[0001] 本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及内体TRPML3通道激活剂SN‑2在制备细胞酸性调控药物中的应用。

[0002] 瞬时受体电位(TRP，Transient Receptor Potential)超家族是一类在外周和中枢神经系统中分布较为广泛的通道蛋白，能够感受光、渗透压、声音和温度等多种刺激信号，并调控机体做出相应反馈。与其他TRP亚家族不同，哺乳动物瞬时受体电位粘脂蛋白(TRPML1、TRPML2和TRPML3)多定位于早期内体、晚期内体或溶酶体等器膜上，主要介导多种非选择性的阳离子(如钙离子)流动，在许多内体‑溶酶体依赖的细胞过程中不可或缺，如胆固醇积累、内体pH稳态、膜转运、胞外分泌和细胞自噬等。尽管TRPML通道参与的细胞生理功能研究较为广泛，但关于该通道选择性激活剂或抑制剂的筛选和功能验证报道仍然较少。

[0003] 因此，亟需开发新的细胞酸性调控药物。

[0022] 下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

[0023] 在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

[0024] 除非另有特别说明，本发明所用药物、试剂或仪器均可由市场购得。

[0025] 下面将结合实施例及实验数据对本申请的内体TRPML3通道激活剂SN‑2在制备细胞酸性调控药物中的应用进行详细说明。

[0026] 实施例1：小分子SN‑2在不同浓度下对A549细胞A549(肺泡上皮细胞)和Huh7细胞(人肝癌细胞)的细胞活性

[0027] 1、借助试剂公司化学合成TRPML3通道激活剂SN‑2(MCE，10mg)，利用DMSO溶剂进行溶解和不同浓度的配制；

[0028] 2、采用CCK‑8法(上海翊圣生物科技有限公司)检测小分子SN‑2在不同浓度下对A549细胞A549(肺泡上皮细胞)和Huh7细胞(人肝癌细胞)的细胞活性，具体实验方法如下：

[0029] (A)提前将状态良好的细胞按照5000‑10000个/孔铺到96孔板中，且控制细胞培养基为100μL，37℃培养过夜；

[0030] (B)待细胞密度长到70％‑90％时，将化合物(SN‑2)以不同终浓度加到细胞中(终浓度为0、6.25、12.5、25、50、100μM)，且每个浓度设置5个平行样，同时设置对照组和没有细胞的空白组，37℃培养箱中培养48h；

[0031] (C)然后将细胞培养上清换成100μL新鲜且含有CCK‑8试剂的培养基，按照每100μL培养基中加入10μL的CCK‑8试剂配成，37℃继续孵育1‑2h，注意操作过程不能产生气泡；

[0032] (D)孵育结束后，将96孔板子放入酶标仪(BioTek)进行检测，测定450nm处的光吸收值(OD值)，并保存好每个浓度的原始数据；

[0033] (E)然后根据公式：细胞活力*(％)＝[A(加药)‑A(空白)]/[A(0加药)‑A(空白)]×100，其中A(加药)代表同时具有CCK‑8试剂、细胞和药物的孔的吸光值，A(0加药)代表具有CCK‑8试剂和细胞而培养基中不含药物的孔的吸光度，A(空白)代表只有CCK‑8试剂和培养基而不含细胞和药物的孔的吸光值，计算出各个浓度小分子的细胞活力，然后绘制成图并分析结果。

[0034] 结果如图1所示，随着胞内SN‑2浓度的增加，A549细胞或Huh7细胞并未表现出明显毒性，即使在最大浓度100μM的处理下，说明TRPML3通道激活剂SN‑2在两种细胞中的毒性较低，在此浓度范围内可以开展相应细胞功能的探究。

[0035] 实施例2、内体TRPML3通道激活剂SN‑2在制备细胞酸性调控药物中的应用[0036] 1、用不同浓度的TRPML3激活剂SN‑2((终浓度为0、6.25、12.5、25、50μM)分别处理A549细胞核Huh7细胞，并利用LysoSensor Green DND‑189酸敏感荧光探针和荧光显微镜去检测细胞的酸性强弱。

[0037] LysoSensor Green DND‑189是一种酸敏感的荧光探针，在低pH值条件下，能够发出绿色荧光，通过流式细胞检测可以灵敏指示细胞内的酸化程度。化合物SN‑2调控细胞酸性的具体检测方法如下：

[0038] (1)提前将状态良好的细胞(如A549或Huh7)按2×105个/孔铺在12孔板中，37℃培养过夜；

[0039] (2)待细胞密度达到50％‑60％后，向细胞中加入不同终浓度的SN‑2或者10nM的Bafilomycin A1(Baf‑A1)，并以相同体积的DMSO作为对照，37℃条件下培养24h；

[0040] (3)然后向每孔细胞中加入终浓度为1μM的LysoSensor Green DND‑189，轻轻摇晃混匀，37℃孵育30‑60min；

[0041] (4)孵育结束后，如果用于荧光显微镜的观察，需用PBS清洗细胞2次，然后直接置于显微镜下观察拍照，并借助计算机软件分析每个样品的荧光强度和细胞个数等数据，进而判定各个样品的酸性强弱。

[0042] 2、结果如图2和3所示：

[0043] 由图2可知，不管是A549细胞或Huh7细胞，在细胞终浓度为25μM时，TRPML3通道激活剂SN‑2能够明显增加绿色酸性荧光探针强度，升高比例分别为2.78和1.83倍，说明TRPML3通道激活剂SN‑2具有增强A549或Huh7细胞内部酸化的作用。

[0044] 由图3可知，随着SN‑2浓度的增加，细胞的酸化程度逐渐上升，在A549细胞中的酸度分别提高到1.3、1.7、2.8和3.2倍(相对于对照组)；而在Huh7细胞中的酸度分别提高到1.2、1.6、1.8和2.5倍(相对于对照组)，说明TRPML3激活剂SN‑2对两种细胞酸性的诱导能力存在差异，对A549细胞酸性的调控能力更强。

[0045] 最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

[0046] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

[0047] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。