[0001] 本发明属于化学发光探针技术领域，特别是涉及一种检测咯喹酮的化学发光探针及其制备方法和应用。

[0002] 为了提高作物产量和农产品质量，农药在农业中被广泛使用。关于这些农药对公共卫生和非目标物种的长期、低剂量的影响，我们知之甚少。因此，人们普遍认为滥用农药造成了严重的食品和环境污染，并已成为世界上公共卫生领域最令人震惊的挑战之一。农药残留检测是农药污染管理的关键途径。发展高效、高通量、高灵敏度和高精度的农药残留检测方法，是食品安全和环境监测的当务之急。咯喹酮(Pyn)是一种农作物杀菌剂，主要用于防治稻瘟病和穗瘟病，这种杀菌剂在4月份移栽前经常被施用于幼苗上，广泛应用于世界各地。迄今为止，极少数人报道Pyn的检测，且方法仅仅集中在液相质谱和气相质谱。然而，这些检测方法由于样品前处理过程复杂、检测周期长，需要专业的操作者和昂贵的设备。因此，建立简便灵敏的咯喹酮分析技术显得尤为重要。化学发光(CL)是基于高能中间体松弛到基态的光辐射现象，具有设备简单、操作方便、分析速度快、易于自动化和高通量检测等优点。

[0003] 目前，现有专利中未有基于化学发光现象检测农作物中残留咯喹酮的发明。本发明以六氯环三磷腈为原料，采用简单的一步水热法合成了富电子的氮化磷量子点纳米探针2‑
(PNDs探针)。该探针可以加速电子转移，促使FeO4 产生大量活性氧，从而有效引发化学发
2‑
光。咯喹酮的加入能进一步增强PNDs/FeO4 体系的化学发光。基于此，成功构建了一种检测咯喹酮的化学发光方法。

[0026] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

[0027] 实施例1。

[0028] 咯喹酮化学发光探针的制备方法：

[0029] (1)将20mg六氯环三磷腈作为前驱体加入20mL无水乙醇中，超声5min使六氯环三磷腈完全溶解，得到A品；

[0030] (2)取A品移至50ml聚四氟乙烯内衬的反应釜中，在180℃下加热反应12h后，冷却到室温，得到B品；

[0031] (3)取B品于旋转蒸发仪中，在50℃下旋蒸除去无水乙醇，得到沉淀物加入丙酮1mL，在3000rpm条件下离心10min后，置于80℃真空干燥箱中干燥5h，得到淡黄色固体，将所得淡黄色固体溶解于溶于20mL去离子水中，即可获得PNDs探针。

[0032] 实施例2。

[0033] 咯喹酮化学发光探针的制备方法：

[0034] (1)将25mg六氯环三磷腈作为前驱体溶于15mL无水乙醇中，超声10min溶解，得到A品；

[0035] (2)取A品移至40ml聚四氟乙烯内衬的反应釜中，在200℃下加热反应14h后，冷却到室温，得到B品；

[0036] (3)取B品于旋转蒸发仪中，在60℃下旋蒸除去无水乙醇，得到沉淀物加入丙酮1.2mL，在2500rpm条件下离心15min后，置于90℃真空干燥箱中干燥4h，得到淡黄色固体，将所得淡黄色固体溶解于溶于25mL去离子水中，即可获得PNDs探针。

[0037] 实施例3。

[0038] 咯喹酮化学发光探针的制备方法：

[0039] (1)将15mg六氯环三磷腈作为前驱体溶于25mL无水乙醇中，超声3min溶解，得到A品；

[0040] (2)取A品移至60ml聚四氟乙烯内衬的反应釜中，在160℃下加热反应10h后，冷却到室温，得到B品；

[0041] (3)取B品于旋转蒸发仪中，在60℃下旋蒸除去无水乙醇，得到沉淀物加入丙酮0.8mL，在3500rpm条件下离心5min后，置于70℃真空干燥箱中干燥7h，得到淡黄色固体，将所得淡黄色固体溶解于溶于15mL去离子水中，即可获得PNDs探针。

[0042] 实施例4。

[0043] 咯喹酮化学发光探针的制备方法：

[0044] (1)将18mg六氯环三磷腈作为前驱体溶于22mL无水乙醇中，超声7min溶解，得到A品；

[0045] (2)取A品移至45ml聚四氟乙烯内衬的反应釜中，在170℃下加热反应12h后，冷却到室温，得到B品；

[0046] (3)取B品于旋转蒸发仪中，在55℃下旋蒸除去无水乙醇，得到沉淀物加入丙酮0.9mL，在3000rpm条件下离心10min后，置于75℃真空干燥箱中干燥6h，得到淡黄色固体，将所得淡黄色固体溶解于溶于18mL去离子水中，即可获得PNDs探针。

[0047] 实施例5。

[0048] 咯喹酮化学发光探针的制备方法：

[0049] (1)将22mg六氯环三磷腈作为前驱体溶于18mL无水乙醇中，超声8min溶解，得到A品；

[0050] (2)取A品移至55ml聚四氟乙烯内衬的反应釜中，在190℃下加热反应11h后，冷却到室温，得到B品；

[0051] (3)取B品于旋转蒸发仪中，在45℃下旋蒸除去无水乙醇，得到沉淀物加入丙酮1.1mL，在3000rpm条件下离心8min后，置于85℃真空干燥箱中干燥5h，得到淡黄色固体，将所得淡黄色固体溶解于溶于22mL去离子水中，即可获得PNDs探针。

[0052] 实施例6。

[0053] 咯喹酮化学发光探针检测方法：

[0054] 将200μL的PNDs探针与100μL的咯喹酮溶液混合于专用发光皿中，另将200μLFeO42‑2‑
溶液置于塑料管中，随后启动蠕动泵将一次性塑料管中的FeO4 溶液迅速注入到发光皿中，
2‑
FeO4 浓度控制为0.001mol/L，同时，打开化学发光信号检测仪器收集光信号。

[0055] 为验证本发明的有益效果，发明人进行了大量的实验研究，实验过程和结果如下：

[0056] 1试药试剂

[0057] 六氯环三磷腈(PCT)和高铁酸钾(K2FeO4)购自上海泰坦科技有限公司；咯喹酮(Pyn)购自坛墨质检科技有限公司；丙酮购自重庆川东化工(集团)有限公司[0058] 2仪器

[0059] 化学发光信号均采用超弱化学发光仪器(BPCL‑2‑TGG，中国广州微光科技有限公司)进行检测；PNDs的TEM图像由Tecnai G2 F20 S‑Twin(赛默飞，美国)拍摄，加速电压设置为200kV。用X'PertPROMPD(帕纳科,荷兰)对X射线衍射(XRD)进行了分析测试。聚四氟乙烯内衬的反应釜购买于西安洪辰仪器设备有限公司。

[0060] 3PNDs探针制备方法

[0061] 将20mg六氯环三磷腈(PCT)与20mL乙醇混合，然后转移到聚四氟乙烯内衬的高压釜中180℃下反应12h，冷却至室温后在50℃下通过旋转蒸发法去除乙醇，得到沉淀物加入丙酮1mL，在3000rpm条件下离心10min得到沉淀物。最后，在70℃真空干燥约6h得到淡黄色固体。使用时，将所得产物溶解于去离子水中，形成含有PNDs(1mg/mL)的溶液，即可获得PNDs探针。

[0062] 4对PNDs探针进行TEM图像表征

[0063] 对PNDs探针进行TEM图实验，如附图1所示，为纳米结构。由HRTEM图(附图2)可得材料的晶格间距为0.19nm，对应XRD谱图(200)晶面。另外XRD谱图(附图3)，红色曲线为PNDs的XRD图谱，蓝色曲线为原料PCT的标准卡片。TEM和XRD实验表明成功得到氮化磷量子点。

[0064] 5PNDs发光探针检测咯喹酮的方法及结果

[0065] 5.1PNDs/FeO42‑/Pyn化学发光体系的构建

[0066] 本发明利用传统的化学发光装置采用蠕动泵静态注射法进行检测，包括进样系2‑
统、反应系统和检测系统。进样系统的主要作用是通过蠕动泵将200μL FeO4 溶液引入反应系统。200μL PNDs发光探针和100μL Pyn混合溶液置于反应系统的发光皿中，与蠕动泵引入的溶液反应，即为反应系统。反应产生的发光信号由配有光电倍增管的BPCL超弱发光分析仪监测，设置光电倍增管的工作电压为‑1000V，BPCL超弱发光分析仪的数据集成时间为
0.1s。

[0067] 5.2PNDs/FeO42‑/Pyn化学发光体系检测Pyn

[0068] PNDs/FeO42‑/Pyn体系用来检测小麦幼苗中的Pyn，FeO42‑浓度控制为0.001mol/L，PNDs的浓度为1mg/mL。Pyn浓度用于Pyn的定量分析，进样浓度线性关系如附图4所示，检测‑7 ‑7Pyn的线性范围为1.1×10 ‑9.2×10 mol/L，计算可得检出限为14nM。因此，该探针检测Pyn的性能较好，作为一种Pyn的化学发光探针是可行的。

[0069] 5.3检测小麦幼苗中的Pyn

[0070] 在相同条件下同时培养两批小麦种子，第一批在含有50mg/L咯喹酮的无菌营养液中培养，同时用50mg/L咯喹酮溶液喷洒叶片培养10天。第二批在含有50mg/L咯喹酮的无菌营养液中培养，同时用超纯水喷洒叶片培养10天。待小麦生长成20‑30cm的植株。采集第一批植株用纸巾干燥后，将植株分为根茎和叶两部分，称取重量。然后充分破碎搅拌植株分别溶解于100mL超纯水中超声30min，在4000转/min下离心10min除去杂质，重复3次以提取Pyn。测定根茎和叶两部分的外部残留Pyn浓度分别为10.4μg/g和7.3μg/g。采集第二批植株用超纯水充分清洗表面Pyn，用纸巾干燥后，按上述步骤同样处理。测定根茎和叶两部分的内部吸收Pyn浓度分别为0.32μg/g和0.14μg/g。经过三次平行测量后，如表1所示，Pyn的回收率在96％～112.3％之间。

[0071] 计算方式：I＝455.98[Pyn]×10‑7+346.15，将实际样品的化学发光强度代入此方程式，得出相应的浓度(附图5)。

[0072] 表1用PNDs/FeO42‑发光体系测定小麦中的Pyn

[0073]

[0074] 6结论

[0075] 本发明开发了一种新的化学发光策略来检测农药咯喹酮。PNDs催化FeO42‑分解产·‑ ·‑ 1 1生超氧阴离子O2 ，随后Pyn被超氧阴离子O2 激活产生大量单线态氧O2，单线态氧O2二聚
1 *
后成为激发分子(O2)2，其回到基态时释放475nm处的强烈化学发光。在这种情况下，我们
2‑
开发了一个高灵敏度检测Pyn的PNDs‑FeO4 化学发光传感平台并采用该方法成功检测出Pyn在小麦培养物根茎和叶的外部表面残留量和内部吸收痕量。总的来说，基于PNDs纳米探针的化学发光法检测Pyn具有选择性高、检测成本低和操作简便等优点。