技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种纤溶酶原活性测定试剂盒。
相关背景技术
[0002] 纤溶酶原(PLG)是一种单链糖蛋白，主要由肝脏合成。依据N末端氨基酸的不同，将纤溶酶原分为谷‑PLG及赖‑PLG，其分子量分别为92000及82000，在体内半衰期分别为2.25±0.29天及0.8天。PLG不溶于酸性溶液但可溶于中性溶液中。PLG是纤溶酶(PL)的前体，由组织激活物t‑PA、尿激酶或凝血接触阶段多种酶激活，外源性激活物如链激酶也可起激活作用。纤溶酶原被激活后变成纤溶酶(PL)，可以降解纤维蛋白原、纤维蛋白和多种凝血因子，起着对抗凝血和溶栓的生理作用。PLG是纤维蛋白溶解系统的重要组成部分，在多种生理和病理过程中起着重要作用。
[0003] 目前，对纤溶酶原的测定方法可分为两大类：间接法和直接法。直接法可以直接测得纤溶酶原的含量，间接法则是依赖于纤溶酶原转化成为纤溶酶，分析纤溶酶的活性而间接得到纤溶酶原的活性。其中，直接法测定得到的纤溶酶原含量并不能真实反映患者体内纤溶酶原发挥作用的部分，仅仅是纤溶酶原的含量，临床上参考价值不大。通过间接法测得的纤溶酶原活性则可以真实的反映患者体内参与生理活动的纤溶酶原活度。常用来测定纤溶酶原活性的方法主要采用底物显色法检测，生物制药中筛选产纤溶酶菌株及纯化监测多采用纤维蛋白板法和气泡法进行半定量分析，显然半定量分析的方法并不适用于临床检测使用，所以底物显色法成为目前临床上纤溶酶原活性的主要方法。
[0004] 国内市售的纤溶酶原活性测定试剂盒(发色底物法)主要是进口厂家西门子，其价格昂贵，采货周期较长，并且为冻干粉形态，制作工艺繁琐，成本高且试剂的瓶间差也会因冻干被拉大，冻干粉试剂使用前均需要复溶，并且静置一段时间后才能使用，不利于用户的操作。此外，该类纤溶酶原活性测定试剂盒不附赠复溶剂，用户自行选用的复溶剂质量无法把控，对测试结果带来了一定的影响。
具体实施方式
[0027] 本发明的纤溶酶原活性测定试剂盒，包括液态的第一试剂(可称PLG R1)和第二试剂(可称PLG R2)，进一步还可包括液态的PLG稀释液。第一试剂、第二试剂和PLG稀释液的pH均为7.2～7.6。
[0028] 其中，第一试剂(PLG R1)可包括链激酶、第一缓冲液、第一稳定剂和第一防腐剂。
[0029] 链激酶为纤溶酶原激活剂，能和纤溶酶原结合，将纤溶酶原激活为纤溶酶。在第一试剂中，链激酶的浓度为0.1IU/mL～0.5IU/mL。
[0030] 第一缓冲液在第一试剂中的浓度为50mmol/L～100mmol/L，其进一步可以是三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)，通过使用该特定的缓冲体系能够提高试剂的灵敏度，增加不同浓度样本的区分度，有利于定标操作、线性范围建立以及临床样本测试。第一缓冲液还可以为Hepes(4‑羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液、MES(2‑(N‑吗啉代)乙磺酸)缓冲液、MOPS(3‑(N‑吗啉基)丙磺酸)缓冲液、柠檬酸缓冲液或者PBS(磷酸盐)缓冲液。
[0031] 第一稳定剂用于延长试剂盒的稳定性，利于试剂盒的长期使用和存储，其可包括蛋白酶保护剂；蛋白酶保护剂进一步可包括Prionex。第一稳定剂还可包括氯化钠、谷氨酸、蔗糖、聚乙二醇2000(PEG‑2000)和NP‑40中一种或多种。
[0032] 在第一稳定剂中，Prionex对蛋白酶起到最主要的保护作用，氯化钠、谷氨酸、蔗糖、聚乙二醇2000(PEG‑2000)和NP‑40对蛋白酶也能起到一定的保护作用，以提高试剂盒的稳定性。
[0033] 另外，第一稳定剂还可包括BSA、HSA、明胶、吐温‑20、海藻糖、葡萄糖、β‑环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或多种，同样提高试剂盒的稳定性。
[0034] 第一防腐剂可为Proclin‑300、叠氮化钠、苯甲酸钠、庆大霉素以及亚硝酸盐等中的一种或多种，防止试剂盒受微生物污染，避免因微生物污染导致试剂盒失效的问题，有利于延长试剂盒的储存有效期。
[0035] 第二试剂(PLG R2)可包括发色底物S‑2251、第二缓冲液、第二稳定剂和第二防腐剂。发色底物S‑2251在第二试剂中的浓度可为0.5mg/ml～2mg/ml。
[0036] 第二缓冲液在第二试剂中的浓度为50mmol/L～100mmol/L，其进一步可为三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液)，通过使用该特定的缓冲体系能够提高试剂的灵敏度，增加不同浓度样本的区分度，有利于定标操作、线性范围建立以及临床样本测试。第二缓冲液还可以为Hepes(4‑羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液、MES(2‑(N‑吗啉代)乙磺酸)缓冲液、MOPS(3‑(N‑吗啉基)丙磺酸)缓冲液、柠檬酸缓冲液或者PBS(磷酸盐)缓冲液。
[0037] 第二稳定剂对试剂盒的稳定性也起到提高和延长作用，其可包括氯化钠、谷氨酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和NP‑40中的一种或多种。
[0038] 第二稳定剂还可包括BSA、HSA、明胶、吐温‑20、海藻糖、葡萄糖、β‑环糊精、甘露醇和氯化钾中的一种或多种，同样提高试剂盒的稳定性。
[0039] 同理于第一防腐剂，第二防腐剂用于防止试剂盒受微生物污染，避免因微生物污染导致试剂盒失效的问题，有利于延长试剂盒的储存有效期。该第二防腐剂可为Proclin‑300、叠氮化钠、苯甲酸钠、庆大霉素以及亚硝酸盐中的一种或多种。
[0040] PLG稀释液进一步可包括第三缓冲液、第三防腐剂及氯化钠。
[0041] 第三缓冲液在PLG稀释液中的浓度为50mmol/L～100mmol/L，其具体可为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，第三缓冲液也可为Hepes缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸缓冲液或者PBS缓冲液。
[0042] 第三防腐剂同理于第一防腐剂和第二防腐剂的作用，其选择也可参考第一防腐剂和第二防腐剂，即为Proclin‑300、叠氮化钠、苯甲酸钠、庆大霉素以及亚硝酸盐中的一种或多种。
[0043] 氯化钠在PLG稀释液中的浓度为0.5％～1.5％。
[0044] 本发明的纤溶酶原活性测定试剂盒中，第一试剂、第二试剂和PLG稀释液中各组分的浓度可如下表1所示。
[0045] 表1
[0046]
[0047] 注：“/”表示不含此成分，下方表2‑表4相同；各试剂组分的选择并不限于上述表1。
[0048] 本发明的纤溶酶原活性测定试剂盒，适用于发色底物方法，实现对血浆中的纤溶酶原活性的检测，能够为患者的溶栓治疗提供有效监测。
[0049] 本发明通过使用PLG R1、PLG R2、PLG稀释液搭配全自动凝血分析仪对纤溶酶原活性进行测定，所得结果准确可靠，可以满足临床对于纤溶酶原活性测定的需要。
[0050] 以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
[0051] 实施例1：
[0052] 纤溶酶原活性测定试剂盒的各试剂的组分及其含量如下表2。
[0053] 表2
[0054]
[0055]
[0056] 实施例2：
[0057] 纤溶酶原活性测定试剂盒的各试剂的组分及其含量如下表3。
[0058] 表3
[0059]
[0060] 实施例3：
[0061] 纤溶酶原活性测定试剂盒的各试剂的组分及其含量如下表4。
[0062] 表4
[0063]
[0064] 对比例1：
[0065] Tris缓冲液替换为硼酸盐缓冲液，其他均与实施例1相同。
[0066] 对比例2：
[0067] 发色底物为140450，其他均与实施例1相同。
[0068] 对比例3：
[0069] PLG R1中不含Prionex，其他均与实施例1相同。
[0070] 将实施例1～3以及对比例1～3的PLG活性测定试剂盒进行定标、空白限、准确度、线性范围、重复性、稳定性以及临床相关性测试，如下：
[0071] 一、定标及其结果
[0072] 采用实施例1～3以及对比例1的PLG活性测定试剂盒在全自动凝血分析仪上搭配PLG校准品，完成PLG项目的校准。校准品为单点校准品，仪器自动浓缩/稀释为C0、C1、C2、C3、C4、C5共5个浓度水平(C0～C5浓度依次升高)，定标结果如下表5～表8所示。定标结果应符合要求：定标曲线的线性回归方程r≥0.980。
[0073] 表5.实施例1的PLG活性测定试剂盒的定标结果
[0074]
[0075] 表6.实施例2的PLG活性测定试剂盒的定标结果
[0076]
[0077] 表7.实施例3的PLG活性测定试剂盒的定标结果
[0078]
[0079]
[0080] 表8.对比例1的PLG活性测定试剂盒的定标结果
[0081]
[0082] 从表5～表8的定标结果可知，实施例1～3标曲线性回归方程的r均≥0.980，符合要求，证明实施例1～3能得到较好的定标曲线。对比例1标曲线性回归方程的r＜0.980，不符合要求，相邻校准品的OD值没有明显差异，影响试剂的灵敏度和定标曲线的绘制。
[0083] 二、空白限测试及其结果
[0084] 采用实施例1～3的PLG测定试剂盒测定空白样本20次，按照以下的公式(1)和公式(2)计算平均值 标准差(SD)以及空白限 测试结果如下表9～表11所示。测试结果应符合要求：PLG空白限应≤6％。
[0085] 公式(1)：
[0086]
[0087] 公式(2)：
[0088]
[0089] 式中：
[0090] ——测试结果的平均值；
[0091] xi——每次的实测值；
[0092] n——测试的次数；
[0093] i——测试的序号；
[0094] B——相对偏差；
[0095] SD——标准差。
[0096] 表9.实施例1的PLG活性测定试剂盒的空白限测试结果
[0097]
[0098]
[0099] 表10.实施例2的PLG活性测定试剂盒的空白限测试结果
[0100]
[0101]
[0102] 表11.实施例3的PLG活性测定试剂盒的空白限测试结果
[0103]
[0104]
[0105] 从表9～表11的测试结果可知，实施例1‑3均符合所规定的空白限要求。
[0106] 三、准确度测试及其结果
[0107] 采用实施例1～3以及对比例2的PLG活性测定试剂盒测定PLG正确度控制品，重复测试3次，按照上述公式(1)和下述公式(3)计算相对偏差，测试结果如表12～表15所示。测试结果应符合要求：相对偏差应在±10.00％范围内。
[0108] 公式(3)：
[0109]
[0110] 式中：
[0111] T——正确度控制品标示值；
[0112] B——相对偏差。
[0113] 表12.实施例1的PLG活性测定试剂盒的准确度测试结果
[0114]
[0115]
[0116] 表13.实施例2的PLG活性测定试剂盒的准确度测试结果
[0117]
[0118] 表14.实施例3的PLG活性测定试剂盒的准确度测试结果
[0119]
[0120] 表15.对比例2的PLG活性测定试剂盒的准确度测试结果
[0121]
[0122]
[0123] 从表12～表15的测试结果可知，实施例1‑3的相对偏差比较低，证明实施例1‑3都具有很好的准确性。对比例2的相对偏差不符合均在±10.0％范围内的要求。因此，对比例2的准确性不如实施例1～3。
[0124] 四、线性范围测试及其结果
[0125] 将接近试剂盒线性范围上限的高值样本分别稀释成5个不同浓度的样本，对每个浓度的样本测试3次，以理论浓度为(xi)，实测结果均值为(yi)，求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数(r)，测试结果如下表16～表18所示。测试结果应符合要求：在10％～140％的线性范围内时，线性相关系数r≥0.980
[0126] 表16.实施例1的PLG活性测定试剂盒的线性范围测试结果
[0127]
[0128] 表17.实施例2的PLG活性测定试剂盒的线性范围测试结果
[0129]
[0130]
[0131] 表18.实施例3的PLG活性测定试剂盒的线性范围测试结果
[0132]
[0133] 从表16～表18的测试结果可知，实施例1～3均符合上述线性范围要求。
[0134] 五、重复性测试及其结果。
[0135] 采用实施例1～3的PLG活性测定试剂盒，测试PLG低值和高值质控品各10次。按照上述公式(1)和(2)计算测试结果平均值平均值 和标准差(SD)，按照下述公式(4)计算变异系数(CV)，测试结果如下表19～表21所示。测试结果应符合要求：UFH低值质控品、LMWH低值质控品、利伐沙班低值质控品变异系数(CV)≤10％；UFH高值质控品、LMWH高值质控品、利伐沙班高值质控品变异系数(CV)≤8％。
[0136] 公式(4)：
[0137]
[0138] 式中：CV为变异系数。
[0139] 表19.实施例1的PLG活性测定试剂盒的重复性测试结果
[0140]
[0141]
[0142] 表20.实施例2的PLG活性测定试剂盒的重复性测试结果
[0143] 测试次数 高值质控(％) 低值质控(％)1 94.1 49.1
2 94.4 48.5
3 92.6 47.5
4 93.3 47.7
5 93.5 46.5
6 95.3 45.6
7 90.6 47.7
8 94.5 47.6
9 91.6 47.4
10 91.0 45.3
均值 93.1 47.3
标准差(SD) 1.583 1.186
变异系数(CV) 1.70％ 2.51％
[0144] 表21.实施例3的PLG活性测定试剂盒的重复性测试结果
[0145]
[0146]
[0147] 从表19～表21的测试结果可知，实施例1‑3均符合上述重复性要求。
[0148] 六、稳定性测试及其结果
[0149] (1)、开瓶稳定性：将实施例1～3的PLG活性测定试剂盒中的PLG R1，PLG R2及PLG稀释液开瓶后置于2～8℃储存，在第0天、第10天、第15天、第18天、第19天，第21天进行准确度测试，测试结果如下表22～表24所示。测试结果应符合要求：PLG活性测定试剂盒中PLG R1、PLG R2及PLG稀释液开瓶后置于2～8℃储存可以稳定21天，即相对偏差应在±10％范围内。
[0150] 表22.实施例1的PLG活性测定试剂盒的开瓶稳定性测试结果
[0151] 测试时间 PLG相对偏差第0天 0
第5天 1.35％
第10天 2.56％
第15天 ‑5.62％
第18天 ‑6.24％
第19天 7.26％
第21天 8.24％
[0152] 表23.实施例2的PLG活性测定试剂盒的开瓶稳定性测试结果
[0153]测试时间 PLG相对偏差
第0天 0
第5天 1.26％
第10天 1.93％
第15天 4.32％
第18天 ‑5.84％
第19天 6.46％
第21天 7.34％
[0154] 表24.实施例3的PLG活性测定试剂盒的开瓶稳定性测试结果
[0155]测试时间 PLG相对偏差
第0天 0
第5天 1.45％
第10天 ‑2.36％
第15天 4.62％
第18天 5.34％
第19天 6.23％
第21天 7.23％
[0156] 从表22～表24的测试结果可知，实施例1～3符合上述开瓶稳定性要求。
[0157] (2)、加速稳定性：将实施例1～3以及对比例3的PLG活性测定试剂盒中的PLG R1、PLG R2及PLG稀释液在未开封状态下置于37℃储存，在第0天、第8天、第12天、第16天、第20天进行准确度测试，测试结果如下表25～表28所示。测试结果应符合要求：PLG活性测定试剂盒中PLG R1，PLG R2及PLG稀释液在未开封状态下置于37℃储存可以稳定16天，即相对偏差应在±10％范围内。
[0158] 表25.实施例1的PLG活性测定试剂盒的加速稳定性测试结果
[0159]
[0160]
[0161] 表26.实施例2的PLG活性测定试剂盒的加速稳定性测试结果
[0162] 测试时间 PLG相对偏差第0天 0
第8天 1.86％
第12天 3.57％
第16天 5.39％
第20天 7.59％
[0163] 表27.实施例3的PLG活性测定试剂盒的加速稳定性测试结果
[0164]测试时间 PLG相对偏差
第0天 0
第8天 3.56％
第12天 4.65％
第16天 6.59％
第20天 8.92％
[0165] 表28.对比例3的PLG活性测定试剂盒的加速稳定性测试结果
[0166] 测试时间 PLG相对偏差第0天 0
第8天 3.65％
第12天 6.49％
第16天 11.35％
第20天 15.89％
[0167] 从表25～表28的测试结果可知，实施例1‑3符合上述加速稳定性要求，未添加Prionex稳定剂的对比例3不符合上述加速稳定性要求，相比于对比例3，实施例1‑3的试剂盒具有更高的加速稳定性。
[0168] 七、临床相关性测试及其结果
[0169] 采用参比试剂盒和实施例1～3的PLG活性测定试剂盒同时测试一组覆盖线性范围的临床样本(40例)，以参比试剂盒的实测值为x轴，实施例1‑3试剂盒的实测值为y轴，做线性回归分析，测试结果如表29～表31和图1～图3所示。测试结果应符合要求：线性回归分析应符合线性回归方程的斜率k在0.9～1.1之间且相关系数r≥0.975。
[0170] 表29.实施例1的PLG活性测定试剂盒的临床相关性测试结果
[0171]
[0172]
[0173] 表30.实施例2的PLG活性测定试剂盒的临床相关性测试结果
[0174]
[0175]
[0176] 表31.实施例3的PLG活性测定试剂盒的临床相关性测试结果
[0177]
[0178]
[0179] 从表29～表31的测试结果可知，实施例1～3的试剂盒与参比试剂盒测试临床样本的结果做线性回归分析，线性回归方程的斜率k及相关性r均符合要求，证明实施例1～3的试剂盒与参比试剂盒具有良好的相关性。
[0180] 以上数据及附图表明，使用本发明的试剂盒进行相关性能测试，所得结果均符合接受标准。通过上述具体实施例来验证本发明的可行性与合理性，该实施例仅为本发明可供选择的个别实施例说明，但并不局限于此。对于本领域的技术人员而言，凡是根据本发明的专利范围所进行的变化，修改和替换均应包含在本发明的权利要求范围内，皆属于本发明的保护范畴。
