[0001] 本发明属于生物催化制药术领域，具体为能催化S‑牛心果碱生成萨卢它定的蛋白酶及用途。

[0002] 在生物催化技术领域，合成具有生物活性的复杂有机分子一直是一个挑战。特别是对于萨卢它定(Salutaridine)这类具有重要药用价值的化合物，传统的化学合成方法存在诸多限制，如步骤繁琐、产率低、副产物多、需要使用有害化学试剂等。近年来，随着酶催化技术的发展，人们开始寻求利用酶作为催化剂来合成萨卢它定，以期达到更高效、环保的生产过程。

[0003] 目前研究认为，S‑牛心果碱通过差向易构酶(REPI)转化成R‑牛心果碱，再经过萨卢它定合成酶SalSyn将R‑牛心果碱环化而成萨卢它定，然后经各种酶催化生成吗啡烷类生物碱。已知R‑牛心果碱环化而成萨卢它定这一步的氧化的产率只有0.02％，转化效率很低。而本发明人找到了一种可以直接将S‑牛心果碱转化成萨卢它定的合成酶，极大的提高了催化效率。

[0024] 为了使本领域技术人员更好地理解技术方案，下面结合实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。

[0025] 实施例1青风藤SinSyn1基因合成：

[0026] 对已建立的青风藤转录组数据库信息进行检索，得到SinSyn1基因序列(SEQ ID NO:5所示)，由安徽通用生物完成基因合成。其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0027] 青风藤SinSyn1基因的生物信息分析：

[0028] 通过ExPASy Protparam生物信息学工具对SinSyn1基因编码蛋白的氨基酸序列进行理化性质分析。分析结果显示SinSyn1基因编码532个氨基酸，SinSyn1蛋白分子质量是60.074kDa，推测SinSyn1蛋白的分子式为C2713H4257N727O758S28，等电点PI为6.61；不稳定系数为37.44，一般认为稳定系数小于40为稳定蛋白，因此SinSyn1为稳定蛋白；平均亲水性为‑
0.080，为亲水蛋白。SinSyn1蛋白属于细胞色素P450家族。

[0029] 用SignalP‑5.0Server在线软件在线软件对青风藤SinSyn1蛋白的信号肽进行预测，C值、S值和Y值趋于平缓，均小于0.5，可知在SinSyn1蛋白的氨基酸序列中不存在信号肽，SinSyn1蛋白是一种非分泌蛋白。

[0030] 通过Prot Scale在线程序进行亲水性分析，发现SinSyn1蛋白的肽链总体表现为亲水性，因此可以认为青风藤SinSyn1蛋白质属于亲水性蛋白。

[0031] 采用SWISS‑MODEL对青风藤SinSyn1蛋白的氨基酸序列进行分析，同源建模预测SinSyn1蛋白的三级结构，SinSyn1蛋白三级结构与丹参CYP76AH1三级结构最相似，相似度为29.55％。

[0032] 使用DNAMAN将已知的P450家族的酶与青风藤SinSyn1蛋白进行氨基酸序列多重序列比对。发现SinSyn1蛋白与P450家族的酶有相似的保守区域，序列保守性较高。使用MEGA.X构建的系统进化树显示SinSyn1与罂粟中的萨卢它定合成酶(PsSAS)关系较近。

[0033] 实施例2SinSyn1蛋白的表达及功能验证：

[0034] 1.表达载体

[0035] 表达载体上海钰博生物公司pESC‑His的表达载体，表达载体接入目的基因SinSyn1的质粒图谱见图1。

[0036] 2.试验试剂和仪器

[0037] 试剂和所使用仪器详见表1。

[0038] 表1主要试剂和仪器

[0039]

[0040]

[0041]

[0042] 3.主要溶液配制方法

[0043] 本实施例所使用的主要溶液的配制方法：

[0044] LB液体抗性培养基(Amp)：配制和LB培养基相同，待培养基温度降至55℃以下时加入1mL过滤除菌的氨苄青霉素溶液(100mg/mL)混匀即可。

[0045] LB抗性平板(Amp)：配制和LB培养基基本相同，还需要加入15g琼脂粉，待培养基温度降至55℃，加入1mL过滤除菌的氨苄青霉素溶液(100mg/mL)混匀后倒平板。

[0046] 2％葡萄糖的SC‑His液体培养基：称20g葡萄糖，8g SC‑His，加入1000mL去离子水，115℃蒸汽灭菌20min。

[0047] 2％葡萄糖的SC‑His平板：称取15g琼脂粉，20g葡萄糖，8g SC‑His，加入1000mL去离子水，115℃蒸汽灭菌20min。

[0048] 2％半乳糖的SC‑His液体培养基：称20g半乳糖，8g SC‑His，加入1000mL去离子水，115℃蒸汽灭菌20min。

[0049] YPD液体培养基：称取胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，20g葡萄糖，加入1000mL去离子水，115℃蒸汽灭菌20min。

[0050] YPD平板：配置和YPD培养基基本相同，加入20g琼脂粉，待培养基温度降至60℃倒板。

[0051] 3M乙酸钠：称取246g乙酸钠，加入1000mL去离子水溶解。

[0052] 考马斯亮蓝染色液：称取考马斯亮蓝R‑2501g，量取异丙醇250mL、冰醋酸100mL、去离子水650mL先后加入，充分混匀即得。

[0053] 考马斯亮蓝脱色液:量取冰醋酸100mL，乙醇50mL，去离子水850mL，充分混匀即得。

[0054] 实施例3SinSyn1基因的真核表达：

[0055] 1.SinSyn1基因的克隆：

[0056] 根据pESC‑His的多克隆位点以及SinSyn1核酸序列，利用Primer Premier 5设计SinSyn1基因引物SinSyn1‑F和SinSyn1‑R。单下化线为酶切位点(分为EcoRI和NotI酶切位点)，双下划线为6×His标签。

[0057] SinSyn1‑F:ATTTTTGAAAATTCGAATTCATGGAATTTCACTTGCTGTTGCAGGC

[0058]

[0059] 以pPICZA‑SinSyn1为模板，SinSyn1‑F和SinSyn1‑R为引物，扩增带有EcoRI和NotI酶切位点的SinSyn1基因反应体系如表2，PCR扩增程序：预变性98℃‑2min，变性98℃‑10s，退火68℃‑10s，延伸72℃‑40s，终变性72℃‑5min，循环数为35。

[0060] 表2PCR反应体系

[0061]组分 体积(μL)
金牌Mix(green) 45μL
pPICZA‑SinSyn1(100ng/μL) 1μL
SinSyn1‑F 2μL
SinSyn1‑R 2μL
总体积 50μL

[0062] PCR结束后，取10μL PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，反应时间30min，120V。用凝胶成像系统观察电泳结果。

[0063] 2.载体酶切和目的基因的纯化

[0064] 用EcoRI和NotI酶对纯化目的基因和载体pESC‑His进行双酶切，反应体系如表3，混匀后37℃孵育4h。取5μL酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，反应时间30min，120V。用凝胶成像系统观察电泳结果。

[0065] 表3酶切反应体系

[0066]

[0067] 酶切后目的基因和pESC‑His载体用全式金试剂盒进行回收。具体纯化步骤见PCR Purification Kit。

[0068] 3.pESC‑His‑SinSyn1载体构建

[0069] 将纯化回收的具有粘性末端的pESC‑His与SinSyn1进行连接，反应体系见表4。10μL反应体系中，pESC‑His载体与SinSyn1加入量均在0.01‑0.25pmols，摩尔比接近1:2。轻轻混合，50℃反应30min。反应结束后，将离心管置于冰上冷却数秒。随后转化到大肠杆菌Top10感受态中，取100μL涂布于Amp抗性的LB平板上，37℃过夜培养。

[0070] 表4克隆反应体系

[0071]Component Volume
2×BasicAssemblyMix 5μL
pESC‑His xμL
Inserts yμL
ddH2O to10μL

[0072] 4.阳性克隆载体的鉴定和质粒提取

[0073] 用GAL10引物进行菌落PCR来鉴定阳性克隆，PCR鉴定程序：预变性预变性94℃‑2min，变性94℃‑25s，退火55℃‑25s，延伸72℃‑40s，终变性72℃‑5min，循环数为35，循环数为30。PCR结束后，取10μLPCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，反应时间30min，120V。用凝胶成像系统观察电泳结果。将经PCR鉴定的阳性克隆接种于LB液体(Amp)抗性培养基中，置于恒温摇床中200rpm，37℃培养12h。将菌液送到北京擎科生物科技有限公司进行测序。

[0074] 5.重组质粒的提取

[0075] 将送去测序且通过NCBI进行Blast和SinSyn1基因匹配无误的菌液，加入LB液体(Amp)抗性培养基，置于恒温摇床中200rpm，37℃培养12h。提取质粒具体步骤如下：

[0076] (1)取2mL过夜培养的菌液，10000rmp离心1min，吸尽上清；

[0077] (2)加入250μL RB(含RNaseA)，振荡，悬浮菌体沉淀；

[0078] (3)加入250μL LB，上下翻转混合4‑6次，使菌体充分裂解；

[0079] (4)加入350μLNB，轻轻混合5‑6次，直至形成紧实的黄色凝集块，置于室温下静置2min；

[0080] (5)12000rmp离心5min，吸取上清加入离心柱中，12000rmp离心1min，弃流出液；

[0081] (6)加入650μLWB，12000rmp离心1min，弃流出液；

[0082] (7)12000rmp离心2min，彻底去除残留的WB；

[0083] (8)将离心柱置于新的离心管中，在离心柱的中央加入50μL 60℃预热去离子水，室温静置1min；

[0084] (9)10000rmp离心1min洗脱DNA，洗脱得到的DNA置于‑20℃保存备用。

[0085] 6.重组质粒pESC‑His‑SinSyn1转入酿酒酵母

[0086] 将pESC‑His‑SinSyn1转化到WAT11感受态细胞。取WAT11感受态细胞100μL于冰上融化，依次加入预冷的目的质粒5μg，Carrier DNA(100℃，5min，快速冰浴，重复一次)10μL，PEG/LiAc 500μL并吹打几次混匀，30℃水浴30min(15min时翻转6‑8次混匀)。将离心管置于42℃水浴15min(7.5min时翻转6‑8次混匀)。5000rpm离心40s弃上清，ddH2O400μL重悬，离心
30s弃上清。SC液体培养基500μL重悬，涂板，30℃培养48‑96h。筛选培养基北京酷莱博科技有限公司SC系列产品。

[0087] 7.pESC‑His‑SinSyn1转入酿酒酵母阳性菌筛选

[0088] 挑取转化的单克隆接种于1mL SC液体培养基中，200rpm，30℃培养36h。将培养过夜的菌液取200μL于1.5mL的EP管中，10000rmp离心1min收集沉淀。将沉淀加入30μLMightyPrep reagent for DNA，100℃加热10min。10000rmp离心2min，上清液作为PCR反应的模板。PCR反应程序及反应体系同上述表2。

[0089] 8.SinSyn1蛋白诱导表达及SDS‑PAGE

[0090] 取验证成功转入pESC‑His‑SinSyn1质粒的WAT11单克隆培养的菌液200μL接种于20mL的液体SC培养基中，在30℃、200rpm条件下培养24h后，再转接至200mL的SC(加入2％半乳糖)液体培养基中，初始接种OD600为0.4，30℃、200rpm培养72h。

[0091] 取1mL菌液作为诱导后标本，10000rmp离心1min收集沉淀。将诱导后的1mL菌液沉淀用40μLPBS重悬，加入等体积的2×SDS上样缓冲液。沸水加热5min，‑20℃放置5min，再沸水加热5min，取20μL上样进行SDS‑PAGE。电泳结束后，凝胶经考马斯亮蓝染色过夜并脱色，用凝胶成像系统进行观察。

[0092] 9.Westernblot

[0093] (1)样品制备：实验步骤同上述8‑SinSyn1蛋白诱导表达及SDS‑PAGE；

[0094] (2)电泳结束后用切胶板将凝胶割至合适大小，放置于孵化盒中，加入适量转膜缓冲液于水平摇床缓慢摇动；预先裁好6张比胶条略大的滤纸和一张与胶条一致大PVDF膜，膜放置于甲醇浸泡10s，将滤纸放置于凝胶上方，PVDF膜放置于滤纸上方，期间膜和胶不能接触，再加入转膜缓冲液使膜能在摇动时被缓冲液覆盖，缓慢摇动20min；

[0095] (3)蛋白的膜转移：使用半干转印槽进行蛋白的膜转移，转膜装置从下至上依次按3层滤纸、PVDF膜、凝胶、3层滤纸的顺序放好，形成“三明治”的结构；凝胶和PVDF膜要精确对齐，去除气泡，将装置上多余的液体吸干，盖上电极和装置。接通电源，设置电流100mA，转膜时间为13min。转膜结束后，加入TBST缓冲液，摇床缓慢摇动5min去除残留的转膜缓冲液；

[0096] (4)称取脱脂奶粉1.0g，加入20mLTBST缓冲液溶解，搅拌混匀，将此牛奶加入到含有PVDF膜的孵化盒中摇床缓慢摇动，室温孵育2h以上；

[0097] (5)免疫杂交：丢弃脱脂牛奶，用TBST缓冲液洗膜，5min×3次。弃缓冲液，加入10mL一抗(一抗使用小鼠His‑tag单克隆抗体，按1：2000用抗体稀释液稀释)，液体必须覆盖膜的全部，室温摇床缓慢摇动，孵育1h；

[0098] (6)回收一抗，用适量体积TBST缓冲液洗膜，5min×4次；

[0099] (7)加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按1:2000用抗体稀释液稀)，平稳摇动，室温孵育1h。回收二抗，用适量体积TBST缓冲液洗膜，5min×4次；

[0100] (8)采用DAB显色试剂盒进行显色。

[0101] 实施例4SinSyn1体外催化功能验证：

[0102] 1.体外酶活性实验

[0103] 实验步骤如下：

[0104] (1)将阳性酵母菌株取100uL接种到50mL含2％葡萄糖的SC‑His液体培养基中，30℃振荡220rpm培养24h；

[0105] (2)4000rpm，5min离心收集酵母细胞，弃去上清，沉淀的细胞用含2％半乳糖的SC‑His液体培养基重新悬浮；

[0106] (3)重复步骤(2)操作3次，细胞沉淀用10mL含2％半乳糖的SC‑His液体培养基悬浮，并调节OD600至1.0；

[0107] (4)以上悬浮液30℃振荡220rpm培养13h后，添加底物喂食，至终浓度为0.1mM；

[0108] (5)继续在30℃振荡220rpm培养5h，取1mL菌液于5mL离心管中，用1mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液氮吹至干，用0.6mL甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤，最后上液质分析结果，所有试验独立重复3次；

[0109] (6)以空载阳性菌为对照，同以上条件培养和处理。

[0110] 2.催化产物的检测

[0111] 以S‑牛心果碱作为底物的催化产物使用LC‑MS/MS进行检测。色谱条件：色谱柱：Agilent Poroshell 120EC‑C183.0×100mm，2.7μm；流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：甲醇，检测器DAD参数：210nm；柱温：30℃；进样量：10μL；洗脱程序：8minA：95％；8‑15minA：70％‑
45％；15‑20minA：45％‑30％。质谱条件：电喷雾离子化源(ESI)；毛细管电压：3.5kV；干燥气温度：300℃；干燥气流速：11L/min；碎裂电压：500V；正离子模式扫描检测，一级质谱扫描范围：m/z100‑1000。

[0112] 3.结果与分析

[0113] SinSyn1基因PCR扩增：

[0114] 以pPICZA‑SinSyn1基因克隆载体质粒为模板，用SinSyn1的SinSyn1‑F和SinSyn1‑R扩增引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，测序鉴定后目的片段的长度为1654bp。

[0115] 表达载体构建和鉴定：

[0116] SinSyn1基因与表达载体pESC‑His连接后，重组载体转化大肠杆菌Top10感受态细胞，使用LB(Amp)抗性平板进行筛选。挑取单克隆进行菌落PCR检测，1％琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR结果如图3所示。将鉴定正确的重组质粒送往北京擎科生物技术有限公司进行测序，测序结果表明SinSyn1基因成功插入pESC‑His表达载体中。

[0117] SinSyn1蛋白SDS‑PAGE检测以及Westernblot：

[0118] 将用2％半乳糖的SC‑His液体培养基诱导的破碎蛋白通过SDS‑PAGE分析。SDS‑PAGE结果如图4所示，显示SinSyn1重组蛋白成功得到表达，分子量约为60.00KDa。在破碎蛋白上清得到蛋白，SinSyn1为可溶性蛋白。将重组蛋白进行Westernblot结果如图5。

[0119] SinSyn1蛋白酶催化实验及检测：

[0120] 为验证得到SinSyn1重组蛋白是能够催化S‑牛心果碱((S)‑Reticuline)，以S‑牛心果碱作为催化底物，30℃反应5h。通过LC‑MS/MS检测酶催化产物，结果如图6所示，催化产物液质色谱图中，6.967min出现萨卢它定(Salutaridine)的特征峰，7.017min出现产物清风藤碱(Sinoacutine)的特征峰，催化产物中的清风藤碱和萨卢它定的质谱图显示对应加氢特征离子(m/z)为328.1560。结果表明SinSyn1重组蛋白能够催化S‑牛心果碱氧化还原生成清风藤碱和萨卢它定。

[0121] 其他三种SinSyn2酶、SinSyn3酶、SinSyn21酶的重组过程和上述实施例相同。

[0122] 需要说明的是，在本文中，术语：包括、包含及任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。本文中应用了具体个例对本发明技术方案的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。