技术领域
[0001] 本发明属于凝血制剂技术领域，涉及一种血小板活性检测试剂及其制备方法和应用。
相关背景技术
[0002] 动脉粥样硬化血栓形成是影响心、脑血管和外周动脉的全身系统性疾病。血小板在动脉粥样硬化血栓形成和发展中起着重要的作用。抗血小板药物是冠心病、脑血管病、高血压和糖尿病等疾病的重要用药之一，抗血小板药物的疗效的监测对指导临床合理用药具有重要意义。
[0003] 目前临床上主要通过检测血小板的活性来反映抗血小板药物的疗效。常见的对于血小板活性的检测方法有光学比浊法、凝固法等。光学比浊法(LTA)的具体方法是：离心收集富血小板血浆，加入不同途径的激活剂后促进血小板的聚集。该技术应用较早，自动化程度正逐步升高。但是，其操作复杂，影响因素多，稳定性较差。而且，血液经过反复离心会严重破坏血小板的聚集功能，因此重复测定结果准确性差，与临床事件的相关性收到一些质疑。
[0004] 血栓弹力图法(凝固法)的具体方法：仅使用纤维蛋白激活剂检测得到MAf，即只有纤维蛋白的MA值，使用纤维蛋白激活剂及血小板激活剂检测血小板的功能，得到MAADP值，使用活化凝血试剂激活全部血小板所产生的最大血块强度(MAt)。然后计算血小板的抑制率，计算公式：
[0005] 其中，MApi是MAADP。
[0006] 但该方法中，血小板检测要分别对纤维蛋白激活试剂、血小板激活试剂分别进行复溶后之后进行加样检测得到MAf及MAADP，同时进行活化凝血试剂的检测得到MAt，操作繁琐，且抑制率由三种检测结果计算得到，误差加大，准确性较低。
具体实施方式
[0045] 以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
[0046] 实施例1
[0047] 一种血小板活性检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
[0048] 步骤一、制备冻干保护体系：在50mM heps缓冲液中加入聚乙烯基吡咯烷酮、氯化钠、海藻糖、牛血清白蛋白，并将pH值调整至7.2，获得冻干保护体系，其中，聚乙烯基吡咯烷酮、氯化钠、海藻糖、牛血清白蛋白分别占冻干保护体系的比例为：0.5％的聚乙烯基吡咯烷酮(W/V)、0.9％氯化钠(W/V)、10％的海藻糖(W/V)、0.5％的牛血清白蛋白(W/V)；
[0049] 步骤二、制备原液：在冻干保护体系中加入蛇毒凝血酶、重组活化凝血十三因子、二磷酸腺苷钠盐，其中，蛇毒凝血酶、重组活化凝血十三因子、二磷酸腺苷钠盐各自在试剂原液中的终浓度为：40BU/ml蛇毒凝血酶、100μg/ml的重组活化凝血十三因子、50μM二磷酸腺苷钠盐，获得试剂原液；
[0050] 步骤三、混合冻干：将试剂原液分装于西林瓶中(20μL/瓶、100μL/瓶)，进行混合冻干，获得血小板活性检测试剂。
[0051] 实施例2
[0052] 一种血小板活性检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
[0053] 步骤一、制备冻干保护体系：在20mM tris缓冲液中加入甘露醇、氯化钠、蔗糖、酪蛋白，并将pH值调整至7.2，获得冻干保护体系，其中，甘露醇、氯化钠、蔗糖、酪蛋白分别占冻干保护体系的比例为：2.5％的甘露醇(W/V)、0.9％氯化钠(W/V)、5％的蔗糖(W/V)、1.0％酪蛋白(W/V)，并将pH值调整至6.98，获得冻干保护体系；
[0054] 步骤二、制备原液：在冻干保护体系中加入重组巴曲酶、人活化凝血十三因子、二磷酸腺苷，其中，重组巴曲酶、人活化凝血十三因子、二磷酸腺苷各自在试剂原液中的终浓度为：120BU/ml重组巴曲酶、60μg/ml的人活化凝血十三因子、150μM二磷酸腺苷，获得试剂原液；
[0055] 步骤三、混合冻干：将试剂原液分装于西林瓶中(20μL/瓶、100μL/瓶)，进行混合冻干，获得血小板活性检测试剂。
[0056] 实施例3
[0057] 一种血小板活性检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
[0058] 步骤一、制备冻干保护体系：在20mM PBS缓冲液中加入聚乙烯基吡咯烷酮、氯化钠、蔗糖、牛血清白蛋白，并将pH值调整至7.2，获得冻干保护体系，其中，聚乙烯基吡咯烷酮、氯化钠、蔗糖、牛血清白蛋白分别占冻干保护体系的比例为：1％的聚乙烯基吡咯烷酮(W/V)、0.9％氯化钠(W/V)、7.5％的蔗糖(W/V)、1.5％牛血清白蛋白(W/V)，并将pH值调整至7.01，获得冻干保护体系；
[0059] 步骤二、制备原液：在冻干保护体系中加入蛇毒凝血酶、人活化凝血十三因子、二磷酸腺苷钠盐，其中，蛇毒凝血酶、人活化凝血十三因子、二磷酸腺苷钠盐各自在试剂原液中的终浓度为：150BU/ml蛇毒凝血酶、200μg/ml的人活化凝血十三因子、120μM二磷酸腺苷钠盐，获得试剂原液；
[0060] 步骤三、混合冻干：将试剂原液分装于西林瓶中(20μL/瓶、100μL/瓶)，进行混合冻干，获得血小板活性检测试剂。
[0061] 效果例
[0062] 1、对实施例1‑3制得的血小板活性检测试剂及参比试剂进行有效性、重复性检测，具体检测方法如下：
[0063] (1)有效性检测方法：分别领取实施例1‑3制得的血小板活性检测试剂及参比试剂(重庆鼎润公司生产的血栓弹力图试验ADP试剂(凝固法))配合血栓弹力图仪对全血样本进行检测。参比试剂检测指标为抑制率(ADP％)，实施例1‑3制得的血小板活性检测试剂检测指标为MAADP。
[0064] 其中，参比试剂抑制率的检测按照试剂说明书操作进行，具体为：
[0065] 1、加1mL混合均匀的枸橼酸钠抗凝全血于活化凝血试剂瓶中，盖好瓶盖后轻轻地上下翻转摇匀。先加20μL浓度0.2M的氯化钙溶液于样品杯中，再加340μL混合血液于样品杯中。按照血栓弹力图仪使用说明书进行检测，直到MAt值确定。
[0066] 2、吸取10μL充分溶解的A‑P1试剂到空白样品杯中；再吸取360μL混合均匀的肝素化全血注入加有A‑P1试剂的样品杯中，反复吸取样品杯中的血液3次使之混合，进行A‑P1检测，直到MAf值确定。
[0067] 3、分别吸取10μL的A‑P1试剂和ADP‑P2试剂到空白样品杯中，再吸取360μL混合均匀的肝素化全血注入加有A‑P1试剂和ADP‑P2试剂的样品杯中，反复吸取样品杯中的血液3次使之混合。进行ADP‑P2检测，直到MAADP值确定。
[0068] 4、根据以下公式算出ADP的抑制率。
[0069] 其中，MApi是MAADP。
[0070] 实施例1‑3制得的血小板活性检测试剂，对于100μL/瓶的规格，先吸取100μL纯化水复溶，再吸取20μL试剂加入到检测杯中，最后加入360μL全血抽打混匀后启动检测，直至MAADP确定；对于20μL/瓶的规格，直接吸取360μL全血抽打混匀后启动检测，直至MAADP确定。
[0071] 取实施例1‑3制得的血小板活性检测试剂和参比试剂，对同一个服用了氯吡格雷、普拉格雷、替格瑞洛、康格瑞洛、噻氯匹定、阿昔单抗、替罗非班、或依替巴肽的冠心病或脑梗的患者进行ADP％及MAADP检测，根据下表1的标准判断试剂的有效性。
[0072] 表1本专利制得的检测试剂和参比试剂的参考区间数值及其临床意义表[0073]
[0074] 实施例的检测结果如下表2所示：
[0075] 表2实施例1‑3有效性的检测结果
[0076]
[0077]
[0078]
[0079] 结果显示，实施例1制得的血小板活性检测试剂与参比试剂结果完全一致，实施例2‑3制得的血小板活性检测试剂及参比试剂也几乎完全一致，实施例2仅编号18与参比试剂存在差异，实施例3仅编号06与参比试剂结果存在差异，因此，本发明实施例1‑3制得的血小板活性检测试剂具有较高的有效性。
[0080] 根据《定性检测体外诊断试剂分析性能评估注册审查指导原则》、《定性测定性能评价指南WS/T 505‑20117》，进一步根据检测结果和数据分析，判断两者的临床符合率，如下表所示以R×C表的形式总结考核试剂和参比试剂的检测结果，并据此计算二者的未起效组、起效组符合率。
[0081] 表3待评价试剂和对比试剂的R×C表
[0082]
[0083]
[0084] 对检测结果进行符合率计算，符合率均要达到90％以上。
[0085] 药物起效符合率(PPA)
[0086] PPA＝a/(a+c)×100％ (1)
[0087] 未起效符合率(NPA)
[0088] NPA＝d/(d+b)×100％ (2)
[0089] 总符合率(OPA)
[0090] OPA＝(a+d)/(a+b+c+d)×100％(3)
[0091] 符合率均应大于90％。
[0092] 结果如下表4‑6所示：
[0093] 表4实施例1检测结果统计表
[0094]
[0095] 药物起效符合率＝23/(23+0)×100％＝100.0％
[0096] 未起效符合率＝17/(0+17)×100％＝100％
[0097] 总符合率＝(23+17)/(23+17+0+0)×100％＝100％
[0098] 表5实施例2检测结果统计表
[0099]
[0100] 药物起效符合率＝22/(22+1)×100％＝95.7％
[0101] 未起效符合率＝17/(17+0)×100％＝100％
[0102] 总符合率＝(22+17)/(22+1+0+17)×100％＝97.5％
[0103] 表6实施例3检测结果统计表
[0104]
[0105]
[0106] 药物起效符合率＝23/(23+0)×100％＝100.0％
[0107] 未起效符合率＝16/(1+16)×100％＝94.1％
[0108] 总符合率＝(23+16)/(23+0+1+17)×100％＝97.5％
[0109] 综上，实施例1‑3的检测结果与参比试剂的符合率均达到90％以上，试剂的有效性良好。
[0110] 对比例1
[0111] 一种血小板活性检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
[0112] 步骤一：在50mM heps缓冲液中加入占冻干保护体系11.9％(W/V)的牛血清白蛋白，搅拌使其充分溶解，将pH值调整至7.2，获得冻干保护体系；
[0113] 步骤二：在步骤二的冻干保护体系中加入40BU/ml蛇毒凝血酶、100μg/ml的重组活化凝血十三因子、50μM二磷酸腺苷钠盐，搅拌使其充分溶解，制成试剂原液；
[0114] 步骤四：将试剂原液分装于西林瓶中(20μL/瓶、100μL/瓶)，进行混合冻干，获得血小板活性检测试剂。
[0115] 基于实施例同样的方式对对比例1的有效性进行检测，对比例1的检测结果如表7所示。
[0116] 表7对比例1有效性的检测结果
[0117]
[0118]
[0119]
[0120] 进一步根据实施例同样的方式对对比例1的临床符合率进行计算，结果如下表8所示：
[0121] 表8对比例1检测结果统计表
[0122]
[0123] 药物起效符合率＝27/(27+0)×100％＝100％
[0124] 未起效符合率＝0/(13+0)×100％＝0％
[0125] 总符合率＝(27+0)/(27+0+0+13)×100％＝67.5％
[0126] 对比例1总符合率小于90％，不能满足临床要求，从MAADP的检测值来看，比实施例1小很多。以上结果显示，利用实施例1的冻干保护体系及活性配方也能很好地保护试剂的活性，利用对比例1的冻干保护体系不能很好地保护巴曲酶、凝血活化十三因子及二磷酸腺苷的活性。
[0127] 基于此，进一步尝试对本发明的保护体系进行优化，鉴于实施例1的检测结果最佳，基于实施例1，设置对比例2‑4对本发明保护体系的用量进行调整，设置如下：
[0128] 对比例2
[0129] 一种血小板活性检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
[0130] 步骤一、制备冻干保护体系：在50mM heps缓冲液中加入聚乙烯基吡咯烷酮、氯化钠、海藻糖、牛血清白蛋白，并将pH值调整至7.2，获得冻干保护体系，其中，聚乙烯基吡咯烷酮、氯化钠、海藻糖、牛血清白蛋白分别占冻干保护体系的比例为：1.5％聚乙烯基吡咯烷酮(W/V)、0.9％氯化钠(W/V)、10％海藻糖(W/V)、0.5％牛血清白蛋白(W/V)，并将pH值调整至7.2，获得冻干保护体系；
[0131] 步骤二、制备原液：在冻干保护体系中加入蛇毒凝血酶、重组活化凝血十三因子、二磷酸腺苷钠盐，其中，蛇毒凝血酶、重组活化凝血十三因子、二磷酸腺苷钠盐各自在试剂原液中的终浓度为：40BU/ml蛇毒凝血酶、100μg/ml的重组活化凝血十三因子、50μM二磷酸腺苷钠盐，获得试剂原液；
[0132] 步骤三、混合冻干：将试剂原液分装于西林瓶中(20μL/瓶、100μL/瓶)，进行混合冻干，获得血小板活性检测试剂。
[0133] 对比例3
[0134] 一种血小板活性检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
[0135] 步骤一、制备冻干保护体系：在50mM heps缓冲液中加入聚乙烯基吡咯烷酮、氯化钠、海藻糖、牛血清白蛋白，并将pH值调整至7.2，获得冻干保护体系，其中，聚乙烯基吡咯烷酮、氯化钠、海藻糖、牛血清白蛋白分别占冻干保护体系的比例为：0.5％的聚乙烯基吡咯烷酮(W/V)、0.9％氯化钠(W/V)、5％的海藻糖(W/V)、0.5％的牛血清白蛋白(W/V)，并将pH值调整至7.2，获得冻干保护体系；
[0136] 步骤二、制备原液：在冻干保护体系中加入蛇毒凝血酶、重组活化凝血十三因子、二磷酸腺苷钠盐，其中，蛇毒凝血酶、重组活化凝血十三因子、二磷酸腺苷钠盐各自在试剂原液中的终浓度为：40BU/ml蛇毒凝血酶、100μg/ml的重组活化凝血十三因子、50μM二磷酸腺苷钠盐，获得试剂原液；
[0137] 步骤三、混合冻干：将试剂原液分装于西林瓶中(20μL/瓶、100μL/瓶)，进行混合冻干，获得血小板活性检测试剂。
[0138] 对比例4
[0139] 一种血小板活性检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
[0140] 步骤一、制备冻干保护体系：在50mM heps缓冲液中加入聚乙烯基吡咯烷酮、氯化钠、海藻糖、牛血清白蛋白，并将pH值调整至7.2，获得冻干保护体系，其中，聚乙烯基吡咯烷酮、氯化钠、海藻糖、牛血清白蛋白分别占冻干保护体系的比例为：0.5％的聚乙烯基吡咯烷酮(W/V)、0.9％氯化钠(W/V)、10％的海藻糖(W/V)、1.5％的牛血清白蛋白(W/V)，并将pH值调整至7.2，获得冻干保护体系；
[0141] 步骤二、制备原液：在冻干保护体系中加入蛇毒凝血酶、重组活化凝血十三因子、二磷酸腺苷钠盐，其中，蛇毒凝血酶、重组活化凝血十三因子、二磷酸腺苷钠盐各自在试剂原液中的终浓度为：40BU/ml蛇毒凝血酶、100μg/ml的重组活化凝血十三因子、50μM二磷酸腺苷钠盐，获得试剂原液；
[0142] 步骤三、混合冻干：将试剂原液分装于西林瓶中(20μL/瓶、100μL/瓶)，进行混合冻干，获得血小板活性检测试剂。
[0143] 将实施例1及对比例2‑4检测同一个血样，得到各自的MAADP，以考察本发明冻干保护体系相同组分在不同配比条件下对试剂活性的保护效果。
[0144] 结果如下表10所示：
[0145]
[0146] 与实施例1相比，对比例2‑4的MAADP检测值低10％以上，说明试剂的活性受到影响，对比例2‑4的冻干保护配方不能满足要求。
[0147] (2)精密度检测方法：取实施例1‑3制得的血小板活性检测试剂，检测同一肝素钠抗凝全血，重复测试10次，求MAADP测定值的均值 按以下公式计算标准差(SD)与变异系数(CV)，结果如下：
[0148] 表11实施例1‑3重复性的检测结果
[0149]次数 实施例1 实施例2 实施例3
1 60.7 64.3 55.2
2 66.1 65.7 55.3
3 58.6 62.5 58.2
4 59.0 62.3 52.6
5 58.5 57.6 53.8
6 56.2 58.5 54.1
7 58.6 66.5 48.5
8 57.9 61.9 49.6
9 58.6 58.6 49.5
10 57.4 61.8 56.4
均值 59.2 62.0 53.3
SD 2.7 3.0 3.2
CV(％) 4.6％ 4.9％ 6.1％
[0150] 结果可见，实施例1‑3的重复性检测中CV值均小于10％，表明检测精密度良好。综上，从有效性与精密度的检测结果来看，实施例1的检测效果最优，表明本发明实施例1的组分及配比制得的血小板活性检测试剂检测效果最佳。
[0151] 2、试剂加速老化14天后在的准确性评价。
[0152] 分别领取实施例1‑3的血小板活性检测试剂样品，在37℃的培养箱中密封保存14天进行加速老化试验。14天后取加速老化后的样品，配合血栓弹力图仪进行MAADP检测。加速老化样品的检测结果均值与2‑8℃保存样品的检测结果做相对偏差，考察试剂的热稳定性，结果如下表7所示：
[0153] 表12加速老化试剂的血样的检测结果
[0154]
[0155] 由上述加速老化后的检测结果可知，实施例1‑3制得的血小板活性检测试剂加速老化后与冷藏保存的试剂的相对偏差小于10％，热稳定性良好。其中，实施例1的相对偏差最小，表明实施例1的冻干保护体系保护效果最优，试剂活性损耗较小。
[0156] 可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。
