技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌及利用葡萄糖合成鲨肌醇的方法。
相关背景技术
[0002] 鲨肌醇是一种环己烷，肌醇的九种同分异构体之一，临床研究发现鲨肌醇对阿尔兹海默症有治疗效果，并应用于化妆品及健康品行业，现正在广泛开展应用于行为和精神疾病、蛋白聚集性疾病、抗癌药物组合物等临床试验，未来鲨肌醇将是一种有潜力的一款产品。
[0003] 鲨肌醇广泛分布在植物和哺乳动物中，但含量较少，提取纯度和成本将是一个难点，化学合成面临着对环境的挑战，而目前生物转化法是从肌肉肌醇转化成鲨肌醇，转化率不高，同时肌肉肌醇和鲨肌醇是同分异构体，给下游分离造成困难，而实验室采用硼酸提取鲨肌醇方法，工业上不允许，所以我们使用与目的产物结构差异较大的葡萄糖为底物生产鲨肌醇打通工业化的壁垒。
具体实施方式
[0100] 下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0101] 实施例1
[0102] 一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌为突变型大肠杆菌R04导入肌醇‑3‑磷酸合成酶基因(IPS)、肌醇单磷酸酶基因(IMP)、肌醇脱氢酶基因(IDH)和鲨肌醇脱氢酶基因(SID)制得；
[0103] 所述IDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述IDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SID的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述SID的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0104] 所述突变型大肠杆菌R04为突变型大肠杆菌SG104敲掉内源葡萄糖‑6‑磷酸异构酶基因后所得。
[0105] 实施例2
[0106] 实施例1中重组大肠杆菌的制备方法，包括以下步骤：
[0107] S1.PCR引物
[0108]
[0109] S2.双酶切体系及反应条件
[0110] 对质粒pYB1s进行XhoI/SpeI双酶切：10*buffer 5μL，BSA 2μL，XhoI/SpeI2/2μL，DNA 20μL，ddH2O 19μL，共50μL，37℃酶切1h，回收目的载体片段约3500bp；
[0111] S3.目的基因片段(IDH)获得
[0112] 2×高保真酶mix 50μL，模板1μL，F1 2μL，R1 2μL，ddH2O补齐100μL，反应程序：98℃预变性2min；98℃变性20s，降温至退火温度55℃退火20s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其后进行PCR产物纯化；
[0113] 目的基因片段(SID)获得
[0114] 2×高保真酶mix 50μL，模板1μL，F2 2μL，R2 2μL，ddH2O补齐100μL，反应程序：98℃预变性2min；98℃变性20s，降温至退火温度55℃退火20s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其后进行PCR产物纯化；
[0115] 目的基因片段(IPS)获得
[0116] 2×高保真酶mix 50μL，模板1μL，F3 2μL，R3 2μL，ddH2O补齐100μL，反应程序：98℃预变性2min；98℃变性20s，降温至退火温度55℃退火20s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其后进行PCR产物纯化；
[0117] 目的基因片段(IMP)获得
[0118] 2×高保真酶mix 50μL，模板1μL，F4 2μL，R4 2μL，ddH2O补齐100μL，反应程序：98℃预变性2min；98℃变性20s，降温至退火温度55℃退火20s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其后进行PCR产物纯化；
[0119] S4.目的基因片段(IPS+IMP)获得
[0120] 2×高保真酶mix50μL，模板1μL，F3 2μL，R5 2μL，ddH2O补齐100μL，反应程序：98℃预变性2min；98℃变性20s，降温至退火温度55℃退火20s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其后进行PCR产物纯化；
[0121] 目的基因片段(IDH+SID)获得
[0122] 2×高保真酶mix50μL，模板1μL，F5 2μL，R2 2μL，ddH2O补齐100μL，反应程序：98℃预变性2min；98℃变性20s，降温至退火温度55℃退火20s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其后进行PCR产物纯化；
[0123] S5.Gibson酶连体系及反应条件
[0124] Gibson Buffer 6μL，目的载体片段1μg，目的基因片段(IPS+IMP、IDH+SID)各1.5μL，ddH2O补齐10μL，50℃连接1h；
[0125] S6.转化
[0126] 酶连后取10μL加入DH5α感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，冰上静置5min；加入600μL LB液体培养基，涂布于LB(str100μg/mL)平板上，直至菌液被全部吸收，倒置平板，37℃培养12～16h，可见相应菌落；
[0127] S7.阳性克隆子筛选
[0128] 菌落PCR验证后，提质粒送华大基因测序验证；
[0129] S8.表达菌株获得
[0130] 对测序正确的质粒转化到突变型大肠杆菌R04感受态，转化成功的菌株即为重组大肠杆菌SI01。
[0131] 实施例3
[0132] 一种利用葡萄糖合成鲨肌醇的方法，取实施例2中的重组大肠杆菌SI01进行高密度发酵，高密度发酵的培养基组成为：一水柠檬酸2g/L，磷酸二氢钾14g/L，三水磷酸氢二钾4.5g/L，硫酸铵4g/L，葡萄糖20g/L，甘油5g/L，硫酸镁0.6g/L，酵母粉1g/L，微量元素10mL/L,补料培养基：葡萄糖600g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉10g/L。
[0133] 高密度发酵的控制条件：接种量2％，发酵罐的罐压0.02Mpa，起始转速300rpm，pH 7.0，37℃培养，OD600到30降温至30℃，OD600升至70时加入2g/L阿拉伯糖诱导，起始风量为
2.5L/min,转速400rpm时调3L/min，转速500rpm时调3.5L/min，转速600rpm时调4L/min，溶氧起始100，溶氧反弹开始添加补料培养基，使DO保持25％。
[0134] 开始补料～2h内补料培养基的加入量为28‑30g/h，2h～4h内补料培养基的加入量为33‑35g/h，4h～诱导前补料培养基的加入量为38‑40g/h，诱导后补料培养基的加入量为33‑35g/h，生物量达140OD600。
[0135] 全细胞转化中转化体系为40OD600，PBS 50mM，pH 7.0，温度37℃，200rpm。
[0136] 葡萄糖进行分批加入转化体系，每次加入100mM葡萄糖，每5h加入一次，共计加入500mM，转化30h结束，得鲨肌醇，鲨肌醇量为82mM，转化率16.4％。
[0137] 对比例1
[0138] 一种利用葡萄糖合成鲨肌醇的方法，取实施例2中的重组大肠杆菌SI01进行高密度发酵，高密度发酵的培养基组成为：一水柠檬酸2g/L，磷酸二氢钾14g/L，三水磷酸氢二钾4.5g/L，硫酸铵4g/L，葡萄糖20g/L，硫酸镁0.6g/L，酵母粉1g/L，微量元素10mL/L,补料培养基：葡萄糖600g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉10g/L。
[0139] 高密度发酵的控制条件：接种量2％，发酵罐的罐压0.02Mpa，起始转速300rpm，pH 7.0，37℃培养，OD600到30降温至30℃，OD600升至70时加入2g/L阿拉伯糖诱导，起始风量为
2.5L/min,转速400rpm时调3L/min，转速500rpm时调3.5L/min，转速600rpm时调4L/min，溶氧起始100，溶氧反弹开始添加补料培养基，使DO保持25％。
[0140] 开始补料～2h内补料培养基的加入量为28‑30g/h，2h～4h内补料培养基的加入量为33‑35g/h，4h～诱导前补料培养基的加入量为38‑40g/h，诱导后补料培养基的加入量为33‑35g/h，生物量OD600为18。
[0141] 全细胞转化中转化体系为40OD600，PBS 50mM，pH 7.0，温度37℃，200rpm。
[0142] 葡萄糖进行分批加入转化体系，每次加入100mM葡萄糖，每5h加入一次，共计加入500mM，转化30h结束，得鲨肌醇，鲨肌醇量为46.9mM，转化率9.38％。
[0143] 对比例2
[0144] 一种利用葡萄糖合成鲨肌醇的方法，取实施例2中的重组大肠杆菌SI01进行高密度发酵，高密度发酵的培养基组成为：一水柠檬酸2g/L，磷酸二氢钾14g/L，三水磷酸氢二钾4.5g/L，硫酸铵4g/L，葡萄糖20g/L，玉米浆5g/L，硫酸镁0.6g/L，酵母粉1g/L，微量元素
10mL/L,补料培养基：葡萄糖600g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉10g/L。
[0145] 高密度发酵的控制条件：接种量2％，发酵罐的罐压0.02Mpa，起始转速300rpm，pH 7.0，37℃培养，OD600到30降温至30℃，OD600升至70时加入2g/L阿拉伯糖诱导，起始风量为
2.5L/min,转速400rpm时调3L/min，转速500rpm时调3.5L/min，转速600rpm时调4L/min，溶氧起始100，溶氧反弹开始添加补料培养基，使DO保持25％。
[0146] 开始补料～2h内补料培养基的加入量为28‑30g/h，2h～4h内补料培养基的加入量为33‑35g/h，4h～诱导前补料培养基的加入量为38‑40g/h，诱导后补料培养基的加入量为33‑35g/h，生物量OD600为67。
[0147] 全细胞转化中转化体系为40OD600，PBS 50mM，pH 7.0，温度37℃，200rpm。
[0148] 葡萄糖进行分批加入转化体系，每次加入100mM葡萄糖，每5h加入一次，共计加入500mM，转化30h结束，得鲨肌醇，鲨肌醇量为23.7mM，转化率4.74％。
[0149] 对比例3
[0150] 一种利用葡萄糖合成鲨肌醇的方法，取实施例2中的重组大肠杆菌SI01进行高密度发酵，高密度发酵的培养基组成为：一水柠檬酸2g/L，磷酸二氢钾14g/L，三水磷酸氢二钾4.5g/L，硫酸铵4g/L，甘油5g/L，硫酸镁0.6g/L，酵母粉1g/L，微量元素10mL/L,补料培养基：
葡萄糖600g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉10g/L。
[0151] 高密度发酵的控制条件：接种量2％，发酵罐的罐压0.02Mpa，起始转速300rpm，pH 7.0，37℃培养，OD600到30降温至30℃，OD600升至70时加入2g/L阿拉伯糖诱导，起始风量为
2.5L/min,转速400rpm时调3L/min，转速500rpm时调3.5L/min，转速600rpm时调4L/min，溶氧起始100，溶氧反弹开始添加补料培养基，使DO保持25％。
[0152] 开始补料～2h内补料培养基的加入量为28‑30g/h，2h～4h内补料培养基的加入量为33‑35g/h，4h～诱导前补料培养基的加入量为38‑40g/h，诱导后补料培养基的加入量为33‑35g/h，生物量OD600为22。
[0153] 全细胞转化中转化体系为40OD600，PBS 50mM，pH 7.0，温度37℃，200rpm。
[0154] 葡萄糖进行分批加入转化体系，每次加入100mM葡萄糖，每5h加入一次，共计加入500mM，转化30h结束，得鲨肌醇，鲨肌醇量为2.3mM，转化率0.46％。
[0155] 对比例4
[0156] 一种利用葡萄糖合成鲨肌醇的方法，取重组大肠杆菌SI02进行高密度发酵，高密度发酵的培养基组成为：一水柠檬酸2g/L，磷酸二氢钾14g/L，三水磷酸氢二钾4.5g/L，硫酸铵4g/L，葡萄糖20g/L，甘油5g/L，硫酸镁0.6g/L，酵母粉1g/L，微量元素10mL/L,补料培养基：葡萄糖600g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉10g/L。
[0157] 高密度发酵的控制条件：接种量2％，发酵罐的罐压0.02Mpa，起始转速300rpm，pH 7.0，37℃培养，OD600到30降温至30℃，OD600升至70时加入2g/L阿拉伯糖诱导，起始风量为
2.5L/min,转速400rpm时调3L/min，转速500rpm时调3.5L/min，转速600rpm时调4L/min，溶氧起始100，溶氧反弹开始添加补料培养基，使DO保持25％。
[0158] 开始补料～2h内补料培养基的加入量为28‑30g/h，2h～4h内补料培养基的加入量为33‑35g/h，4h～诱导前补料培养基的加入量为38‑40g/h，诱导后补料培养基的加入量为33‑35g/h，生物量OD600为35。
[0159] 全细胞转化中转化体系为40OD600，PBS 50mM，pH 7.0，温度37℃，200rpm。
[0160] 葡萄糖进行分批加入转化体系，每次加入100mM葡萄糖，每5h加入一次，共计加入500mM，转化30h结束，得鲨肌醇，鲨肌醇量为1.9mM，转化率0.38％。
[0161] 其中，重组大肠杆菌SI02的制备方法，包括以下步骤：
[0162] S1.PCR引物
[0163]
[0164] S2.双酶切体系及反应条件
[0165] 对质粒pYB1s进行XhoI/SpeI双酶切：10*buffer 5μL，BSA 2μL，XhoI/SpeI2/2μL，DNA 20μL，ddH2O 19μL，共50μL，37℃酶切1h，回收目的载体片段约3500bp；
[0166] S3.目的基因片段(IDH)获得
[0167] 2×高保真酶mix 50μL，模板1μL，F3 2μL，R3 2μL，ddH2O补齐100μL，反应程序：98℃预变性2min；98℃变性20s，降温至退火温度55℃退火20s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其后进行PCR产物纯化；
[0168] S4.目的基因片段(SID)获得
[0169] 2×高保真酶mix 50μL，模板1μL，F4 2μL，R2 2μL，ddH2O补齐100μL，反应程序：98℃预变性2min；98℃变性20s，降温至退火温度55℃退火20s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其后进行PCR产物纯化；
[0170] S5.Gibson酶连体系及反应条件
[0171] Gibson Buffer 6μL，目的载体片段1μg，目的基因片段(IDH、SID)各1.5μL，ddH2O补齐10μL，50℃连接1h；
[0172] S6.转化
[0173] 酶连后取10μL加入DH5α感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，冰上静置5min；加入600μL LB液体培养基，涂布于LB(str100μg/mL)平板上，直至菌液被全部吸收，倒置平板，37℃培养12～16h，可见相应菌落；
[0174] S7.阳性克隆子筛选
[0175] 菌落PCR验证后，提质粒送华大基因测序验证；
[0176] S8.表达菌株获得
[0177] 对测序正确的质粒转化到突变型大肠杆菌R04感受态，转化成功的菌株即为重组大肠杆菌，命名SI02。
[0178] 对比例5
[0179] 一种利用葡萄糖合成鲨肌醇的方法，取重组大肠杆菌SI03进行高密度发酵，高密度发酵的培养基组成为：一水柠檬酸2g/L，磷酸二氢钾14g/L，三水磷酸氢二钾4.5g/L，硫酸铵4g/L，葡萄糖20g/L，甘油5g/L，硫酸镁0.6g/L，酵母粉1g/L，微量元素10mL/L,补料培养基：葡萄糖600g/L，硫酸镁2g/L，酵母粉10g/L。
[0180] 高密度发酵的控制条件：接种量2％，发酵罐的罐压0.02Mpa，起始转速300rpm，pH 7.0，37℃培养，OD600到30降温至30℃，OD600升至70时加入2g/L阿拉伯糖诱导，起始风量为
2.5L/min,转速400rpm时调3L/min，转速500rpm时调3.5L/min，转速600rpm时调4L/min，溶氧起始100，溶氧反弹开始添加补料培养基，使DO保持25％。
[0181] 开始补料～2h内补料培养基的加入量为28‑30g/h，2h～4h内补料培养基的加入量为33‑35g/h，4h～诱导前补料培养基的加入量为38‑40g/h，诱导后补料培养基的加入量为33‑35g/h，生物量OD600为132。
[0182] 全细胞转化中转化体系为40OD600，PBS 50mM，pH 7.0，温度37℃，200rpm。
[0183] 葡萄糖进行分批加入转化体系，每次加入100mM葡萄糖，每5h加入一次，共计加入500mM，转化30h结束，得鲨肌醇，鲨肌醇量为47.9mM，转化率9.58％。
[0184] 其中，重组大肠杆菌SI03的制备方法，包括以下步骤：
[0185] S1.PCR引物
[0186]
[0187] S2.双酶切体系及反应条件
[0188] 对质粒pYB1s进行XhoI/SpeI双酶切：10*buffer 5μL，BSA 2μL，XhoI/SpeI2/2μL，DNA 20μL，ddH2O 19μL，共50μL，37℃酶切1h，回收目的载体片段约3500bp；
[0189] 对质粒pAB1k进行EcoRI/PstI双酶切：10*buffer 5μL，BSA 2μL，EcoRI/PstI 2/2μL，DNA 20μL，ddH2O 19μL，共50μL，37℃酶切1h，回收目的载体片段约3500bp；
[0190] S3.目的基因片段(IDH)获得
[0191] 2×高保真酶mix 50μL，模板1μL，F1 2μL，R1 2μL，ddH2O补齐100μL，反应程序：98℃预变性2min；98℃变性20s，降温至退火温度55℃退火20s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其后进行PCR产物纯化；
[0192] 目的基因片段(SID)获得
[0193] 2×高保真酶mix 50μL，模板1μL，F2 2μL，R2 2μL，ddH2O补齐100μL，反应程序：98℃预变性2min；98℃变性20s，降温至退火温度55℃退火20s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其后进行PCR产物纯化；
[0194] 目的基因片段(IPS)获得
[0195] 2×高保真酶mix 50μL，模板1μL，F3 2μL，R3 2μL，ddH2O补齐100μL，反应程序：98℃预变性2min；98℃变性20s，降温至退火温度55℃退火20s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其后进行PCR产物纯化；
[0196] 目的基因片段(IMP)获得
[0197] 2×高保真酶mix 50μL，模板1μL，F4 2μL，R4 2μL，ddH2O补齐100μL，反应程序：98℃预变性2min；98℃变性20s，降温至退火温度55℃退火20s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其后进行PCR产物纯化；
[0198] S4.目的基因片段(IPS+IMP)获得
[0199] 2×高保真酶mix50μL，模板1μL，F3 2μL，R5 2μL，ddH2O补齐100μL，反应程序：98℃预变性2min；98℃变性20s，降温至退火温度55℃退火20s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其后进行PCR产物纯化；
[0200] 目的基因片段(IDH+SID)获得
[0201] 2×高保真酶mix50μL，模板1μL，F5 2μL，R2 2μL，ddH2O补齐100μL，反应程序：98℃预变性2min；98℃变性20s，降温至退火温度55℃退火20s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温，其后进行PCR产物纯化；
[0202] S5.Gibson酶连体系及反应条件
[0203] Gibson Buffer 6μL，目的载体片段pYB1s1μg，目的基因片段(IPS+IMP)各1.5μL，ddH2O补齐10μL，50℃连接1h；
[0204] Gibson Buffer 6μL，目的载体片段pAB1k1μg，目的基因片段(IDH+SID)各1.5μL，ddH2O补齐10μL，50℃连接1h；
[0205] S6.转化
[0206] 酶连后各取10μL加入DH5α感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，冰上静置5min；加入600μL LB液体培养基，涂布于LB(str100μg/mL、Kan50μg/mL)平板上，直至菌液被全部吸收，倒置平板，37℃培养12～16h，可见相应菌落；
[0207] S7.阳性克隆子筛选
[0208] 菌落PCR验证后，提质粒送华大基因测序验证；
[0209] S8.表达菌株获得
[0210] 对测序正确的质粒转化到突变型大肠杆菌R04感受态，转化成功的菌株即为重组大肠杆菌，命名SI03。
[0211] 应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
