[0001] 本发明涉及生物活性肽技术领域，更具体地，涉及一种具有抗氧化和酪氨酸酶抑制活性的发酵山茶籽多肽及其制法与应用。

[0002] 肽(Peptide)即小分子的蛋白质，是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，是蛋白质的结构和功能片段。活性生物多肽具有安全稳定、易溶于水、易吸收、分子量小等优点，同时具有清除自由基、抗氧化、美白、抗衰老等多种生物活性。

[0003] 山茶是我国重要的木本油料作物之一，它与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料植物。山茶籽粕是山茶籽经过榨油加工后剩下的残渣，其数量相当于茶油的3倍。油茶饼粕中蛋白质含量约为10％～15％，其氨基酸组成为17种，其中8种为人体必需氨基酸，具有较高的利用价值。众多研究表明，动植物蛋白经水解后的小分子多肽产物通常具有降血糖、抗氧化、抗黑素生成、降血压等生物活性。

[0004] 传统的抗氧化肽研究过程通常包括酶解并逐步对分离出的组分进行评价。与酶水解相比，微生物发酵具有生产成本低、生产周期短等优点，微生物来源广泛且繁殖较快，可产生多种酶系发酵工艺具有提高抗氧化活性的潜力。

[0005] 目前关于山茶籽多肽的制备与鉴定方面的研究工作很少，仅有少部分现有技术中公开了山茶籽多肽的制备，但是未能实现鉴定具体哪些多肽具备高抗氧活性和酪氨酸酶抑制活性。

[0006] 因此，本领域迫切需要开发一种具有抗氧化和酪氨酸酶抑制活性的发酵山茶籽肽。丰富生物活性肽资源库，促进山茶籽粕资源的开发利用。

[0053] 为使本发明实施例的目的、技术方案、有益效果及显著进步更加清楚，下面，将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所有描述的这些实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0054] 下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0055] 以下各实施例和对比例中，如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料产品或常规处理技术。

[0056] 实施例1

[0057] (1)制备山茶籽粗肽发酵液

[0058] 所用枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilisCGMCC NO.29154，于2023年11月27日保存北京朝阳区北辰西路1号院3号中国普通微生物菌种保藏管理中心。

[0059] 利用枯草芽孢杆菌发酵脱脂山茶籽粕溶液，将一定量的脱脂山茶籽粕及一定量超纯水加入250mL蓝盖瓶中，混匀后于高压灭菌锅中121℃灭菌15min，脱脂山茶籽粕与水的比例为30g/L、接种量为15％、发酵时间为24h、发酵温度为37℃、摇瓶转速150r/min。发酵完成后，取脱脂山茶籽粕发酵液离心后取上清即发酵山茶籽粕多肽液。

[0060] (2)发酵山茶籽粕多肽液的分离纯化和冷冻干燥

[0061] 利用超滤离心管对发酵山茶籽粕多肽液进行超滤分离，得到分子量＜3kD、3～10kD和＞10kD的组分，并对超滤各组分进行真空冷冻干燥处理。以谷胱甘肽(glutathione，GSH)为阳性对照组，测定这些组分的抗氧化能力，即DPPH自由基清除能力(见附图1所示)，ABTS自由基清除能力(见附图2所示)，羟基自由基清除能力(见附图3所示)，酪氨酸酶抑制能力(见附图4所示)。具体测定过程如下：

[0062] 1)DPPH自由基清除活性测定：

[0063] 100μL的山茶籽粕多肽溶液加入等量100μL 0.2mM的DPPH溶液，振荡均匀，避光静置25min，于波长517nm处测定吸光度值。清除率计算公式为：

[0064] DPPH自由基清除率(％)＝(1‑(A1‑A2)/A0)×100；

[0065] 其中，A0是超纯水的吸光度值作为空白对照，A1是山茶籽粕多肽溶液的吸光度值，A2是用超纯水代替DPPH溶液的吸光度值。

[0066] 2)ABTS自由基清除活性测定：

[0067] 200μL的山茶籽粕多肽溶液，加入800μL ABTS混合溶液(7mM的ABTS溶液与2.45mM的过硫酸钾溶液等体积混合)，于波长734nm处测定吸光度值。清除率计算公式为：

[0068] ABTS自由基清除率(％)＝(1‑(A1‑A2)/A0)×100；

[0069] 其中，A0是超纯水的吸光度值作为空白对照，A1是山茶籽粕多肽溶液的吸光度值，A2是用超纯水代替ABTS混合溶液的吸光度值。

[0070] 3)羟基自由基清除活性测定：

[0071] 100μL的山茶籽粕多肽溶液，加入300μL的含FeSO4(6mM)、水杨酸(6mM)和H2O2(6mM)的混合液，充分摇匀，37℃加热30分钟，在510nm处测定吸光度值。清除率计算公式为:

[0072] 羟自由基清除率(％)＝(1‑(A1‑A2)/A0)×100；

[0073] 其中，A0是超纯水的吸光度值作为空白对照，A1是山茶籽粕多肽溶液的吸光度值，A2是用超纯水代替含FeSO4(6mM)、水杨酸(6mM)和H2O2(6mM)的混合液的吸光度值。

[0074] 4)酪氨酸酶抑制率测定：

[0075] 以L‑多巴为底物，将L‑多巴(40μL,0.5mM)与山茶籽粕多肽溶液(40μL,)和磷酸盐缓冲液(PBS)(80μL,0.05M,pH 6.8)混合。37℃孵育10min后，加入酪氨酸酶(40μL,250U mL‑1)，37℃孵育30min。在475nm处测吸光度。

[0076] 酪氨酸酶抑制率(％)＝(1‑(A1‑A2)/(A3‑A4))×100；

[0077] 其中，A1为L‑多巴底物、山茶籽粕多肽、酪氨酸酶和PBS体系的吸收值，A2为山茶籽粕多肽、酪氨酸酶和PBS体系的吸收值，A3为L‑多巴底物、酪氨酸酶和PBS体系的吸收值，A4为酪氨酸酶和PBS体系的吸收值。

[0078] (3)序列鉴定

[0079] 选取生物活性最好的山茶籽粕多肽，即分子量<3000的肽段，进行LC‑MS测定，样品鉴定过程中的色谱图如图5所示。质谱测定的结果采用质谱分析软件分析，获得多条不重复多肽序列。质谱原始文件由Peaks Studio的peptides模块进行序列分析。质谱检测多肽原理是将LC‑MS检测到的多肽分子量和数据库中分子量非常接近多肽进行比较，并进一步筛选碎片离子的相关性获得准确的氨基酸序列组成。为提高肽序列的准确性和可信度,选择平均局部置信度(ALC)＞85％的肽序列。最终获得71条序列，LC MS鉴定序列如表1所示。

[0080] 表1

[0081]

[0082]

[0083]

[0084] (4)虚拟筛选

[0085] 将利用LC‑MS/MS液相色谱串联质谱仪进行序列鉴定解析获得的多肽段的序列导入到BIOPEP数据库(https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep uwm/)来确定肽是否为新肽；将确定为新肽的肽段导入Peptide Ranker网站进行活性预测，评分高于0.8的多肽被认为具有潜在的生物活性，并对其进行毒性和亲水性预测，挑选出前20条活性评分分数较高的多肽序列，虚拟筛选出的20条多肽的对接分值及毒性和溶解度参见表2：

[0086] 表2

[0087]

[0088]

[0089] 然后对筛选出的多肽进行分子对接。分子对接是功能性活性成分筛选中常用的计算机生物技术，其原理是通过模拟大分子(受体)与小分子(配体)的结合来预测结合构象和结合亲和力，结合能越低表明受体与配体之间结合越紧密。分子对接在研究肽的构效关系方面具有快速、高效、准确等优点，可应用于抗氧化机制和酪氨酸酶抑制机制的研究。

[0090] Keap1是细胞氧化应激反应的主要调控因子，Keap1‑Nrf2信号通路是具有抗氧化功能的重要系统。当发生氧化损伤时，Keap1与自由基相互作用，多肽可改变Keap1/Nrf2‑ARE信号通路，影响抗氧化酶在细胞中的作用。因此，将肽分别与Keap1蛋白(PDB ID:4IQK)与酪氨酸酶(PDB ID:2Y9X)进行分子对接。根据对接结果挑选出前四条结合能较低的且无毒、具有良好溶解性的多肽序列，得到具有抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力佳的多肽。

[0091] (5)如上述表2所示，根据多肽与Keap1蛋白(PDB ID:4IQK)与酪氨酸酶(PDB ID:2Y9X)分子对接结合能的大小根据单个各自结合能从高到低筛选，并结合溶解性难易，选择结合能低且易溶的多肽，最终筛选的四条多肽序列为：LPFR(如SEQ ID NO：4所示)、WGFKPK(如SEQ ID NO：18所示)、PFDLR(如SEQ ID NO：26所示)、FPGEL(如SEQ ID NO：31所示)。将最终筛选得到的四条多肽序列进行固相合成，测定4条多肽抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性。
以GSH为阳性对照，四种多肽的IC50值见表3：

[0092] 表3

[0093]

[0094] 由表3可知四条多肽LPFR(如SEQ ID NO：4所示)、WGFKPK(如SEQ ID NO：18所示)、PFDLR(如SEQ ID NO：26所示)、FPGEL(如SEQ ID NO：31所示)的IC50值低于阳性对照GSH的IC50值或低于其他已报道的具有抗氧化和酪氨酸酶抑制能力的多肽，其中，由于目前未见同样来源于山茶籽多肽的报道，此处采用已报道的同属于植物来源的多肽进行以下对比：

[0095] 本发明的多肽LPFR优于已报道的多肽EEHLCFR(ABTS+IC50＝0.019mg/ml,OH IC50＝2.796mg/ml)和(VGPWQK:ABTS+IC50＝1.0mg/mL)多肽FPY(酪氨酸酶IC50＝1.37mg/ml)(参见Chai,T.T.；Xiao,J.B.；Mohana Dass,S.；Teoh,J.Y.；Ee,K.Y.；Ng,W.J.；Wong,F.C.Identification of antioxidant peptides derived from tropical jackfruit seed and investigation of the stability profiles.Food Chem.2021,340,127876.)[0096] 本发明的多肽FPGEL优于已报道具有较好抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力的多肽(多肽LSPH DPPH IC50＝2.9mg/ml)(参见Yu,Y.P.；Lai,S.J.；Chang,C.R.；Chen,W.C.；Wu,S.H.；Lu,C.P.Peptidomic analysis of low molecular weight antioxidative peptides prepared by  lotus(Nelumbo  nucifera Gaertn.)seed protein hydrolysates.LWT 2021,144,11138.)

[0097] 上述结果表明，本发明的四条多肽LPFR、WGFKPK、PFDLR和FPGEL为无毒、易溶解的多肽，且具有较好的抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力。基于此，通过本发明方法制备和筛选的多肽具有较好的抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力，可安全地应用于抗氧化和抑制酪氨酸酶产品或化妆品中。

[0098] 以上对本发明的较佳实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，其中未尽详细描述的设备和结构应该理解为用本领域中的普通方式予以实施；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例，这并不影响本发明的实质内容。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。