[0001] 本发明涉及射频美容技术领域，具体涉及一种具有促进Fos基因表达的小分子化合物及其促皮肤胶原再生的应用。

[0002] 全球范围内的人口老龄化是一个显著的社会现象，人口结构正在发生变化，呈现出老年人口比例显著增加的趋势。人体的衰老必然伴随着皮肤衰老，皮肤是人体最大的器官之一，而随着年龄的增长，皮肤会经历一系列的生物学变化，包括胶原蛋白和弹性纤维的减少，皮肤细胞代谢减缓等，并且据研究表明皮肤衰老是全身性衰老的触发性因素。所以，皮肤衰老是美容医学研发领域的关键问题，了解皮肤老化的机制可以指导美容医学研发抗皮肤衰老的技术和药物，使其更加针对性和有效性。目前，射频仪作为安全有效的抗皮肤衰老手段成为现代美容医学的一项重大突破，并且在促进皮肤胶原再生方面展示了独特的优势。

[0003] 射频美容仪应用于皮肤组织，通过导入高频电流，产生电磁波能量，引发局部皮肤组织的升温。这一热刺激对于皮肤内的胶原蛋白非常敏感。当温度升高时，胶原蛋白发生变性和收缩，促使其重新排列。这种热刺激不仅使已有的胶原蛋白更加紧致，还刺激细胞启动生物学反应，促使合成更多的新胶原蛋白，改善皮肤的弹性和紧致度。同时皮肤的热刺激可以激活多个细胞信号通路，其中包括ERK1/2和MAPK等信号通路，这些信号通路直接参与细胞的增殖、合成和分泌过程。而射频技术可以刺激成纤维细胞的活性，增加胶原蛋白的合成，有助于改善皮肤的质地和外观。射频技术引发的局部升温可以模拟轻度的炎症反应。这种炎症反应有助于清除老化细胞和垃圾物质，促进新陈代谢，炎症反应的适度调控对于皮肤健康至关重要。

[0004] 尽管射频技术在促进皮肤胶原再生中已经取得了一定的成果，但其安全性、效果持久性、稳定性和适用范围仍需不断提高。现有的射频美容用促胶原蛋白剂主要有：自体胶原蛋白及与其构成组合的制剂。然后自体胶原蛋白对保存条件苛刻，且来源有限、提取工艺复杂。小分子化合物以其稳定性高、来源广泛、提取工艺相对简单，成为寻找新胶原蛋白剂的方向。

[0005] 本发明基于射频美容对皮肤真皮层转路调控的分子靶点，结合计算机虚拟筛选发现具有全新骨架结构的靶向Fos的活性小分子(2R,3S,4S,5R,6R)‑2‑(hydroxymethyl)‑6‑(4‑hydroxyphenethoxy)tetrahydro‑2H‑p yran‑3,4,5‑triol，进一步证实其可以促进Fos基因、I型、III型胶原蛋白的表达，提高真皮层内胶原蛋白容积，帮助皮肤实现胶原蛋白再生，可作为具有潜在应用价值的射频美容用促胶原再生小分子化合物。

[0025] 本发明针对射频美容提出一种具有潜力的促胶原再生小分子化合物，下面结合本发明的具体实施方式做进一步详细的描述：

[0026] 申请人使用PDB数据库(https：//www.rcsb.org/)下载核心靶点的3D结构(.pdb格式文件)，再利用PubChem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)收集分析得到的小分子药物结构(.sdf格式文件)。运用CB‑Dock2软件(https：//cadd.labshare.cn/cb‑dock2/php/blinddock.php)分别将小分子化合物及靶蛋白上传系统后进行分子对接。结合能＜0kcal/mol说明配体分子与受体蛋白可以自发结合。最终筛选到本发明的小分子化合物具有较好的结合Fos蛋白的活性。申请人委托成都普瑞法科技开发有限公司合成该小分子化合物，批号为PRF22062403，并应用于体内外实验验证。

[0027] 实施例1：苏木素‑伊红(H&E)染色评价小分子化合物促进小鼠皮肤真皮层厚度增加实验

[0028] 1.1实验药物及主要试剂耗材

[0029] 小分子化合物(成都普瑞法科技开发有限公司，批号PRF22062403),DMSO(Sigma，批号D4540)，异氟烷(深圳瑞沃德生命科技，货号217180801)，4％多聚甲醛通用型组织固定液(Biosharp，货号1810898)，石蜡(国药集团化学试剂有限公司，货号60019562)，二甲苯(国药集团化学试剂有限公司，批号20170801)，无水乙醇(南京化学试剂股份有限公司，货号180711446K)，苏木伊红染色试剂盒(碧云天，货号C0105)，中性树脂胶(Biosharp，货号88671250)，载玻片(CITOGLAS，货号18038)，盖玻片(CITOGLAS，货号10212450C)。

[0030] 1.2主要仪器

[0031] 小动物麻醉机(瑞沃德)，射频美容仪(Tripollar STOPVX2)，组织包埋机(Leica)，石蜡切片机(Leica)，多功能病理成像仪(Perkin Elmer)。

[0032] 1.3实验方法

[0033] 小分子化合物给药治疗：

[0034] 使用SPF级8月龄的ICR雄性小鼠，适应性饲养一周后，除去空白对照组小鼠，射频处理组的每只小鼠背部取2cm×2cm面积备皮，小鼠经异氟烷和麻醉机进行麻醉，根据射频仪的使用说明书，以低档模式在小鼠背部皮肤的处理组按摩打转至温度指示灯亮起，更换治疗区域继续按摩打转，隔天1次，持续治疗28天。灌胃给予小鼠对应浓度的小分子化合物溶液，每天1次，持续给药28天。治疗结束后，每组小鼠进行备皮并处死小鼠，收集皮肤组织。

[0035] 取4％多聚甲醛固定好的小鼠皮肤组织，常规石蜡包埋，4μm切片，切片用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。苏木素染色5min，自来水冲洗，盐酸乙醇分化30s，自来水浸泡15min，置伊红液2min，常规脱水，透明，封片：95％乙醇(I)min→
95％乙醇(Ⅱ)1min→100％乙醇(I)1min→100％乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封固。病理成像仪下观察并拍照，利用ImageJ软件统计分析真皮层的厚度，见图1。

[0036] 1.4结果结论

[0037] 结果表明：H&E染色结果显示，与Ctrl组相比，射频(RF)组和小分子化合物组的小鼠皮肤结构连续、完整(图1A)，Ctrl组、RF组、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg组的真皮层厚度以平均值±标准差表示分别为370.53±39.52μm，569.63±26.33μm，366.91±15.84μm，461.26±38.58μm，485.90±31.04μm。经One‑way ANOVA检验，**P＜0.01，与Ctrl组相比，
40mg/kg组、80mg/kg组真皮层厚度显著增加24.49％，31.14％(图1B)。

[0038] 结论：本发明小分子化合物促进小鼠真皮层厚度增加。

[0039] 实施例2：马松(Masson)染色实验结果显示小分子化合物促进小鼠皮肤胶原容积增加实验

[0040] 2.1实验药物及主要试剂耗材

[0041] Masson三色染色液(武汉赛维尔生物，货号G1006)

[0042] 2.2主要仪器

[0043] 多功能病理成像仪(Perkin Elmer)。

[0044] 2.3实验方法

[0045] 取上述实施例1中水化后的皮肤组织切片在苏木精染色液内染色5min；随后用Masson蓝化液反蓝5min，自来水流水冲洗5min；丽春红品红染色液染色10min；盐酸分化液分化30s，苯胺蓝染色液染色2min，盐酸分化液分化30s；然后按照以下步骤进行脱水：95％乙醇30s→80％乙醇60s→70％乙醇60s→50％乙醇2min→30％乙醇2min透明，中性树脂封片(二甲苯：中性树脂＝1:1)，通风橱晾干过夜；次日拍照：将组织切片置于显微镜下(20×)进行组织学观察，蓝色区域即为胶原蛋白纤维。

[0046] 2.4结果结论

[0047] 结果：Masson染色结果显示，与Ctrl组相比，射频(RF)组与小分子化合物组的皮肤胶原纤维更加密集且排列整齐(图2A)，各组胶原容积分数(图2B)以平均值±标准差表示分别为65.03±3.97％，81.14±1.96％，63.73±2.53％，70.20±4.71％，75.94±3.62％，经One‑way ANOVA检验，***P＜0.001，与Ctrl组相比，小分子化合物80mg/kg组胶原容积分数分别显著增加16.78％(图2B)。

[0048] 结论：本发明小分子化合物促进小鼠皮肤胶原容积增加。

[0049] 实施例3：蛋白免疫印迹实验结果显示小分子化合物促进小鼠皮肤的I型胶原、III胶原蛋白合成实验

[0050] 3.1实验药物及主要试剂耗材

[0051] BCA蛋白定量试剂盒(碧云天，货号P0012)，PAGE凝胶快速制备试剂盒(雅酶，货号20327ES62),蛋白分子量标准(雅酶，货号WJ101)，蛋白变性上样缓冲液(碧云天，货号P0015L)，过硫酸铵(华美生物，货号9804)，TEMED(碧云天，货号ST728)，甲醇(上海中试化工，货号1230)，无水乙醇(南京试化，货号180711446K)，RIPA裂解液(碧云天，货号P0013C)，磷酸酶抑制剂(碧云天，货号P1045‑2)，蛋白酶抑制剂(碧云天，货号P1045‑1)，吐温‑20(源叶生物，货号S15016)，脱脂奶粉(光明乳业，货号746709)，牛血清白蛋白(BioFroxx，货号EZ7890D182)，PVDF膜(Millipore，货号IPVH00010POPE)，ECL化学发光液(Biosharp，货号BL523B)，GAPDH抗体(proteintech，货号10494‑1)，I型胶原蛋白抗体(proteintech，货号
66701‑1‑2g)，III型胶原蛋白抗体(proteintech，货号22734‑1‑AP)，兔二抗(bioworld，货号bs13278)，鼠二抗(bioworld，货号bs12478)。

[0052] 3.2主要仪器

[0053] 垂直电泳仪(Biorad，型号MiniProtean 3Cell)，转膜仪(Biorad)，涡旋混匀仪(其林贝尔，型号Vortex‑5)，高速组织细胞研磨仪(武汉赛维尔，型号KZ‑Ⅱ)，凝胶成像系统(Bio‑Rad，ChemiDocM XRS+)

[0054] 3.3实验方法

[0055] 称取适量皮肤组织剪碎，加入RIPA蛋白裂解液，置于放入高速组织细胞研磨仪中匀浆。4℃，12000rpm离心10min。离心结束后，吸取上清液，获取组织总蛋白。随后，使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。在95℃下进行变性10min。进行聚丙烯凝胶电泳，转膜，封闭，蛋白抗体孵育，显色。

[0056] 3.4结果结论

[0057] 结果：Western Blot结果显示，射频(RF)组和小分子化合物组的I型胶原和III胶原在蛋白水平的相对表达量均有所增加(图3A)，经One‑way ANOVA检验，***P＜0.001，与Ctrl组相比，小分子化合物80mg/kg组的I型胶原蛋白表达水平显著增加(图3B)。经One‑way ANOVA检验，***P＜0.001，**P＜0.01，与Ctrl组相比，40mg/kg、80mg/kg组的III型胶原蛋白表达水平显著增加(图3C)。

[0058] 结论：本发明小分子化合物促进小鼠皮肤的I型胶原、III胶原蛋白合成。

[0059] 实施例4：实时荧光定量PCR实验结果显示小分子化合物促进小鼠皮肤组织中编码I型胶原和III型胶原的基因Col1a1、Col3a1的转录实验

[0060] 4.1实验药物及主要试剂耗材

[0061] Trizol(Invitrogen)，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞，货号Q331)，HiScript IIQ RT SuperMix for qPCR(诺唯赞，货号R223)

[0062] 4.2主要仪器

[0063] 紫外微量分光光度计(NanoDrop，货号ND‑One)，梯度PCR仪(Bio‑rad，型号Veriti96)，荧光定量PCR仪(Thermo Fisher Scientific，型号IQ5)

[0064] 4.3实验方法

[0065] 皮肤组织各取30‑50mg，加入500μL TRIZOL，研磨机设定频率65HZ，研磨6×90s；研磨结束后常温离心分离组织碎片，取上清液至新的无酶1.5mL离心管。按照Trizol说明书进行总RNA的提取。经过浓度定量后，取500ng总RNA进行逆转录。根据鼠源I型胶原蛋白、III性胶原蛋白编码基因Col1a1、Col3a1设计相应的引物，进行实时荧光定量PCR(qPCR)。

[0066] 4.4结果结论

[0067] 结果：RT‑qPCR结果显示，在转录水平上，射频(RF)组和小化合分子处理组的编码I型胶原和III型胶原的基因Col1a1、Col3a1相较于Ctrl组的增长幅度更加显著。经One‑way ANOVA检验，***P＜0.001，与Ctrl组相比，80mg/kg组Col1a1的mRNA相对表达水平显著增加(图4A)，经One‑way ANOVA检验，*P＜0.05，与Ctrl组相比，80mg/kg组Col3a1的相对mRNA表达水平比未处理组显著增加(图4B)。

[0068] 结论：本发明小分子化合物促进小鼠皮肤组织中编码I型胶原和III型胶原的基因Col1a1、Col3a1的转录。

[0069] 实施例5：小分子化合物显著上调小鼠皮肤组织中FOS蛋白的表达实验[0070] 5.1实验药物及主要试剂耗材

[0071] Hoechst(中杉金桥，货号ZLI‑9018)，荧光防淬灭剂(碧云天，货号P0126‑25mL)，柠檬酸抗原修复液(索莱宝，货号C1032)，抗FOS抗体(Cell Signaling Technology,货号2205s)

[0072] 5.2主要仪器

[0073] 半自动切片机(德国莱卡,型号RM2245)，荧光显微镜(Leica)

[0074] 5.3实验方法

[0075] 取上述实施例1中水化后的皮肤组织切片，用PBS缓冲液冲洗，放置抗原修复缓冲液(3.0g柠檬酸钠和0.4g柠檬酸溶于1L三蒸水)中浸没，微波加热沸腾后自然冷却；封闭：5％ BSA封闭，4℃过夜孵育或室温孵育1‑2h；洗片；一抗孵育：甩干切片，加入30‑50μL稀释后的一抗(抗Fos抗体，稀释比＝1：5000)，抗体覆盖组织。置于湿盒中，4℃过夜孵育；洗片；
二抗避光孵育：甩干切片，每个组织滴加30‑50μL二抗，室温孵育1‑2h；洗片；Hoechst染色：
根据组织滴加30‑50μL，室温孵育10‑15min；洗片；防荧光淬灭剂封片，置显微镜下拍摄。

[0076] 5.4结果结论

[0077] 结果：免疫荧光结果显示，与Ctrl组相比，射频(RF)组和小分子化合物组的FOS蛋白的表达量升高(图5A)。经One‑way ANOVA检验，***P＜0.001，小分子化合物80mg/kg组FOS蛋白的阳性率表达显著增加(图5B)。

[0078] 结论：本发明小分子化合物显著上调小鼠皮肤组织中FOS蛋白的表达。

[0079] 实施例6：免疫组化染色评价小分子化合物对小鼠皮肤组织中MMP9蛋白的表达的影响实验

[0080] 6.1实验药物及主要试剂耗材

[0081] 柠檬酸抗原修复液(索莱宝，货号C1032)，DAB显色液(碧云天，货号P0202)，苏木精(Leagene，货号DH0006)，盐酸分化液(Leagene，货号DH0079)，抗MMP9抗体(赛维尔，货号GB11132)，返蓝液(Leagene，货号DH0060)，过氧化氢(Sigma)，牛血清白蛋白(BSA)(碧云天，货号ST2254‑5g)。

[0082] 6.2主要仪器

[0083] 多功能病理成像仪(Perkin Elmer)。

[0084] 6.3实验方法

[0085] 取上述实施例1中水化后的皮肤组织切片，进行抗原修复：放置抗原修复缓冲液(3.0g柠檬酸钠和0.4g柠檬酸溶于1L三蒸水)中浸没，微波加热沸腾后自然冷却；灭活内源性过氧化物酶：在玻片组织区域加入适量内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min，PBS清洗；封闭：含1.5％BSA的PBS封闭30min，PBS清洗；孵育一抗：滴加适量一抗(抗MMP抗体，稀释比＝1:500)，放置湿盒内4℃过夜孵育；增强反应：PBS清洗后，在玻片组织区域滴加适量反应增强液，室温孵育20min，随后PBS清洗。接着在玻片组织区域滴加增强酶标山羊抗兔IgG聚合物，室温孵育20min，PBS清洗；DAB显色，室温显色5min左右，显微镜下观察染色情况，流水终止反应；染色：利用苏木素3min、流水冲洗、盐酸分化液3s、流水冲洗复染；脱水封片，结束后置显微镜下拍照。

[0086] 6.4结果结论

[0087] 结果：免疫组化结果显示，与Ctrl组相比，射频(RF)组和小分子化合物组的MMP9蛋白的表达量下降(图6A)，经One‑way ANOVA检验，***P＜0.001，与Ctrl组相比，小分子化合物80mg/kg组的MMP9蛋白的阳性率表达显著降低；**P＜0.01，小分子化合物40mg/kg组的MMP9蛋白的阳性率表达显著降低。(图6B)。

[0088] 结论：小分子化合物显著下调小鼠皮肤组织中MMP9蛋白的表达。

[0089] 实施例7：体外细胞实验评价小分子化合物对L929小鼠成纤维细胞活力、Fos、Mmp9的mRNA水平影响实验

[0090] 7.1实验药物及主要试剂耗材

[0091] L929小鼠成纤维细胞(武汉赛维尔生物科技，货号STCC20025P)，青霉素‑链霉素溶液(Gibco，货号2199880)，MEM培养基(Servicebio,G4551‑500 mL),胰蛋白酶(Amersco,货号3112)，胎牛血清FBS(Cellmax，货号SA301.02)，CCK8(BioFroxx，货号1334GR001)，细胞培养皿(NEST，货号704001)，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞，货号Q331)，HiScript IIQ RT SuperMix for qPCR(诺唯赞，货号R223)。

[0092] 7.2主要仪器

[0093] 超净工作台(ESCO，货号ESCO AC2)，二氧化碳培养箱(Thermo，货号3131)，液氮罐(CBS，货号2001)，细胞计数仪(Countstar)，酶标仪(EnSpire，Perkin Elmer)，梯度PCR仪(Bio‑rad，型号Veriti96)，荧光定量PCR仪(Thermo Fisher Scientific，型号IQ5)[0094] 7.3实验方法

[0095] 按0、1.25、2.5、5、10、20、40、80、100μM的浓度加入100μL含小分子化合物的培养基，每组设6个复孔，培养24h后，加入CCK8测细胞活力，酶标仪检测波长为450nm吸光度值，计算相对细胞生长率(％)＝(OD给药孔/OD对照孔)×100％。

[0096] 取实施例4中的总RNA500 ng进行逆转录。根据鼠源Fos、Mmp9基因设计相应的引物，进行实时荧光定量PCR(qPCR)。

[0097] 7.4结果结论

[0098] 结果：CCK8实验结果发现，小分子化合物在0‑100μM的范围内对细胞均无显著的细胞毒性(图7A)。我们选择了0、10、20、40μM药物浓度的小分子化合物处理L929小鼠成纤维细胞24小时，结束给药后提取各组细胞的RNA，RT‑qPCR结果显示，在转录水平上，与对照组相比，40μM的小分子化合物促进L929小鼠成纤维细胞中Fos的mRNA水平显著增长(图7B)，同时，Mmp9的mRNA水平被显著抑制(图7C)。

[0099] 结论：小分子化合物无明显细胞毒性，具有调控靶点基因Fos的转录上调而发挥促进胶原再生的潜力。

[0100] 实施例8：取本发明小分子化合物(成都普瑞法科技开发有限公司，批号PRF22062403)100g，化学名为：(2R,3S,4S,5R,6R)‑2‑(hydroxymethyl)‑6‑(4‑hydroxyphenethoxy)tetrahydro‑2H‑pyran‑3,4,5‑triol，添加辅料，制备口服液。

[0101] 实施例9：取本发明小分子化合物(成都普瑞法科技开发有限公司，批号PRF22062403)100g，化学名为：(2R,3S,4S,5R,6R)‑2‑(hydroxymethyl)‑6‑(4‑hydroxyphenethoxy)tetrahydro‑2H‑pyran‑3,4,5‑triol，添加辅料，制备成注射剂。

[0102] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。