技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，具体涉及一种表达水通道蛋白AQP3的mRNA及其应用。
相关背景技术
[0002] 水通道蛋白(AQP)是一类在细胞膜上与水分子、甘油及尿素等中性小分子通透性有关的转运蛋白，目前发现其在哺乳动物中有13个亚型，分别命名为AQP0～12，不同AQP亚型的分布具有组织、细胞、亚细胞特异性。AQP可分为三个亚家族，即经典的水选择通道亚家族、水‑甘油通道亚家族、AQP超级通道即超AQP家族。AQP3属于水‑甘油通道亚家族，对于皮肤的屏障功能具有重要意义，其表达量的变化及功能缺陷均会导致皮肤屏障功能受损而引起相关皮肤病。
[0003] 水通道蛋白3(AQP3)是细胞膜上的一种物质，负责水、甘油及尿素等物质的运输，属于一种转运蛋白因子，主要表达于角质形成细胞和皮肤成纤维细胞。可以转运水、甘油及尿素等小分子物质。在皮肤，AQP3可从循环中将内源性甘油、皮脂腺中的甘油三脂等带入表皮，同时在表皮细胞内形成短的水回路，从而保证表皮持续的水含量，在表皮屏障功能、水的保存中发挥重要作用，同时在皮肤损伤和修复、愈合方面，均发挥着重要的作用，是皮肤正常形态和功能维持的重要保障。增加AQP3可使皮肤细胞的水合能力、甘油的转运能力提高，从而改善皮肤表面粗糙等衰老表现，可用于医疗美容领域。
具体实施方式
[0108] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0109] 实施例1：表达水通道蛋白AQP3的mRNA序列设计和合成
[0110] 本发明以AQP3水通道蛋白的氨基酸序列为基础，利用生物信息学方法设计7条突变型mRNA序列并合成DNA序列，通过体外转录的方式将DNA转录成mRNA之后，转染到293FT细胞系中，进行表达，利用流式细胞及western blot对表达效果进行检测。通过对序列的优化设计，筛选出了两条高表达水通道蛋白的mRNA。
[0111] 1.mRNA序列设计
[0112] 以AQP3水通道蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)为基础，根据密码子优化、UTR序列优化、RNA二级结构优化、碱基偏好性优化、polyA等方面，并收集mRNA序列与翻译功能的对应数据，建立的设计优化算法，生成mRNA序列。利用生物信息学方法共设计7条新的mRNA序列。其中，优化前的mRNA序列的编码区231C替换为231U，具体序列如SEQ ID NO：1所示，然后进一步优化，具体获得的Optimized 1‑7中编码区的序列分别如SEQ ID NO：2‑8所示。此外，针对mRNA的5’UTR序列(SEQ ID NO：9)、3’UTR序列(SEQ ID NO：10)、polyA序列(SEQ ID NO：11)进行优化，获得的mRNA的5’UTR序列如SEQ ID NO：20所示，3’UTR序列如SEQ ID NO：21所示，polyA序列如SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列。
[0113] 最终，设计出的mRNA序列中，优化前mRNA序列如SEQ ID NO：12所示，Optimized1‑7的mRNA序列分别如SEQ ID NO：13‑19所示。
[0114] 2、DNA序列合成及载体构建：
[0115] 委托基因合成公司根据设计的mRNA序列合成DNA序列，在合成过程中添加T7启动子序列(SEQ ID NO：24)。
[0116] 将合成的序列通过Goldengate构建至终载体pAB531得到含His标签的目的载体，菌落PCR挑选正确克隆，摇菌小提质粒，进行酶切。
[0117] 目的载体酶切初步验证正确，送测序验证正确，进行质粒小量中提。
[0118] 3、线性化DNA制备
[0119] (1)目的序列质粒通过小提中量试剂盒获得，线性化DNA(酶切)：30μg质粒经BsaI酶切，37℃,16h；
[0120] 酶切体系如表1所示。电泳检测酶切是否充分。
[0121] 表1：线性化酶切体系
[0122]组分 用量
Plasmid 30μg
rCutsmart 60μl
BsaI‑HFv2 6μl
Nuclease‑free water ‑
total 600μl
[0123] (2)酚氯仿纯化
[0124] 1)向反应产物中加入10％SDS至终浓度为0.5％，加入1/10体积的蛋白酶K(1μg/μl)，混匀后，50℃，30min；65℃，10min；
[0125] 2)每管加入1/10体积3M乙酸钠，等体积酚氯仿，震荡混匀后，静置3min；4℃，12000rpm离心15min，小心转移上清至新管中；
[0126] 3)重复2)；
[0127] 4)加入等体积异丙醇，混匀后置于‑20℃沉淀30min，4℃，12000rpm离心20min；
[0128] 5)弃上清，加入1ml 70％乙醇，清洗沉淀，4℃,12000rpm离心10min；
[0129] 6)重复5)三次；
[0130] 7)弃上清，晾干沉淀，每管加入50μl nuclease‑free water溶解沉淀；
[0131] 8)取少量沉淀稀释2倍测浓度；
[0132] 9)取纯化后样品1μg用于琼脂糖凝胶电泳。
[0133] 4、mRNA体外转录/共转录加帽
[0134] (1)反应体系如表2所示：混匀，37℃孵育2h；反应结束后，向反应体系中加入1μlDNaseI(1U/μl)，37℃孵育0.5h。
[0135] 表2：体外转录加帽反应体系
[0136]
[0137]
[0138] (2)LiCl沉淀法纯化：
[0139] 1)向反应产物中加Nuclease‑free water稀释至40μl加入40μl 7.5M LiCl沉淀溶液，40μl Nuclease‑free water，轻弹混匀，‑20℃静置30min；
[0140] 2)12000rpm，4℃,离心20min；
[0141] 3)弃上清，加入1ml 70％乙醇漂洗，12000rpm，4℃，离心10min，重复3次；
[0142] 4)弃上清，晾干沉淀后向沉淀中每管加入200μl Nuclease‑free water；
[0143] 5)充分溶解后，取出5μl mRNA进行2倍稀释后混匀，用超微量分光光度计测量浓度。
[0144] (3)变性琼脂糖凝胶电泳检测：
[0145] 1)将制胶用具用70％乙醇冲冼一遍，晾干备用；
[0146] 2)配制1％变性琼脂糖凝胶：
[0147] 称取0.36g琼脂糖，置干净的250ml锥形瓶中，加入DEPC水25ml，摇匀，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀；待胶凉至60‑70℃，依次向其中加入3ml 10×MOPS缓冲液、3μl Gelred核酸染料、3ml甲醛，混合均匀，倒入准备好的模具中。室温静置1h，待胶凝固；
[0148] 3)RNA上样准备：
[0149] 取无RNase的小离心管，依次加入如下试剂：2μl 10×MOPS缓冲液，3.5μl甲醛，10μl甲酰胺，RNA样品4.5μl，混匀。将离心管置于60℃金属浴中保持10分钟，立即置冰上2分钟；向管中加入2μl上样染料，混匀；
[0150] 4)电泳槽内加入1×MOPS缓冲液(10×MOPS液，用DEPC水稀释)；
[0151] 5)依次上样，设置电压90V，电泳约0.5h；
[0152] 6)电泳结束，紫外灯下观察拍照。电泳结果如图1所示。电泳图显示mRNA条带正常，质量良好。
[0153] 实施例2mRNA在293FT细胞中的表达测试
[0154] 1、mRNA转染293FT细胞测试
[0155] (1)细胞铺板：293FT细胞使用含10％ FBS、100U/ml Penicillin、100μg/ml Streptomycin的DMEM培养基，于37℃ 5％CO2培养。取生长良好的293FT细胞，转染实验前
5
24h，铺12孔板，2×10cell/well；
[0156] (2)第二天转染：配置转染试剂，A管：lipoMAX 1.5μl+100μl Opti‑MEM，B管：mRNA+100μl Opti‑MEM，室温静置5min，取A管的试剂轻轻加入B管，室温放置15min，向孔中加入转染试剂；
[0157] (3)在24h收取细胞，进行胞内染色(PE‑anti‑His)，流式检测。
[0158] 结果如图2‑3和表3所示：
[0159] 表3：293FT细胞His流式检测阳性率统计
[0160]
[0161]
[0162] 三次实验结果显示pHS‑ZRL‑1014(Optimized 1)与pHS‑ZRL‑1020(Optimized 7)两个序列优化后，从阳性率及细胞平均荧光强度上相比野生型有1.6‑1.8倍的提升。故后续将选用pHS‑ZRL‑1014(Optimized 1)与pHS‑ZRL‑1020(Optimized 7)两条优化序列去掉标签，构建pHS‑ZRL‑1012及pHS‑ZRL‑1013。
[0163] 2、Western Blot检测AQP3蛋白的表达
[0164] 将pHS‑ZRL‑1011(His)、pHS‑ZRL‑1014、pHS‑ZRL‑1020去掉His标签后得到目标载体pHS‑ZRL‑1011、pHS‑ZRL‑1012、pHS‑ZRL‑1013。提取质粒进行线性化、体外转录mRNA、纯化。
[0165] (1)细胞铺板：取生长良好的293FT细胞，铺12孔板，2×105cell/well；
[0166] (2)第二天转染：配置转染试剂，A管：lipoMAX 1.5μl+100μl Opti‑MEM，B管：mRNA+100μl Opti‑MEM，室温静置5min，取A管的试剂轻轻加入B管，室温放置15min，向孔中加入转染试剂；
[0167] (3)在24h收取细胞样品裂解液，Western Blot检测。
[0168] Western Blot结果如图4所示。重复实验进行灰度统计结果如图5所示。使用AQP3抗体进行Western Blot检测，对其灰度定量，筛选的表达较高两组与优化前组相比最高也有1.8倍的提升，与流式检测结果一致。
[0169] 实施例3mRNA在小肠上皮细胞中的表达测试
[0170] 提取pHS‑ZRL‑1012、pHS‑ZRL‑1013质粒进行线性化、体外转录mRNA、纯化。
[0171] (1)细胞铺板：取生长良好的小肠上皮细胞，铺12孔板，2×105cell/well；
[0172] (2)第二天转染：配置转染试剂，A管：lipoMAX 1.5μl+100μl Opti‑MEM，B管：mRNA+100μl Opti‑MEM，室温静置5min，取A管的试剂轻轻加入B管，室温放置15min，向孔中加入转染试剂；
[0173] (3)在24h收取细胞样品裂解液，Western Blot检测。
[0174] 检测结果见图6，经检测在小肠上皮细胞中有较好的表达。
[0175] 实施例4mRNA在动物模型中的表达测试
[0176] 1、微流控制备LNP‑mRNA试验样品
[0177] (1)将阳离子脂质、DSPC、胆固醇、PEG脂，均溶于无水乙醇，按照摩尔比为(50:10:38.5:1.5)制成混合溶液，溶液用0.22μm有机滤膜过滤后备用。
[0178] (2)用pH4.0的柠檬酸缓冲液配制mRNA溶液，至终浓度为0.26mg/ml；
[0179] (3)乙醇混合溶液与mRNA稀释液按照体积比1：3利用微流控制备成LNP‑mRNA样品，以1012为例。
[0180] 2、Balb/c小鼠给药及检测方案
[0181] 采用6‑8周龄的Balb/c小鼠，剃除背部鼠毛，在小鼠脊柱两侧分别取上、中、下三个部位。左侧3个部位为溶剂对照，皮下注射生理盐水。右侧区域皮下注射编码AQP3的LNP‑mRNA样品，每个注射部位间隔约1cm，注射部位面积1*1cm，每组样品共计3个注射部位。给药后48h，处死小鼠，取背部皮肤组织用于Western blot检测。
[0182] 实验结果：
[0183] Western blot检测结果如图7所示，小鼠皮肤注射编码AQP3的LNP‑mRNA样品48h后，可显著增加皮肤组织AQP3蛋白表达量。
[0184] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0185] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
