰片烯，合成方法如下：

[0179] 关于明胶降冰片烯(Gel‑Nb)的合成方法为：

[0180] 步骤1：在50℃下，将100mg的A型明胶溶于9.5mL、pH为8.0的PBS缓冲溶液中，充分搅拌溶解得到明胶溶液；

[0181] 步骤2：同实施例1，区别在于：摩尔比Nb‑COOH:NH2＝1.0，调整反应液的pH呈8.0，在50℃、搅拌下反应9小时。

[0182] 关于胶原蛋白降冰片烯(Col‑Nb)的合成方法为：

[0183] 步骤i：在常温、搅拌的条件下，将1000mg的重组人源化III型胶原蛋白溶于9.6mL、pH为8.0的PBS缓冲溶液中，充分搅拌溶解得到胶原蛋白溶液；

[0184] 步骤ii：同实施例1，区别在于：摩尔比Nb‑COOH:NH2＝1.0，调整反应液的pH呈8.0，在常温、搅拌下反应9小时。

[0185] 关于透明质酸降冰片烯(HA‑Nb)的合成方法为：

[0186] 步骤I：在常温、搅拌的条件下，将500mg、分子量为400.2kDa的透明质酸钠溶于10mL、pH为5.0、100mM的MES缓冲溶液中，搅拌过夜使其完全溶解得到透明质酸钠溶液；

[0187] 步骤II：同实施例1，区别在于：摩尔比NHS:EDC:COOH＝1:1:1，搅拌进行活化反应1.0小时；

[0188] 步骤III：同实施例1，区别在于：量取79.5μL的5‑降冰片烯‑2‑甲胺(Nb‑NH2)溶液，摩尔比Nb‑NH2:COOH＝0.5，搅拌反应8小时。

[0189] 关于海藻酸降冰片烯(Alg‑Nb)的合成方法为：

[0190] 步骤①：在常温、搅拌的条件下，将500mg的海藻酸钠溶于10mL、pH为5.0、100mM的MES缓冲溶液中，搅拌过夜使其完全溶解得到海藻酸钠溶液；

[0191] 步骤②：同实施例1，区别在于：摩尔比NHS:EDC:COOH＝1:1:1，搅拌进行活化反应1.0小时；

[0192] 步骤③：同实施例1，区别在于：量取156μL的5‑降冰片烯‑2‑甲胺(Nb‑NH2)溶液，摩尔比Nb‑NH2:COOH＝0.5，搅拌反应8小时。

[0193] 关于聚乙二醇降冰片烯(PEG‑Nb)的合成方法为：

[0194] 步骤a：在常温、搅拌的条件下，将100mg、分子量5kDa的四臂聚乙二醇氨基溶于9.8mL、pH为8.0的PBS缓冲溶液中，搅拌10分钟使其完全溶解得到四臂聚乙二醇氨基溶液；

[0195] 步骤b：同实施例1，区别在于：摩尔比Nb‑COOH:NH2＝0.5，调控溶液的pH呈8.0，在常温、搅拌下反应6小时。

[0196] 关于RGD降冰片烯(RGD‑Nb)的合成方法为：

[0197] 步骤A：在常温、搅拌的条件下，将11mg的线性RGDS四肽(0.05mmoL的NH2)溶于3mL、pH为9.0的PBS缓冲溶液中，使其完全溶解得到RGD溶液；

[0198] 步骤B：同实施例1，区别在于：称取300mg的NHS‑PEG‑Nb(分子量2k)溶于8mL、pH为9.0的PBS缓冲溶液中，摩尔比NHS:NH2＝3.0，在无菌、常温、搅拌的条件下反应12小时。

[0199] 结合附图对于实施例2中的产品做出分析如下：

[0200] 图9A‑B为不同浓度Tz基团在525nm处吸光度的标准曲线和本发明实施例2中制备的Gel‑Tz的紫外可见吸收光谱图。由图中可以看出，Gel‑Tz溶液在525nm处Abs＝0.135,带入标曲方程Y＝0.3985*X‑0.02315得X＝0.397，即Tz摩尔浓度为0.397mM；Gel‑Tz的质量浓度为1mg/mL，对应的Gel中的氨基摩尔数为2.506mmol/g；由此计算得到产物Gel‑Tz的接枝率Dof为0.397÷2.506×100％＝15.8％。

[0201] 图10A‑B为不同浓度Tz基团在525nm处吸光度的标准曲线和本发明实施例2中制备的Col‑Tz的紫外可见吸收光谱图。由图中可以看出，Col‑Tz溶液在525nm处Abs＝0.301,带入标曲方程Y＝0.3985*X‑0.02315得X＝0.813，即Tz摩尔浓度为0.813mM；Col‑Tz的质量浓度为1mg/mL，对应的Col中的氨基摩尔数为1.82mmol/g；由此计算得到产物Col‑Tz的接枝率Dof为0.813÷1.82×100％＝44.6％。

[0202] 图11A‑B为不同浓度Tz基团在525nm处吸光度的标准曲线和本发明实施例2中制备的HA‑Tz的紫外可见吸收光谱图。由图中可以看出，HA‑Tz溶液在525nm处Abs＝0.115,带入标曲方程Y＝0.3985*X‑0.02315得X＝0.345，即Tz摩尔浓度为0.345mM；HA‑Tz的质量浓度为1mg/mL，对应的HA中的羧基摩尔数为2.48mmol/g；由此计算得到产物HA‑Tz的接枝率Dof为
0.345÷2.48×100％＝13.9％。

[0203] 图12A‑B为不同浓度Tz基团在525nm处吸光度的标准曲线和本发明实施例2中制备的Alg‑Tz的紫外可见吸收光谱图。由图中可以看出，Alg‑Tz溶液在525nm处Abs＝0.417,带入标曲方程Y＝0.3985*X‑0.02315得X＝1.106，即Tz摩尔浓度为1.106mM；Alg‑Tz的质量浓度为1mg/mL，对应的Alg中的羧基摩尔数为5.05mmol/g；由此计算得到产物Alg‑Tz的接枝率Dof为1.106÷5.05×100％＝21.9％。

[0204] 实施例3

[0205] 其中，关于四嗪修饰化合物中明胶四嗪、透明质酸四嗪、胶原蛋白四嗪、聚乙二醇四嗪、海藻酸四嗪的具体合成方法分别如下：

[0206] 关于明胶四嗪(Gel‑Tz)的合成方法为：

[0207] 步骤1：在60℃下，称取33.3mg的B型明胶溶于8mL、pH为10.0的PBS缓冲溶液中，充分搅拌溶解得到明胶溶液；

[0208] 步骤2：同实施例1，区别在于：摩尔比NHS:NH2＝3.0，在60℃、250rpm搅拌下反应24小时。

[0209] 关于胶原蛋白四嗪(Col‑Tz)的合成方法为：

[0210] 步骤i：在常温、250rpm搅拌的条件下，将200mg的重组人源化III型胶原蛋白溶于8mL、pH为10.0的PBS缓冲溶液中，充分搅拌溶解得到胶原蛋白溶液；

[0211] 步骤ii：同实施例1，区别在于：摩尔比NHS:NH2＝0.5，在常温、250rpm搅拌下反应6小时。

[0212] 关于透明质酸四嗪(HA‑Tz)的合成方法为：

[0213] 步骤I：在常温、250rpm搅拌的条件下，将50mg、分子量为1000kDa的透明质酸钠溶于8mL、pH为4.5的MES缓冲溶液中，过夜搅拌使其完全溶解得到透明质酸钠溶液；

[0214] 步骤II：同实施例1，区别在于：摩尔比NHS:EDC:COOH＝10:10:1，搅拌进行活化反应2.0小时；

[0215] 步骤III：同实施例1，区别在于：摩尔比NH2：COOH＝2.0，在常温下、搅拌反应48小时。

[0216] 关于海藻酸四嗪(Alg‑Tz)的合成方法为：

[0217] 步骤①：在常温、搅拌的条件下，将50mg的海藻酸钠溶于8mL、pH为4.5、100mM的MES缓冲溶液中，搅拌过夜使其完全溶解得到海藻酸钠溶液；

[0218] 步骤②：同实施例1，区别在于：摩尔比NHS:EDC:COOH＝10:10:1，搅拌进行活化反应2.0小时；

[0219] 步骤③：同实施例1，区别在于：摩尔比NH2:COOH＝2.0，在常温、搅拌反应48小时。

[0220] 关于聚乙二醇四嗪(PEG‑Tz)的合成方法为：

[0221] 步骤a：在常温、搅拌的条件下，将33.3mg、分子量20kDa的四臂聚乙二醇氨基溶于9mL、pH为10.0的PBS缓冲溶液中，250rpm下搅拌10分钟使其完全溶解得到四臂聚乙二醇氨基溶液；

[0222] 步骤b：同实施例1，区别在于：摩尔比NHS:NH2＝3.0，在常温、搅拌下反应32小时。

[0223] 关于RGD四嗪(RGD‑Tz)的合成方法为：

[0224] 步骤A：在常温、搅拌的条件下，将11mg的环形c(RGDfK)多肽溶于3mL、pH为9.0的PBS缓冲溶液中，使其完全溶解得到RGD溶液；

[0225] 步骤B：同实施例1，区别在于：称取300mg的NHS‑PEG‑Tz(分子量为2K)溶于8mL、pH为9.0的PBS缓冲溶液中，摩尔比NHS:NH2＝3.0，在常温、搅拌下反应24小时。

[0226] 其中，关于降冰片烯修饰化合物包括明胶降冰片烯、透明质酸降冰片烯、胶原蛋白降冰片烯、聚乙二醇降冰片烯、海藻酸降冰片烯、RGD降冰片烯的合成方法如下：

[0227] 关于明胶降冰片烯(Gel‑Nb)的合成方法为：

[0228] 步骤1：在60℃下，将200mg的B型明胶溶于9.5mL、pH为10.0的PBS缓冲溶液中，充分搅拌溶解得到明胶溶液；

[0229] 步骤2：同实施例1，区别在于：摩尔比Nb‑COOH:NH2＝5.0，调整反应液的pH呈10.0，在60℃、搅拌下反应48小时。

[0230] 关于胶原蛋白降冰片烯(Col‑Nb)的合成方法为：

[0231] 步骤i：在常温、搅拌的条件下，将200mg的重组人源化III型胶原蛋白溶于9.6mL、pH为10.0的PBS缓冲溶液中，充分搅拌溶解得到胶原蛋白溶液；

[0232] 步骤ii：同实施例1，区别在于：摩尔比Nb‑COOH:NH2＝5.0，调整反应液的pH呈10.0，在常温、搅拌下反应48小时。

[0233] 关于透明质酸降冰片烯(HA‑Nb)的合成方法为：

[0234] 步骤I：在常温、搅拌的条件下，将50mg、分子量为1000kDa的透明质酸钠溶于10mL、pH为6.0、100mM的MES缓冲溶液中，搅拌过夜使其完全溶解得到透明质酸钠溶液；

[0235] 步骤II：同实施例1，区别在于：摩尔比NHS:EDC:COOH＝10:10:1，搅拌进行活化反应2.0小时；

[0236] 步骤III：同实施例1，区别在于：摩尔比Nb‑NH2:COOH＝2.0，搅拌反应48小时。

[0237] 关于海藻酸降冰片烯(Alg‑Nb)的合成方法为：

[0238] 步骤①：在常温、搅拌的条件下，将50mg的海藻酸钠溶于10mL、pH为6.0、100mM的MES缓冲溶液中，搅拌过夜使其完全溶解得到海藻酸钠溶液；

[0239] 步骤②：同实施例1，区别在于：摩尔比NHS:EDC:COOH＝10:10:1，搅拌进行活化反应2.0小时；

[0240] 步骤③：同实施例1，区别在于：摩尔比Nb‑NH2:COOH＝2.0，搅拌反应48小时。

[0241] 关于聚乙二醇降冰片烯(PEG‑Nb)的合成方法为：

[0242] 步骤a：在常温、搅拌的条件下，将100mg、分子量20kDa的四臂聚乙二醇氨基溶于9.8mL、pH为10.0的PBS缓冲溶液中，搅拌10分钟使其完全溶解得到四臂聚乙二醇氨基溶液；

[0243] 步骤b：同实施例1，区别在于：摩尔比Nb‑COOH:NH2＝2.0，调控溶液的pH呈10.0，在常温、搅拌下反应48小时。

[0244] 关于RGD降冰片烯(RGD‑Nb)的合成方法为：

[0245] 步骤A：在常温、搅拌的条件下，将15.09mg的环形c(RGDfK)多肽(0.05mmoL的NH2)溶于2.09mL、pH为7.0的PBS缓冲溶液中，使其完全溶解得到RGD溶液；

[0246] 步骤B：同实施例1，区别在于：称取50mg的NHS‑PEG‑Nb(分子量2k)溶于13mL、pH为7.0的PBS缓冲溶液中，摩尔比NHS:NH2＝0.5，在无菌、常温、搅拌的条件下反应24小时。

[0247] 结合附图对于实施例3中的产品做出分析如下：

[0248] 图13A‑B为本发明实施例3中制备的Gel‑Tz和Gel‑Nb的核磁图谱，及3批次合成的Gel‑Tz的紫外全波长扫描及相应的接枝率。由图13A计算得到产物Gel‑Tz的接枝率为25.2％，产物Gel‑Nb的接枝率为51.6％。此外由图13B看出，相同制备条件下，3批次合成的Gel‑Tz的接枝率分别为23.68％、25.77％和26.02％。由此可见，本发明合成的Gel‑Tz的批次间差异可忽略不计。

[0249] 图14：为本发明实施例3中制备的HA‑Nb的核磁图谱，由此计算得到产物HA‑Nb的接枝率为51.3％。

[0250] 图15：为本发明实施例3中制备的RGD‑Nb的核磁图谱(环肽)，由此计算得到产物RGD‑Nb的接枝率为83.0％。

[0251] 图16A‑B不同浓度Tz基团在525nm处吸光度的标准曲线和本发明实施例3中制备的PEG‑Tz的紫外可见吸收光谱图。由图中可以看出，PEG‑Tz溶液在525nm处Abs＝0.092,带入标曲方程Y＝0.3985*X‑0.02315得X＝0.288，即Tz摩尔浓度为0.288mM；PEG‑Tz的质量浓度为1mg/mL，对应的PEG中的氨基摩尔数为0.40mmol/g；由此计算得到产物PEG‑Tz的接枝率Dof为0.288÷0.40×100％＝72.0％。

[0252] 实施例4：单组分

[0253] (1)关于透明质酸四嗪(HA‑Tz)的合成方法：与实施例1中的合成方法一样。

[0254] (2)关于透明质酸降冰片烯(HA‑Nb)的合成方法：与实施例1中的合成方法一样。

[0255] (3)称取10.0mg步骤(1)中HA‑Tz溶解于0.45mL、10mM的PBS缓冲溶液中，无菌处理，得到2.77wt％无菌的HA‑Tz溶液；

[0256] (4)称取9.0mg步骤(2)中HA‑Nb溶解于0.36mL、10mM的PBS缓冲溶液中，无菌处理，得到1.23wt％无菌的HA‑Nb溶液；

[0257] (5)将步骤(3)和步骤(4)中两种溶液及PBS溶液，以1：1体积比混合均匀，移入0.5wt％的PNIPAM预处理过的细胞培养板中，37℃静止3小时后，置于4℃下10‑30分钟，即可取出所述浓度为2.0wt％的透明质酸单组分水凝胶膜片。

[0258] 同理，当步骤(3)中HA‑Tz溶液浓度为2.08wt％；步骤(4)中HA‑Nb溶液浓度为0.92wt％；步骤(5)得到1.5wt％的透明质酸单组分水凝胶膜片；

[0259] 当步骤(3)中HA‑Tz溶液浓度为1.39wt％；步骤(4)中HA‑Nb溶液浓度为0.61wt％；步骤(5)得到1.0wt％的透明质酸单组分水凝胶膜片；

[0260] 当步骤(3)中HA‑Tz溶液浓度为1.04wt％；步骤(4)中HA‑Nb溶液浓度为0.46wt％；步骤(5)得到0.75wt％的透明质酸单组分水凝胶膜片；

[0261] 当步骤(3)中HA‑Tz溶液浓度为0.70wt％；步骤(4)中HA‑Nb溶液浓度为0.30wt％；步骤(5)得到0.5wt％的透明质酸单组分水凝胶膜片。

[0262] 结合附图对于实施例4中的产品做出分析如下：

[0263] 图17：为本发明实施4中制备的透明质酸单组分水凝胶膜片的照片；由图中可以看出，浓度为1.5wt％的透明质酸单组分水凝胶膜片具有良好的形貌。

[0264] 图18A‑B为本发明实施4中制备的透明质酸单组分水凝胶膜片不同浓度的溶胀曲线和含水量；由图18A可以看出所有浓度的透明质酸水凝胶膜片10小时达到平衡，浓度越大溶胀越大；同时由图18B可以看出所有浓度水凝胶膜片的含水量都超过98％，各浓度之间差异性不显著。

[0265] 图19A‑B为本发明实施例4中制备的透明质酸单组分水凝胶膜片不同浓度的断面SEM图片和孔径；由图19A中可看出，浓度越大，孔径越小，孔密度越大；由图19A中可看出，1.0wt％的透明质酸单组分水凝胶膜片的孔径达到187μm。

[0266] 图20A‑D为本发明实施例4中制备的透明质酸单组分水凝胶膜片的不同浓度的储能模量、模量应变图、压缩应变图及杨氏模量；由图20A看出，HA的浓度越大，储能模量G’越大，水凝胶膜片的硬度越大；由图20B看出，储能模量在应变小于100％的范围内基本保持不变；由图20C看出，浓度越大，压缩杨氏模量越大，即压缩水凝胶膜片破损时所需的应力越大；由图20D看出，水凝胶膜片溶胀平衡后，浓度越大弹性模量越大，即浓度越大水凝胶膜片越硬。

[0267] 实施例5：单组分

[0268] (1)关于海藻酸四嗪(Alg‑Tz)的合成方法：与实施例1中的合成方法一样。

[0269] (2)关于海藻酸降冰片烯(Alg‑Nb)的合成方法：与实施例1中的合成方法一样。

[0270] (3)称取7.5mg步骤(1)中Alg‑Tz溶解于0.50mL、10mM的PBS缓冲溶液中，无菌处理，得到1.5wt％无菌的Alg‑Tz溶液；

[0271] (4)称取7.5mg步骤(2)中Alg‑Nb溶解于0.5mL、10mM的PBS缓冲溶液中，无菌处理，得到1.5wt％无菌的Alg‑Nb溶液；

[0272] (5)将步骤(3)和步骤(4)两种溶液以1.46:1的体积比混合均匀，移入2wt％的PNIPAM预处理过的细胞培养板中，37℃静止3小时后，置于4℃下10‑30分钟，即可取出所述浓度为1.5wt％的的海藻酸单组分水凝胶膜片。

[0273] 同理，当步骤(3)中HA‑Tz溶液浓度为2.0wt％；步骤(4)中HA‑Nb溶液浓度为2.0wt％；步骤(5)得到2.0wt％的透明质酸单组分水凝胶膜片；

[0274] 当步骤(3)中HA‑Tz溶液浓度为1.0wt％；步骤(4)中HA‑Nb溶液浓度为1.0wt％；步骤(5)得到1.0wt％的透明质酸单组分水凝胶膜片；

[0275] 当步骤(3)中HA‑Tz溶液浓度为0.75wt％；步骤(4)中HA‑Nb溶液浓度为0.75wt％；步骤(5)得到0.75wt％的透明质酸单组分水凝胶膜片；

[0276] 当步骤(3)中HA‑Tz溶液浓度为0.50wt％；步骤(4)中HA‑Nb溶液浓度为0.50wt％；步骤(5)得到0.5wt％的透明质酸单组分水凝胶膜片。

[0277] 结合附图对于实施例5中的产品做出分析如下：

[0278] 图21A‑B为本发明实施5中制备的海藻酸单组分水凝胶膜片的溶胀曲线和含水量；由图21A可以看出，所有浓度海藻酸水凝胶膜片约8小时达到平衡溶胀，海藻酸的浓度越大，溶胀度越大，但含水量越低；由图21B可以看出，海藻酸单组分水凝胶膜片的含水量随浓度变化的趋势与透明质酸的截然不同，这是因为透明质酸的吸水能力远大于海藻酸。

[0279] 图22A‑C为本发明实施例5中制备的海藻酸单组分水凝胶膜片的断面SEM、孔径、水凝胶形成过程图片。由图22A可以看出，海藻酸的浓度越大，形成的水凝胶孔径约小，孔密度越大，形成的水凝胶呈玫红色。由图22B可以看出，1.0wt％的海藻酸膜片孔径约为356微米。由图22C可以看出，海藻酸水凝胶能在2小时内成型。

[0280] 图23A‑C为本发明实施例5中制备的海藻酸单组分水凝胶膜片照片、剪切应变曲线和弹性模量随溶胀时间的变化。图23A中膜片的照片是浓度为1.5wt％的海藻酸。由图23B可以看出，海藻酸浓度越大，压缩杨氏模量越大，即压缩水凝胶膜片破损时所需的应力越大；由图23C可以看出，水凝胶膜片溶胀平衡后，浓度越大弹性模量越大，即浓度越大水凝胶膜片越硬。

[0281] 实施例6：双组分

[0282] (1)关于明胶四嗪(Gel‑Tz)的合成方法：与实施例1中的合成方法一样。

[0283] (2)关于聚乙二醇降冰片烯(PEG‑Nb)的合成方法：与实施例1中的合成方法一样。

[0284] (3)称取10.0mg步骤(1)中Gel‑Tz溶解于0.1mL、10mM的PBS缓冲溶液中，无菌处理，得到10.0wt％无菌的Gel‑Tz溶液；

[0285] (4)称取14.5mg步骤(2)中PEG‑Nb溶解于0.1mL、10mM的PBS缓冲溶液中，无菌处理，得到14.5wt％无菌的PEG‑Nb溶液；

[0286] (5)将步骤(3)和步骤(4)两种溶液以1：1体积比混合均匀，移入1wt％的PNIPAM预处理过的细胞培养板中，37℃静止3小时后，置于4℃下10‑30分钟，即可取出所述的Gel/PEG双组分水凝胶膜片，其中Gel‑Tz的终浓度为5.0wt％，PEG‑Nb的终浓度为7.25wt％。

[0287] 结合附图对于实施例6中的产品做出分析如下：

[0288] 图24A‑D为本发明实施例6中制备的Gel/PEG双组分水凝胶膜片的模量随应变的变化图、粘度随剪切速率变化曲线、形成的水凝胶膜片和模量随应变交替变化图。由图24A可以看出，Gel/PEG双组分水凝胶膜片在应变接近10％时，就能出现耗损模量大于储能模量的状态，即水凝胶膜片从固态转变为可流动状态；由图24B可以看出，该水凝胶膜片的粘度随剪切速率的增大而降低，呈非牛顿流体；由图24D可以看出，该水凝胶膜片发生相变所需的应变较小，当应变在1％和1000％之间交替变化时，水凝胶的耗损模量和储能模量也能交替变化，即水凝胶膜片可根据应变发生相变。

[0289] 实施例7：双组分

[0290] (1)关于聚乙二醇四嗪(PEG‑Tz)的合成方法：与实施例3中的合成方法一样。

[0291] (2)关于透明质酸降冰片烯(HA‑Nb)的合成方法：与实施例2中的合成方法一样。

[0292] (3)称取10.0mg步骤(1)中PEG‑Tz溶解于0.2mL、10mM的PBS缓冲溶液中，无菌处理，得到5.0wt％无菌的PEG‑Tz溶液；

[0293] (4)称取4mg步骤(2)中HA‑Nb溶解于0.2mL、10mM的PBS缓冲溶液中，无菌处理，得到2.0wt％无菌的HA‑Nb溶液；

[0294] (5)将步骤(3)和步骤(4)两种溶液以1：1体积比混合均匀，移入0.5wt％的PNIPAM预处理过的细胞培养板中，37℃静止3小时后，置于4℃下10‑30分钟，即可取出所述的HA/PEG双组分水凝胶膜片，其中PEG‑Tz的终浓度为2.5wt％，HA‑Nb的终浓度为1.0wt％。

[0295] 结合附图对于实施例7中的产品做出分析如下：

[0296] 图25A‑D为本发明实施例7中制备的HA/PEG双组分水凝胶膜片的模量随应变的变化图、粘度随剪切速率变化曲线、模量随应变交替变化图和形成的水凝胶膜片。由图25A可以看出，HA/PEG双组分水凝胶膜片在应变小于100％时，就能出现耗损模量大于储能模量的状态，即水凝胶膜片从固态转变为可流动状态；由图25B可以看出，该水凝胶膜片的粘度随剪切速率的增大而降低，呈非牛顿流体；该水凝胶膜片发生相变所需的应变较小；由图25C可以看出，当应变在1％和1000％之间交替变化时，水凝胶膜片的耗损模量和储能模量也能交替变化，即水凝胶膜片可根据应变发生相变。

[0297] 实施例8：双组分

[0298] (1)关于海藻酸四嗪(Alg‑Tz)的合成方法：与实施例1中的合成方法一样。

[0299] (2)关于海藻酸降冰片烯(Alg‑Nb)的合成方法：与实施例1中的合成方法一样。

[0300] 关于RGD降冰片烯(RGD‑Nb)的合成方法：与实施例1中的合成方法一样。

[0301] (3)称取4mg步骤(1)中Alg‑Tz溶解于0.2mL、10mM的PBS缓冲溶液中，无菌处理，得到2.0wt％无菌的Alg‑Tz溶液；

[0302] (4)称取2mg步骤(2)中Alg‑Nb溶解于0.1mL、10mM的PBS缓冲溶液中，无菌处理，得到2.0wt％无菌的Alg‑Nb溶液；称取3.2mg步骤(2)中RGD‑Nb溶解于0.1mL、10mM的PBS缓冲溶液中，无菌处理，得到3.2wt％无菌的RGD‑Nb溶液；将上述两种溶液混合均匀，得到Alg‑Nb和RGD‑Nb混合溶液；

[0303] (5)将步骤(3)和步骤(4)两种溶液以1:1体积比混合均匀，移入0.5wt％的PNIPAM预处理过的细胞培养板中，37℃细胞培养箱中静止3小时后，置于4℃下10‑30分钟，即可取出所述的Alg/RGD双组分水凝胶膜片，其中Alg(包含Alg‑Tz和Alg‑Nb)的终浓度为1.0wt％，RGD‑Nb的终浓度为0.8wt％。

[0304] 结合附图对于实施例8中的产品做出分析如下：

[0305] 图26A‑C为本发明实施例8中制备的Alg/RGD双组分水凝胶膜片的模量随应变的变化图、应力松弛释放曲线和粘度随剪切速率变化曲线。由图26A可以看出，Alg/RGD双组分水凝胶膜片在应变小于100％时，其储能模量几乎不变，说明水凝胶膜片保持胶状且硬度几乎不变，该水凝胶膜片发生相变所需的应变较大；由图26B可以看出，该水凝胶膜片能够快速的响应应力，具有较短的应力松弛释放时间；由图26C可以看出，该水凝胶膜片的粘度随剪切速率的增大而降低，呈非牛顿流体。

[0306] 实施例9：三组分

[0307] (1)关于胶原蛋白四嗪(Col‑Tz)的合成方法：与实施例2中的合成方法一样。

[0308] (2)关于透明质酸降冰片烯(HA‑Nb)的合成方法：与实施例1中的合成方法一样。

[0309] 关于聚乙二醇降冰片烯(PEG‑Nb)的合成方法：与实施例1中的合成方法一样。

[0310] (3)称取10.0mg步骤(1)中Col‑Tz溶解于0.05mL、10mM的PBS缓冲溶液中，无菌处理，得到20.0wt％无菌的Col‑Tz溶液；

[0311] (4)称取5.0mg步骤(2)中HA‑Nb溶解于0.20mL、10mM的PBS缓冲溶液中，无菌处理，得到2.5wt％无菌的HA‑Nb溶液；称取14.5mg步骤(2)中PEG‑Nb溶解于0.10mL、10mM的PBS缓冲溶液中，无菌处理，得到14.5wt％无菌的PEG‑Nb溶液；将上述两种溶液混合均匀，得到HA‑Nb和PEG‑Nb混合溶液；

[0312] (5)将步骤(3)和步骤(4)两种溶液以1：6体积比混合均匀，移入0.5wt％的PNIPAM预处理过的细胞培养板中，37℃细胞培养箱静止3小时后，置于4℃下10‑30分钟，即可取出所述的Col/HA/PEG三组分水凝胶膜片，其中Col‑Tz的终浓度为2.86wt％，HA‑Nb的终浓度为1.43wt％，PEG‑Nb的终浓度为4.12wt％。

[0313] 结合附图对于实施例9中的产品做出分析如下：

[0314] 图27A‑B为本发明实施例9中制备的Col/HA/PEG三组分水凝胶膜片的模量随应变的变化图和模量随应变交替变化图。由图27A可以看出，Col/HA/PEG三组分水凝胶膜片在应变小于100％时，其储能模量几乎不变，说明水凝胶膜片保持胶状且硬度几乎不变；由图27B可以看出，该水凝胶膜片发生相变所需的应变较大，在应变为1000％时，水凝胶膜片的耗损模量大于储能模量，即水凝胶膜片呈可流动状态。

[0315] 图28为本发明实施例4‑9中制备的水凝胶膜片及细胞活死染色的荧光照片。其中，实施例4和实施例5中用的水凝胶膜片为浓度1.5wt％。由图中可以看出，水凝胶膜片都能很好的成型，不同组成的水凝胶膜片，颜色外观会略有差别。当在步骤5水凝胶膜片制备的过程中，将步骤3中的混合溶液和步骤4中的混合溶液混合均匀，之后再与原代肝实质细胞混合均匀，移入细胞培养板中，37℃下静止0.5‑3小时后，加入培养基，置于细胞培养箱中，72小时后采用活/死细胞染色试剂盒(Calcein AM,PI法)对水凝胶膜片中细胞进行染色，之后采用倒置荧光显微镜观察。采用商售的GelMA制备水凝胶膜片为对照，可以看出本发明制备的水凝胶膜片具有良好的生物相容性，活细胞的比例均大于80％，而GelMA水凝胶膜片中活细胞的比例仅为41.3％。

[0316] 通过实施例1‑9可以看出，合成的各种四嗪修饰化合物和降冰片烯化合物之间可以自由组合，得到高度定制化的水凝胶膜片，实现组分、细胞黏附位点、硬度、孔径、粘弹性、含水量、溶胀率等不同性质的水凝胶膜片。这些水凝胶膜片具有优异的生物相容性，在生物医药领域具有广泛的应用场景。

[0317] 上面结合实施例和附图对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。