[0001] 本发明属于生物医用材料技术领域，尤其涉及一种近红外光热响应的复合抗菌水凝胶粘合剂制备方法及应用。

[0002] 由细菌感染等因素引起过度炎症会延迟深创面、糖尿病溃疡、轻度烧伤等慢性伤口愈合。尽管有许多治疗药物及方法，但大多数伤口愈合材料生物活性物质利用率低，治疗效果差。水凝胶是亲水性高分子材料，具有保持创面湿润，吸水性强，良好的生物相容性等优点。更重要的是，水凝胶粘合剂可以适用于不规则伤口创面。近年来，光热疗法(PTT)由于具有广谱高效抗菌、可控性好和预防多重耐药菌等优点，已广泛应用于抗菌。因此，设计一种能够近红外光热响应伤口微环境且具有抗菌能力的水凝胶粘合剂以促进伤口愈合至关重要。

[0003] 天然多酚中的咖啡酸来源广泛，具有高生物安全性、抗氧化和抗菌活性。更重要的是，由于与金属离子的螯合作用，咖啡酸是一种良好的载体，它可以将金属离子缓慢释放到2+
伤口中，避免因过量而产生生物毒性。铜负载咖啡酸纳米粒子在近红外光下缓慢释放的Cu能够增加并稳定角蛋白和胶原蛋白的表达，加速伤口愈合，同时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有良好的抗菌效果。目前现有技术已有针对慢性伤口愈合的干性敷料，用于吸收创面组织渗出液，同时为了方便固定，通常会采用手术缝合的方式，这不仅会造成伤口细菌感染，还会对伤口造成二次损伤。因此，开发一种微创且防止伤口粘连的组织粘合剂是十分重要的。此外，对于现有单一的治疗策略，采用光热疗法可与其他治疗手段相结合，大大提高伤口愈合效果，实现高效协同治疗。

[0030] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

[0031] 实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0032] 实施例1：

[0033] (1)称取90mg咖啡酸(CA)溶于50mL50％(v/v)乙醇溶液中，搅拌至完全溶解。然后称取165mg无水氯化铜溶于上述溶液中，待完全溶解后，调节溶液pH为10.1。将混合溶液在4℃水浴下反应20min，得到的黑褐色产物在8000rpm下离心10min，用去离子水和乙醇洗涤3次。最后，通过冷冻干燥得到咖啡酸—铜(Cu‑PCA)；

[0034] (2)称取1.0g羧甲基壳聚糖溶于40mL去离子水中，向溶液中加入1.35g 1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1.2gN‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)，连续搅拌8分钟后，加入1.0g咖啡酸(CA)。待固体全部溶解后，用1MHCl溶液调节pH至4.7。然后将混合溶液在50℃下搅拌24小时。最后，将反应混合溶液在去离子水中透析5‑7天，冷冻干燥得到CMCS@CA；

[0035] (3)将水和二甲亚砜(DMSO)以1：4体积比制备反应溶剂，然后称取5.0g明胶在50℃下溶于200mL反应溶剂中，用0.1M的HCl溶液调节pH为5.0，得到溶液A；分别称取4.22g 3‑氨基苯硼酸(APBA)、0.81g 1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.49g N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于50mL反应溶剂中，用0.1M的HCl溶液调节pH为5.0，得到溶液B。明胶中的羧基、APBA、EDC和NHS的摩尔比保持在1：7：1.1：1.1。然后，将溶液A和溶液B冷却至室温后混合，并在室温下连续搅拌48小时。最后，将混合溶液通过透析袋(MWCO:3500Da)在去离子水中透析净化一周，直至未检测到APBA，冷冻干燥得到Gel@APBA；

[0036] (4)将3wt％Gel@APBA，4wt％CMCS@CA，0.5mg/mLCu‑PCA分别溶于PBS中，在室温下混合均匀后得到水凝胶粘合剂。

[0037] 实施例2：

[0038] (1)称取90mg咖啡酸(CA)溶于50mL50％(v/v)乙醇溶液中，搅拌至完全溶解。然后称取165mg无水氯化铜溶于上述溶液中，待完全溶解后，调节溶液pH为10.1。将混合溶液在4℃水浴下反应20min，得到的黑褐色产物在8000rpm下离心10min，用去离子水和乙醇洗涤3次。最后，通过冷冻干燥得到咖啡酸—铜(Cu‑PCA)；

[0039] (2)称取1.0g羧甲基壳聚糖溶于40mL去离子水中，向溶液中加入1.35g 1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1.2gN‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)，连续搅拌8分钟后，加入1.0g咖啡酸(CA)。待固体全部溶解后，用1MHCl溶液调节pH至4.7。然后将混合溶液在50℃下搅拌24小时。最后，将反应混合溶液在去离子水中透析5‑7天，冷冻干燥得到CMCS@CA；

[0040] (3)将水和二甲亚砜(DMSO)以1：4体积比制备反应溶剂，然后称取5.0g明胶在50℃下溶于200mL反应溶剂中，用0.1M的HCl溶液调节pH为5.0，得到溶液A；分别称取4.22g 3‑氨基苯硼酸(APBA)、0.81g 1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.49g N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于50mL反应溶剂中，用0.1M的HCl溶液调节pH为5.0，得到溶液B。明胶中的羧基、APBA、EDC和NHS的摩尔比保持在1：7：1.1：1.1。然后，将溶液A和溶液B冷却至室温后混合，并在室温下连续搅拌48小时。最后，将混合溶液通过透析袋(MWCO:3500Da)在去离子水中透析净化一周，直至未检测到APBA，冷冻干燥得到Gel@APBA；

[0041] (4)将3wt％Gel@APBA，4wt％CMCS@CA，1.0mg/mLCu‑PCA分别溶于PBS中，在室温下混合均匀后得到水凝胶粘合剂。

[0042] 实施例3：

[0043] (1)称取90mg咖啡酸(CA)溶于50mL50％(v/v)乙醇溶液中，搅拌至完全溶解。然后称取165mg无水氯化铜溶于上述溶液中，待完全溶解后，调节溶液pH为10.1。将混合溶液在4℃水浴下反应20min，得到的黑褐色产物在8000rpm下离心10min，用去离子水和乙醇洗涤3次。最后，通过冷冻干燥得到咖啡酸—铜(Cu‑PCA)；

[0044] (2)称取1.0g羧甲基壳聚糖溶于40mL去离子水中，向溶液中加入1.35g 1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1.2gN‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)，连续搅拌8分钟后，加入1.0g咖啡酸(CA)。待固体全部溶解后，用1MHCl溶液调节pH至4.7。然后将混合溶液在50℃下搅拌24小时。最后，将反应混合溶液在去离子水中透析5‑7天，冷冻干燥得到CMCS@CA；

[0045] (3)将水和二甲亚砜(DMSO)以1：4体积比制备反应溶剂，然后称取5.0g明胶在50℃下溶于200mL反应溶剂中，用0.1M的HCl溶液调节pH为5.0，得到溶液A；分别称取4.22g 3‑氨基苯硼酸(APBA)、0.81g 1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.49g N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于50mL反应溶剂中，用0.1M的HCl溶液调节pH为5.0，得到溶液B。明胶中的羧基、APBA、EDC和NHS的摩尔比保持在1：7：1.1：1.1。然后，将溶液A和溶液B冷却至室温后混合，并在室温下连续搅拌48小时。最后，将混合溶液通过透析袋(MWCO:3500Da)在去离子水中透析净化一周，直至未检测到APBA，冷冻干燥得到Gel@APBA；

[0046] (4)将3wt％Gel@APBA，4wt％CMCS@CA，2.0mg/mLCu‑PCA分别溶于PBS中，在室温下混合均匀后得到水凝胶粘合剂。

[0047] 对照例：

[0048] (1)称取1.0g羧甲基壳聚糖溶于40mL去离子水中，向溶液中加入1.35g 1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1.2gN‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)，连续搅拌8分钟后，加入1.0g咖啡酸(CA)。待固体全部溶解后，用1MHCl溶液调节pH至4.7。然后将混合溶液在50℃下搅拌24小时。最后，将反应混合溶液在去离子水中透析5‑7天，冷冻干燥得到CMCS@CA；

[0049] (2)将水和二甲亚砜(DMSO)以1：4体积比制备反应溶剂，然后称取5.0g明胶在50℃下溶于200mL反应溶剂中，用0.1M的HCl溶液调节pH为5.0，得到溶液A；分别称取4.22g 3‑氨基苯硼酸(APBA)、0.81g 1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.49g N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于50mL反应溶剂中，用0.1M的HCl溶液调节pH为5.0，得到溶液B。明胶中的羧基、APBA、EDC和NHS的摩尔比保持在1：7：1.1：1.1。然后，将溶液A和溶液B冷却至室温后混合，并在室温下连续搅拌48小时。最后，将混合溶液通过透析袋(MWCO:3500Da)在去离子水中透析净化一周，直至未检测到APBA，冷冻干燥得到Gel@APBA；

[0050] (3)将Gel@APBA以3％w/w的浓度溶于PBS中，得到溶液C，CMCS@CA以4％w/w的浓度溶解在PBS中，调节pH为7.4，得到溶液D，然后将溶液C和D以1：1的体积比混合均匀，得到水凝胶粘合剂。

[0051] 对实施例2制备的咖啡酸—铜进行了水合粒径表征，结果如图1所示；对实施例2和对照例制备的水凝胶粘合剂进行了剥离强度表征，结果如图2所示；对实施例1‑3和对照例的光热响应性进行表征，结果如图3所示；对实施例2的光热稳定性进行表征，结果如图4所示；对实施例1‑3和对照例制备的水凝胶进行近红外照射下细胞毒性表征，结果如图5所示。

[0052] 水合粒径表征方法：将咖啡酸—铜通过一定时间的超声使其均匀的分散在蒸馏水中，而后取适量溶液放入比色皿中进行测试。

[0053] 由图1可知，合成的Cu‑PCA平均直径在267.6nm左右，颗粒尺寸均匀。

[0054] 剥离强度表征方法：取两片处理后的新鲜猪皮(猪皮长度50mm,宽度10mm)，将水凝胶粘合剂涂于一块猪皮表面，将两块猪皮立即贴合在一起。对黏附好的猪皮上施加10N的力，一小时后用万能电子拉力机以20mm/min的速率进行拉伸剪切强度测试。

[0055] 由图2可知，实施例2的黏附性强于对照例，金属基儿茶酚的加入增强了水凝胶的粘合力。

[0056] 光热响应性能表征方法：将水凝胶粘合剂置于塑料培养皿中，在近红外激光下2
(808nm，0.5W/cm)照射10min，用热成像仪记录水凝胶粘合剂的温度变化。

[0057] 由图3可知，含Cu‑PCA的水凝胶粘合剂在近红外激光照射下温度变化明显，当Cu‑PCA的含量从0.5mg/mL增加到2mg/mL时，最高温度从42.3℃增加到58.4℃。

[0058] 光热稳定性能表征：将水凝胶粘合剂置于塑料培养皿中，在近红外激光下(808nm，2
0.5W/cm)照射10min，用热成像仪记录水凝胶粘合剂的温度变化。然后，移去近红外激光
2
器，将水凝胶冷却至室温，用近红外激光(808nm，0.5W/cm)再次照射10min，重复4次。

[0059] 由图4可知，经过4次循环后，水凝胶粘合剂的最高温度变化不大，表明其具有稳定的近红外光热响应性。

[0060] 细胞毒性表征方法：在细胞超净台将培养好的L929细胞中共培养的培养基弃去，在每个孔板中加入200μL培养基和20μLCCK‑8溶液，同时在3个无细胞的孔中各加入200μL培养基和20μLCCK‑8溶液作为空白，扣除背景，在37℃培养箱中反应4小时，从各孔板取100μL加入到96孔板中，在酶标仪中进行双波长(450nm和620nm)测定。

[0061] 由图5可知，当Cu‑PCA的含量为1mg/mL时细胞活性最高，细胞相容性最好，说明适2+
量浓度的Cu 对细胞增殖有积极作用。