[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及青蒿琥酯在预防或治疗唾液腺放射性损伤方面的用途。

[0002] 鼻咽癌(NPC)是一种起源于鼻咽部上皮的癌症，其全球分布呈现出明显的地理特征：在东亚和东南亚高度流行。在我国，华南地区的发病率明显高于全国平均水平。鼻咽癌因其解剖位置特殊，无论开放或内镜手术均难以彻底切除且造成重要神经和大血管牺牲。此外，其有别于鳞状细胞癌为主的其他头颈癌，鼻咽癌的病理类型绝大多数为非角化未分化癌，对放疗敏感，故放疗历来是鼻咽癌的主要治疗手段。由于口腔颌面部为人个体的容貌、语言、进食、咀嚼、吞咽、味觉感官等重要器官、感官和组织结构所在部位，尽管随着鼻咽癌放疗技术的不断进步，靶区的控制越来越精准，但在放疗过程中仍不可避免地会对周围正常组织造成一定损伤，如：放射性口腔粘膜炎，唾液腺功能障碍，猛性龋和放射性颌骨坏死等，严重影响患者的生存质量，甚至引发一系列社会心理问题。

[0003] 临床上，口干是头颈部放疗患者就诊口腔科早期最主要的主诉症状之一，即使放射技术不断改进仍不可避免。唾液分泌减少且粘度增加，降低了唾液的pH值和缓冲功能，使电解质的浓度改变，并改变其免疫系统的组成，进一步破坏正常的口腔菌群结构，使得已经因放射造成机械损伤的牙体硬组织易于发生龋坏，再加上患者因为口干和疼痛带来的嗜柔软且富有碳水的饮食习惯改变，加大了口腔卫生维护的难度，猛性龋的发生率大大提高，并很快发展成牙髓炎、根尖炎，使完整的牙体组织仅剩残冠、残根；局部的急、慢性炎症刺激或拔除这些残冠残根造成的创伤是诱发放射性颌骨坏死的一个重要因素。减少唾液腺损伤，解决放射性口干似乎是减少口腔并发症的一个关键点。

[0004] 现阶段对放射性口干的治疗策略主要有四个方面：一是使用人工唾液，凝胶，漱口水等唾液替代品，二减轻唾液腺的放射损伤，其中包括不断改进放疗技术，减轻对正常组织的损伤，放疗之前手术转移颌下腺至靶区外，使用氨磷汀或其他药物。三是通过药物或物理疗法刺激剩余唾液腺的分泌功能。最后一点为使用基因疗法或干细胞移植促进唾液腺组织再生。但到目前为止，尚未找到切实有效的治疗方式。因此开发新的治疗放射性口干策略仍有重要的临床意义。

[0005] 放疗引起的腺体组织的损伤，包括实质腺泡细胞、内皮细胞、干细胞和副交感神经，放疗开始后几天内即可发生细胞凋亡及炎症反应，首先是浆液性腺泡细胞受到损伤，然后是黏液性腺泡细胞，后期腺体血管化程度降低，纤维组织的形成进一步造成腺体细胞密度降低，直至唾液腺分泌功能受到不可逆的损伤，唾液腺由于放射后发生炎症反应，细胞凋亡和纤维化直至出现临床症状的时间可长达3‑6个月。这一过程可以看出活性氧与自由基是引发损伤的重要因素，氨磷汀作为目前已应用于临床的抗辐射药物，正是通过清除细胞内自由基而起到保护作用的。

[0006] 青蒿素类药物是恶性疟治疗的一线药物，近半个世纪以来，得到了越来越广泛的应用，青蒿琥酯(ART)作为青蒿素的水溶性衍生物，除了抗疟还有多种药效，例如抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、抗纤维化、保护血脑屏障和免疫调节作用，具有低毒、可口服及静脉针剂等多途径给药的特点，是一种安全的药理学药剂。目前，还未有相关报道涉及从唾液腺放射性损伤的病理基础出发，探索青蒿琥酯在这一损伤过程中所发挥的作用，即是否能够减少放射造成的炎症及细胞凋亡，进一步研究其具体机制是否与降低放射造成的氧化应激相关，以及是否能够给出用于预防或治疗唾液腺放射性损伤的新的用药途径。

[0026] 为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步非限制性的详细描述。

[0027] 本发明提供了青蒿琥酯在制备用于预防或治疗唾液腺放射性损伤的产品中的用途。所述产品可选用为食品、日用品、药物或其他可将青蒿琥酯作用于唾液腺的产品，并根据应用领域选用适宜的辅料和添加剂。

[0028] 具体地，食品根据口腔领域的使用习惯可制备成口香糖、咀嚼软糖、饼干、含片等。日用品可制备成含漱液、牙膏、口喷剂、凝胶等。以制成口香糖为例，本发明的口香糖是可以选用天然树胶或甘油树脂为胶体的基础，以青蒿琥酯为药物活性成分，根据口味需求适当加入糖浆、薄荷等添加剂，经过调和压制而成。

[0029] 具体地，所述药物包含青蒿琥酯和药学上可以接受的辅料。辅料成分包括药物载体和赋型剂。药品中可接受的载体可增强或稳定组合物，或可用于促进组合物的制备。可包括溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物稳定剂、结合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合。除非常规载体与活性成分不相容，否则均可考虑将其用于制备含有青蒿琥酯的药物中。载体可经选择以使受试者的不利副作用降至最低和/或使活性成分的失活降至最低。赋型剂是指添加至药物中以使药物具有一定形状或一定浓度的物质。例如无菌水、生理盐水、聚亚烷基二醇(诸如聚乙二醇)、植物油或氢化萘、碳酸氢钙、磷酸钙、多种糖、各种类型淀粉、纤维素衍生物、明胶等。

[0030] 具体地，本发明所述的药物可以制备成任一种便于使用的临床上可以接受的制剂，所述制剂的剂型包括经胃肠道给药剂型和非经胃肠道给药剂型；更具体地，所述制剂的剂型为口服片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、干混悬剂、混悬剂、口服液、注射剂、含漱剂和舌下片剂中的一种。

[0031] 后文将通过若干实验例阐述青蒿琥酯在放射性唾液腺损伤中的作用及机制。

[0032] 实验例1：免疫荧光

[0033] 实验材料：体外培养的大鼠下颌下腺上皮细胞。

[0034] 实验方法：

[0035] (1)脱蜡至水；

[0036] (2)将组织切片置于切片架上浸没于装满柠檬酸盐缓冲液的微波盒中放入缓冲液中，高压修复5min，流水冲洗，冷却；

[0037] (3)微波盒中加满3％ H2O2，静置10min，PBS冲洗3次；

[0038] (4)山羊血清常温封闭10min，倾去液体；

[0039] (5)一抗孵育4℃冰箱过夜；

[0040] (6)滴加二抗37℃孵育30min；

[0041] (7)DAPI染色后荧光显微镜下观察；

[0042] (8)苏木素染液复染10min，PBS洗3次；

[0043] (9)浸入盐酸乙醇中分化1min；

[0044] (10)流动自来水冲洗3次，泡水5‑6min返蓝；

[0045] (11)滴加适量中性树胶覆盖住组织，盖玻片封片，注意避免气泡产生。

[0046] 实验结果显示放射后，腺泡细胞内AQP5表达明显降低，经不同浓度的ART处理后，其表达升高明显(图1)。

[0047] 实验例2：RT‑PCR

[0048] 实验材料：体外培养的大鼠下颌下腺上皮细胞，大鼠下颌下腺；

[0049] 实验方法：

[0050] (1)采用Trizlo法，从下颌下腺组织及细胞中提取总RNA，并逆转录成cDNA；运用荧光定量RT‑PCR技术,检测以上基因的表达水平；选用管家基因GAPDH作为内参；其中，所用的基因的引物序列见表1；

[0051] (2)以2‑△△Ct法分析所研究的目标基因的相对表达量，以内参GAPDH的表达水平标准化各基因的表达水平；每个数据重复三次，计算标准差。

[0052] 实验结果显示，放射后，腺泡细胞功能降低，炎症及凋亡相关因子在RNA水平的表达在体内及体外实验中均明显升高，ART处理后，表达有明显下降(图2)，且ART激活了Nrf2及其下游因子的表达，其RNA水平明显升高(图4)。

[0053] 表1、基因的引物序列

[0054]

[0055] 实验例3：免疫印记法(Western blot)

[0056] 实验材料：体外培养的大鼠下颌下腺上皮细胞，大鼠下颌下腺组织；

[0057] 实验方法：

[0058] (1)采用RIPA法提取组织及细胞蛋白，并用BCA法测定蛋白浓度；

[0059] (2)在蛋白样本中加入其1/4体积的5×蛋白上样缓冲液，震荡混匀后100℃金属浴10min；

[0060] (3)常规Western Blot电泳转膜；

[0061] (4)暗室内化学发光及显影定影；

[0062] (5)用凝胶图象处理系统分析目标条带的分子量和净光密度值，比较目的蛋白与GAPDH条带平均灰度比值。

[0063] 实验结果显示，放射后，腺泡细胞功能降低，炎症及凋亡相关因子在蛋白水平的表达在体内及体外实验中均明显升高，ART处理后，表达有明显下降(图3)，且ART激活了Nrf2及其下游因子的表达，其RNA水平明显升高(图5)。

[0064] 实验例4：酶联免疫吸附实验(ELISA)

[0065] 实验材料：体外培养的大鼠下颌下腺上皮细胞，大鼠下颌下腺组织；

[0066] 实验方法：

[0067] (1)取细胞或组织制备样品；

[0068] (2)取出所需板条，室温复温10min；

[0069] (3)分别将100μL样品与标准品加入相应孔中，空白孔中加入100μL通用稀释液，避光37℃孵育1小时；

[0070] (4)弃去液体，所有孔加入生物素化抗体工作液100μL，避光37℃孵育1小时；

[0071] (5)弃去液体，每孔加入300μL洗涤液，静置1min，弃去液体，吸水纸上拍干，重复3次；

[0072] (6)每孔加入酶结合物工作液100μL，盖上封板膜后37℃孵育30min；

[0073] (7)弃去液体，洗涤液洗板5次；

[0074] (8)每孔加入底物90μL，盖上封板膜后37℃避光孵育15min；

[0075] (9)取出酶标板，每孔直接加入50μL终止液，测定450nm波长处测的OD值。

[0076] 实验结果显示，放射后，细胞内氧化应激水平增高，MDA表达水平明显上升，ART处理后，激活了Nrf2信号通路，其下游的抗氧化酶：SOD,CAT,GSH‑Px显著升高(图6)。

[0077] 实验例5：TUNEL染色

[0078] 实验材料：体外培养的大鼠下颌下腺上皮细胞。

[0079] 实验方法：

[0080] (1)从玻片盒中取出玻片，烤片、脱蜡复水、高温修复步骤同前；

[0081] (2)甩干组织样本周围的液体，使用免疫组化笔圈定待测组织区域；

[0082] (3)蛋白酶K通透：每个样本滴加100μL蛋白酶K工作液，将玻片转移至湿盒中，37℃消化20min。PBS缓冲液冲洗3次，每次3min；

[0083] (4)TUNEL反应：每个样本滴加50μL的TUNEL反应液，置于湿盒中，37℃避光孵育2h。PBS缓冲液冲洗3次，每次3min；

[0084] (5)滴加DAPI染液，置于湿盒中，室温避光孵育10min。PBS缓冲液冲洗3次，每次3min；

[0085] (6)荧光显微镜下观察并采集图像分析。

[0086] 实验结果显示，抑制Nrf2通路后，大鼠下颌下腺上皮细胞在放射后凋亡明显增加(图7)。

[0087] 本发明成功建立了大鼠下颌下腺上皮细胞体外放射模型。发现细胞放射后分泌功能降低，炎症和凋亡相关因子表达水平升高，青蒿琥酯的预处理可以改善这种趋势，并且筛选出最佳的药物浓度为10μmol/L。进一步的体内实验也经过青蒿琥酯灌胃处理，大鼠放射后出现的脱毛减重等情况均得到缓解，减轻了下颌下腺的结构破坏、炎症反应及细胞凋亡，并且筛选出最佳的药物浓度为20mg/kg。通过网络药理学的研究推测青蒿琥酯在本研究放射模型中的保护作用可能与Nrf2激活，减轻放射后氧化应激相关，并通过体内模型中得到证实。进一步的体外模型实验表明抑制Nrf2后，体外模型细胞内氧化应激水平升高，炎症及凋亡明显增加。综上所述，青蒿琥酯通过促进Nrf2易位入核，上调了抗氧化蛋白的表达，降低氧化应激水平，减轻了炎症及凋亡。

[0088] 本发明创新性地将青蒿琥酯应用于唾液腺的放射性损伤，发现其在大鼠下颌下腺中的抗炎及抗凋亡作用，研究结果显示其作用可能与Nrf2信号通路的激活相关，并且通过体外实验进一步验证了这一点，这也表明青蒿琥酯预防及减轻唾液腺放射性损伤可能是一个可行的策略。