[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种高催化活性的ω‑转氨酶突变体、其构建方法及应用。

[0002] 转氨酶(EC 2.6.1.x，Transaminase)属于吡哆醛‑5’‑磷酸(PLP)依赖的酶家族，能够可逆地催化氨基从胺供体到胺受体的转移，在温和的反应条件下通过一步催化反应即可完成手性胺的不对称合成，理论收率高达100％，具有反应条件温和、立体选择性高、成本低以及绿色环保等优势，是手性胺工业合成领域最具应用前景的技术方法之一。

[0003] 根据转移氨基在碳链上的位置，可将转氨酶分为α‑转氨酶和ω‑转氨酶。其中，α‑转氨酶只转移α碳上的氨基，催化α‑氨基酸与α‑酮酸之间的氨基转移反应；ω‑转氨酶则可以接受底物是非α‑氨基酸或非α‑酮酸，即ω‑转氨酶有潜力催化任意结构的酮酸、酮、醛、胺。然而，野生型转氨酶由于底物结合口袋小，其天然底物主要是小分子氨基酸或酮酸等，对大型底物通常无活性或活性极低，成为制约转氨酶不对称催化合成手性胺化合物在工业应用方面的主要技术瓶颈。

[0004] 普拉替尼(Pralsetinib)是中国第一个获批上市的选择性受体酪氨酸激酶RET抑制剂，用于不可切除或转移性非小细胞肺癌和甲状腺髓样癌的靶向治疗。普拉替尼对机体耐受性好、特异性高且具有持久的抗肿瘤活性，是目前已发现药物中治疗转移性RET融合阳性非小细胞肺癌最有效的药物。普拉替尼的手性药物中间体(S)‑1‑(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑基)吡啶‑3‑基)乙‑1‑胺价格昂贵，其化学合成法由美国缆图药品公司开发(专利申请号：
CN202010391097.9)，路线如下所示，涉及手性助剂、多种有机催化剂和溶剂、高温和超低温等复杂苛刻的反应条件，工业化难度大、成本高。

[0005]

[0006] 综上，利用ω‑转氨酶作为催化剂不对称合成(S)‑1‑(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑基)吡啶‑3‑基)乙‑1‑胺(直接催化Ⅰ生成Ⅱ)的应用前景非常广阔，通过分子改造提升ω‑转氨酶对非天然底物的催化性能是建立ω‑转氨酶催化合成该手性胺路线的重要前提。因此，需要开发高活性的ω‑转氨酶催化剂，实现(S)‑1‑(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑基)吡啶‑3‑基)乙‑1‑胺的生物催化合成并推动绿色合成工艺的工业化应用。

[0034] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

[0035] 应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

[0036] 下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下列实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0037] 以下实施例中：

[0038] 所用的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；基于pET‑28a(+)质粒载体的ω‑转氨酶野生型质粒以及构建定点突变质粒的引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成；所用的DNA聚合酶、DpnⅠ、重组酶等分子生物学试剂购自Takara公司；所用的PLP、(S)‑1苯乙胺购自Sigma‑Aldrich公司；(S)‑1‑(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑甲基)吡啶‑3‑甲基)乙胺和(R)‑1‑(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑甲基)吡啶‑3‑甲基)乙胺购自上海皓鸿生物医药科技有限公司；(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑基)吡啶‑3‑基)乙‑1‑酮由发明人合成，纯度为97％。所用其他生化试剂购自阿拉丁生化科技股份有限公司。

[0039] 所用PCR仪购自赛默飞世尔科技公司，所用高效液相色谱仪的型号为Alliance e2695(Waters)，所用检测器为二极管阵列检测器；所用手性柱的型号为大赛璐CHIRALPAK IG(粒径5μm，4.6mm×250mm)。

[0040] 下述实施例中涉及的培养基如下：

[0041] LB固体培养基：5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl、15g/L琼脂和50mg/L卡那霉素。

[0042] LB液体培养基：5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl和50mg/L卡那霉素。

[0043] 使用高效液相色谱(HPLC)法对催化反应的前手性酮底物和手性胺产物进行定性及定量分析，反相体系设置如表1，流速设置为0.5mL/min，检测波长为254nm，进样量为10μL。

[0044] 表1本发明中HPLC分析手性胺产物的反相体系

[0045] 时间/min 水 乙腈(含0.1％三乙胺)0 20％ 80％
30 30％ 70％

[0046] 转化率计算公式如下：

[0047] 转化率(％)＝(N0‑N1)/N0×100％

[0048] 式中，N0表示反应液中前手性酮的初始摩尔浓度，N1表示反应完成后前手性酮的剩余摩尔浓度。

[0049] 手性产物的光学纯度使用对映体过量值(ee)来表征，其计算公式如下：

[0050] ee＝(NS‑NR)/(NS+NR)×100％

[0051] 式中，NS表示反应液中S型手性胺产物的摩尔浓度，NR表示反应液中R型手性胺产物的摩尔浓度。

[0052] 实施例1：ω‑转氨酶半理性设计和定点饱和突变质粒的构建

[0053] 野生型ω‑转氨酶的基因序列经优化后为SEQ ID NO.2，交由擎科生物公司进行全基因合成，并构建在质粒载体pET‑28a(+)上，酶切位点为NdeⅠ和HindⅢ，即为野生型ω‑转氨酶重组质粒。

[0054] 根据野生型ω‑转氨酶的氨基酸序列SEQ ID NO.1，在SWISS‑MODEL网站(https://swissmodel.expasy.org/)进行蛋白质同源建模分析，再将模拟出的结构与胺受体进行分子对接(AutoDock 4.2.6软件)，通过分析底物 范围内的残基，筛选出W62、Y154、A232和I263这4个高度保守位点可能影响ω‑转氨酶的底物识别。针对这4个位点分别构建定点饱和突变质粒：根据表2的NNK简并引物，以野生型转氨酶重组质粒为模板进行全质粒单点突变PCR，分别构建包含第62、第154、第232或第263位点突变成20种氨基酸类型的单点饱和突变库，通过测序挑选出W62、Y154、A232或I263分别突变成另外19种氨基酸(A/C/D/E/F/G/H/K/L/M/N/P/Q/R/S/T/V/W/Y)的突变体重组质粒。

[0055] 表2构建单点饱和突变库的NNK简并引物

[0056]引物序号 引物名称 序列5’‑3’
SEQ ID NO.3 62‑NNK‑F CCGGTCTGNNKAATGTTAATGTTGGTCATGGTCGTACC
SEQ ID NO.4 62‑NNK‑R TTAACATTMNNCAGACCGGCAAAACCATCCAG
SEQ ID NO.5 154‑NNK‑F GTATGGCANNKCATGGTATTGCAATGGGTGCACTG
SEQ ID NO.6 154‑NNK‑R ATACCATGMNNTGCCATACGACGGCTAATAATTTTGGT
SEQ ID NO.7 232‑NNK‑F TTCAGGGTNNKGGTGGTGTTGTTCCGCCGC
SEQ ID NO.8 232‑NNK‑F ACACCACCMNNACCCTGAACCGGTTCACCAAT
SEQ ID NO.9 263‑NNK‑F ATGAAGTTNNKACCGGTTTTGGTCGTACCGG
SEQ ID NO.10 263‑NNK‑F AAACCGGTMNNAACTTCATCTGCAATCAGCAGAAT

[0057] 注：N＝A/C/T/G，K＝T/G，M＝A/C。

[0058] 全质粒单点饱和突变PCR体系如表3所示。

[0059] 表3PCR反应体系

[0060] 试剂 使用量 终浓度PrimeSTAR Max Premix(2×) 25μL 1×
引物F 10～15pmol 0.2～0.3μM
引物R 10～15pmol 0.2～0.3μM
模板质粒 <200ng
灭菌超纯水 补至总体积为50μL

[0061] 全质粒单点突变PCR程序设置为：

[0062] (1)98℃变性10秒；(2)58℃退火5秒；(3)72℃延伸1分钟；(4)重复步骤(1)～(3)，循环29次；(5)72℃充分延伸5分钟；(6)4℃保存扩增产物。

[0063] 通过高效液相色谱法测定ω‑转氨酶突变体催化1‑(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑基)吡啶‑3‑基)乙‑1‑酮不对称合成(S)‑1‑(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑甲基)吡啶‑3‑甲基)乙胺的转化率，获得转化率高于50％的单点突变体(均为W62或I263位点突变)，基于转化率最高的单点突变体(I263G)进一步构建W62位点饱和突变的组合突变体。即根据表2的引物，以ω‑转氨酶I263G突变体的重组质粒为模板进行全质粒单点突变PCR，其余程序同上。

[0064] 实施例2：ω‑转氨酶野生型及其突变体的纯酶制备

[0065] 将实施例1获得并经测序正确的突变体质粒分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感+
受态细胞中，涂布平板过夜生长；再分别挑取单克隆置于15mL含有0.1mg/mL Kan的LB液体+
培养基中，过夜培养；随后按1％的比例转入1L含有0.1mg/mL Kan的LB液体培养基中，培养至OD600约为0.8时，加入0.5mM的IPTG，在16℃、220rpm下培养16小时表达目标蛋白。

[0066] 将菌液离心收集菌泥，用40mL缓冲液(10mM PBS、150mM NaCl)重悬，再进行压力破碎，处理条件为1100Pa持续破碎2min；随后12000rpm离心30min，再用滤膜将上清过滤一遍，置于冰上备用；在纯化之前，先用10个柱体积的纯净水清洗镍柱，再用10个柱体积的缓冲液清洗镍柱，然后将过滤后的上清液缓慢倒入并流出，依次使用含有20mM、40mM、160mM和500mM的咪唑缓冲液(10mM PBS、150mM NaCl和10μM PLP)各10个柱体积清洗镍柱并收集流穿液，目标蛋白主要在咪唑浓度为160mM的流穿液中；再用脱盐重力柱对含有高纯度目标蛋白的流穿液进行浓缩和脱盐处理，然后置换到10mM PBS缓冲液中，得到ω‑转氨酶野生型及突变体的纯酶；最后将酶液浓度调整为5mg/mL(含30％甘油)，‑20℃冰箱保存备用。

[0067] 实施例3：ω‑转氨酶野生型及其突变体催化1‑(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑基)吡啶‑3‑基)乙‑1‑酮的转化率测定

[0068] 取适量按照实施例2方法制备的ω‑转氨酶野生型(WT)及突变体的纯酶，按照下述体系进行催化反应：10mM(S)‑1苯乙胺、1mM 1‑(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑基)吡啶‑3‑基)乙‑1‑酮、2mM PLP、0.5mg/mLω‑转氨酶野生型或其突变体、10mM PBS(pH8.0)，于37℃水浴反应24h。将结束后的反应体系12000rpm离心5min，取上清与等体积乙腈混合，利用手性柱对催化反应的1‑(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑基)吡啶‑3‑基)乙‑1‑酮、(S)‑1‑(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑甲基)吡啶‑3‑甲基)乙胺和(R)‑1‑(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑甲基)吡啶‑3‑甲基)乙胺进行分离和分析，反相体系设置如表1，流速设置为0.5mL/min，检测波长为254nm，进样量为10μL。根据标准品的标准曲线计算酶催化反应的转化率和ee值，其中，转化率高于80％的ω‑转氨酶突变体如表4所示，最优突变体为W62L/I263G，转化率高达91.37％，ee值均高于99.9％。

[0069] 表4ω‑转氨酶野生型及其突变体催化转化率和产物ee值

[0070]转氨酶及其突变体 转化率(％) ee
WT 0.07 /
I263A 80.49 >99.9％
I263G 83.6 >99.9％
W62I/I263G 88.72 >99.9％
W62L/I263G 91.37 >99.9％
W62M/I263G 85.45 >99.9％

[0071] 1‑(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑基)吡啶‑3‑基)乙‑1‑酮、(S)‑1‑(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑甲基)吡啶‑3‑甲基)乙胺和(R)‑1‑(6‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑甲基)吡啶‑3‑甲基)乙胺标准品的高效液相色谱图如图2所示，出峰时间分别为26min、21.5min和30min左右；ω‑转氨酶野生型(WT)和最优突变体(W62L/I263G)催化反应0h和6h的高效液相色谱图分别如图3和图4所示。

[0072] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。