[0001] 本发明属于海洋藻类的培养方法技术领域。更具体地，涉及一种紫衫状海门冬果孢子体培养的方法。

[0002] 紫衫状海门冬(Asparagopsis taxiformis)是一种红藻，具有独特的生物学特性和经济价值。其果孢子体作为繁殖的重要阶段，对于其种质资源的保存、繁殖以及后续的养殖研究具有重要意义。然而，紫衫状海门冬果孢子体的诱导释放及进一步培养过程中存在诸多困难，最佳培养条件仍不清晰，难以满足大规模培养的需求；紫衫状海门冬果孢子体对培养条件的要求较高，包括光照强度、光照周期、温度、盐度、营养盐浓度等。不合适的培养条件会导致孢子体生长缓慢、死亡率高，甚至无法完成生活史。这些困难限制了对其深入研究的进行和潜在应用价值的开发。

[0003] 虽然已有一些关于藻类孢子释放和培养的研究报道，但针对紫衫状海门冬果孢子体的培养方法尚不完善。例如，中国专利申请CN110106134A公开了一种绿藻类孢子释放方法，该方法强调在黑暗条件下干出再复水有利于提高孢子的释放率。然而，这种方法并不适用于紫衫状海门冬果孢子体的培养。另外，中国专利申请CN105684879A公开了一种角叉菜悬浮培养的方法，该方法包括野外采样、藻体处理、孢子释放、孢子收集和藻苗悬浮培养等步骤。虽然该方法在角叉菜的培养中取得了一定的效果，但由于紫衫状海门冬与角叉菜在生物学特性和培养要求上的差异，该方法并不适用于紫衫状海门冬果孢子体的培养。

[0004] 因此，迫切需要提供一种有效提高紫衫状海门冬果孢子体释放和生长萌发的方法。

[0044] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0045] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0046] 普鲁瓦索里培养基(Provasoli's ES Medium，简称PES)配方：

[0047] 母液N:NH4NO3，23.5g/L；

[0048] 母液P:NaH2PO4·2H2O 3.89g/L；

[0049] 母液II:Fe(NH4)2(SO4)·6H20 0.701g/L，Na2EDTA 0.66g/L；

[0050] 母液III:Na2EDTA 1.00g/L，H3BO3 1.14g/L，FeCl3·6H2O 0.049g/L，MnCl2·4H2O[0051] 0.146g/L，ZnSO4·7H2O 0.0022g/L，CoCl2·6H2O 0.004g/L。

[0052] 以上4种母液按1.4:1.4:5.0:5.0的比例配成总母液，再向1L消毒海水中加10mL总母液即可配置PES溶液，1/2PES为向1L消毒海水中加5mL总母液即可配置，1/4PES为向1L消毒海水中加2.5mL总母液即可配置1/4PES溶液。

[0053] 消毒海水即为过滤后煮沸的海水，即为FSW。

[0054] 实施例1诱导紫衫状海门冬果孢子释放的方法

[0055] 1、实验方法

[0056] 诱导紫衫状海门冬果孢子释放的方法，包括如下步骤：

[0057] S1.野外采样：紫衫状海门冬生长在低潮带至潮下带，采样时，通过囊果的颜色(粉红色)、形状(圆球状)和尺寸(约0.5mm)确定具有成熟囊果的雌配子体，将雌配子体从匍匐茎上掐下。运输过程中，将雌配子体置于低于气温5℃的海水中，以避免温度升高导致的孢子提前释放。

[0058] S2.藻体处理：为了去除附生动物对囊果孢子释放的影响，将步骤S1采集到的雌配子体置于2L的聚乙烯烧杯中，用2L消毒自然海水冲洗雌配子体10次，等雌配子体自然沉降后，将海水逐次倒掉，几乎可以去除所有附生动物。再将雌配子体转移至装有消毒海水的洁净培养皿中，在倒置显微镜下用镊子移除仍然遗留的附生动物。转移过程中，用镊子夹住雌配子体的末端，不要触及雌配子体囊果分布的部分，以免损害囊果。

[0059] S3.孢子释放和统计：将单个配子体转移至分别装有消毒海水(FSW,过滤后煮沸的海水，盐浓度为32ppt)、1/2PES培养基(由消毒海水与PES培养基配制，盐浓度为32ppt)、1/4PES培养基(盐浓度为32ppt)的100mm培养皿中，设置12L：12D与8L:16D两个光周期，光照条‑2 ‑1
件为在24μmol photons m s 。经过黑暗处理后，使用倒置显微镜每隔1h观察并统计配子体的果孢子释放情况。

[0060] 由于每个配子体的囊果数量具有差异，配子体理论上释放的孢子数据具有较大变异性，因此定义“单个配子体释放≥50个孢子”为孢子成功释放事件，反之则为不成功事件。统计各个处理下的孢子成功释放事件，除以单个处理下的所有事件，即各个处理下配子体成功释放孢子的比例。使用卡方检验来检验不同处理下孢子释放成功比例是否存在显著差异

[0061] 2、实验结果

[0062] 统计各个处理下的孢子的释放情况，结果如下所示：

[0063] (1)孢子释放高峰在光照3h左右，持续3‑5个小时，在30h后没有孢子释放。

[0064] (2)统计不同培养基和光照周期下配子体释放孢子的情况，结果如图1所示，发现使用FSW为初始培养基，光照周期为12L:12D处理组的孢子释放效果好，单个配子体释放超过50个孢子(100％)；其次为FSW和8L：16D处理组(67％)；再次为1/4PES培养基和12L:12D处理组(50％)与1/4PES培养基和8L：16D处理组(25％)；以1/2PES培养基为初始培养基的两个处理组在上述两个光周期下均没有孢子释放。这可能是因为较高的营养水平会抑制孢子的释放。

[0065] 可见，FSW和光照周期12L：12D可有效诱导孢子释放。

[0066] 实施例2紫衫状海门冬果孢子的萌发和培养

[0067] 使用1mL的无菌吸管将释放的孢子转移至装有分别装有FSW、1/4PES(也即PES/4)、1/2PES(也即PES/2)、PES的培养皿中，在培养皿的底部放置2‑3块玻璃片供孢子附着，使转‑2 ‑1
移的孢子均匀的散布在载玻片上。在20℃，12L：12D，24μmol photons m s 条件下培养，每周换一次培养基。显微镜下观察孢子的萌发状况：

[0068] (1)在萌发之前，孢子膨大到几乎是原来大小的两倍，萌发后分裂成多细胞果孢子体；

[0069] (2)孢子一般在3天内萌发，3天内无孢子萌发或污染严重的载玻片则丢弃。

[0070] (3)以萌发的孢子数目除以载玻片上孢子数目，得到不同培养基下孢子的萌发概率(图2)，发现1/2PES的萌发率最高(64.3％)，其次为PES(41.2％)，1/4PES(37.5％)，FSW(12.5％)。

[0071] 可见，1/2PES可有效促进孢子的萌发。

[0072] 实施例3果孢子体的培养

[0073] 将附着果孢子体的载玻片转移至新的培养皿中，在原条件下继续培养，每周转移至新的培养皿中。至载玻片上的果孢子体的长度不小于0.5cm后，用无菌刀片将果孢子体从载玻片上剥离后转移至烧瓶中培养，培养基为1/2PBS，培养温度为20℃，采用实验优化培养条件。设置0.5、1、2g/L(湿重)3个初始果孢子体培养密度与24、44、96、150、220、330、510μ‑2 ‑1mol photons m s  7个光照，在500mL烧瓶中进行培养，光照周期为12L：12D，培养7d，培养结束后，使用200μm筛网过滤烧瓶中培养液得到果孢子体，擦干水分后称重，根据培养前后质量差，获得果孢子体的特定生长速度(SGR)，计算公式为:SGR＝ln(mt/mo)，mt为培养间t后的果孢子体密度，mo为初始培养密度。另外，湿重指的是果孢子体正常含水时的质量，一般指擦除表面水分后的质量；培养密度指的是湿重除以培养液的体积。

[0074] 不同处理下果孢子体的生长速度变化情况如图3所示：

[0075] (1)培养密度与光照强度均对果孢子体的生长速度有显著影响，中等密度下(1g/L)果孢子体的培养速率显著高于高密度(2g/L)与低密度(0.5g/L)；

[0076] (2)光照对果孢子体生长速度的影响呈现先上升后下降的趋势，其中150与220μ‑2 ‑1mol photons m s 两个光照强度下果孢子体的生长速率在1g/L时分别为8.30±0.70％/d与8.13±0.66％/d，高于其余光照。

[0077] 总体而言，使用1g/L密度和150～330μmol photons m‑2s‑1光照的培养条件均能有‑2 ‑1效促进果孢子体的生长；当密度条件不变，光照条件为150～220μmol photons m s ，果孢子体的生长率可进一步提高。

[0078] 对比例1诱导紫衫状海门冬果孢子释放的方法

[0079] 1、实验方法

[0080] 诱导紫衫状海门冬果孢子释放的方法，包括如下步骤：

[0081] S1.野外采样：紫衫状海门冬生长在低潮带至潮下带，采样时，通过囊果的颜色(粉红色)、形状(圆球状)和尺寸(约0.5mm)确定具有成熟囊果的雌配子体，将雌配子体从匍匐茎上掐下。运输过程中，将雌配子体置于无水低温环境中，以避免温度升高导致的孢子提前释放。

[0082] S2.藻体处理：为了去除附生动物对囊果孢子释放的影响，将步骤S1采集到的雌配子体置于2L的聚乙烯烧杯中，用2L消毒自然海水冲洗雌配子体10次，等雌配子体自然沉降后，将海水逐次倒掉，几乎可以去除所有附生动物。再将雌配子体转移至装有消毒海水的洁净培养皿中，在倒置显微镜下用镊子移除仍然遗留的附生动物。转移过程中，用镊子夹住雌配子体的末端，不要触及雌配子体囊果分布的部分，以免损害囊果。

[0083] S3.孢子释放和统计：将单个配子体转移至装有消毒海水(FSW)培养基的100mm培‑2 ‑1养皿中，设置12L：12D两个光周期，光照条件为在24μmol photons m s 。经过黑暗处理后，使用倒置显微镜每隔1h观察并统计配子体的果孢子释放情况。

[0084] 由于每个配子体的囊果数量具有差异，配子体理论上释放的孢子数据具有较大变异性，因此定义“单个配子体释放≥50个孢子”为孢子成功释放事件，即以“单个配子体释放≥50个孢子”为孢子成功释放事件，反之则为不成功事件。统计各个处理下的孢子成功释放事件，除以单个处理下的所有事件，即各个处理下配子体成功释放孢子的比例。使用卡方检验来检验不同处理下孢子成功释放比例是否存在显著差异

[0085] 2、实验结果

[0086] 结果发现，经过无水低温环境保存的配子体，没有成功释放孢子的事件。可见，采集的新鲜雌配子体需要在低温的海水环境中保存，才能诱导释放出孢子。

[0087] 由上述可知，紫衫状海门冬果孢子体培养在各个阶段的培养条件不同，不同阶段需要不同的培养条件。具体地，本申请将采集到的雌配子体保存在低温海水中有利于后续诱导释放孢子，相反将采集的雌配子体干出后再复水发现孢子无法释放；在诱导孢子释放阶段需要FSW作为培养基具有较好的释放效果；在孢子的萌发和培养，需要1/2PES作为培养基具有较好的萌发效果，相反采用FSW的萌发效率很差；在前期的释放和萌发两个阶段，孢‑2 ‑1子均是在较低的光强下(如24μmol photons m s )培养，而在孢子形成果孢子体后，其需‑2 ‑1
要在合适的密度(1g/L)和较高的光强条件(150～330μmol photons m s )下才有利于培养果孢子体的生长。可见，本申请所得孢子的释放以及后续果孢子体的培养需要在特定的培养基、光周期和光照强度下培养，才能获得较好的孢子释放效果和果孢子体生长效果。

[0088] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。