[0001] 本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种具有降血糖活性的竹多肽及其制备方法和应用。

[0002] 糖尿病是由遗传因素、内分泌功能紊乱等各种致病因子作用，导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点。糖尿病发生趋低龄化、长病程、并发症多、健康危害严重和医疗支出费用高等特点。长期慢性的高血糖，可导致眼、神经、肾脏和心血管等组织和器官的损害而出现一系列的并发症，严重危害人体健康。因此，预防和治疗II型糖尿病已成为慢性病防控关注的焦点。

[0003] DPP‑IV是一种肠促胰岛素激素，是治疗II型糖尿病的关键靶标酶之一。DPP‑IV抑制剂能抑制DPP‑IV活性，降低GLP‑1和GIP的降解速率，延长肠促胰岛素的活性，进而有效降低餐后血糖浓度。II型糖尿病病人常规治疗中普遍存在低血糖症和体重严重超标问题。与传统治疗药物相比，DPP‑IV抑制剂可有效减轻上述问题。然而，临床使用人工合成DPP‑IV抑制剂时，少数患者会出现轻微的不良反应，如腹泻、上呼吸道感染等。膳食成分对II型糖尿病的防治具有重要作用，机制之一就是食物组分能够抑制DPP‑IV。经胃肠道消化、体外酶解或特定加工，食物蛋白可释放出肽片段，大量研究证实某些肽片段具有抑制DPP‑IV的功能。与传统药物相比，食源蛋白制备的DPP‑IV抑制剂，其毒性和副作用较小。食源DPP‑IV抑制肽可能用作功能食品的配料以辅助调节血糖。然而目前关于食源DPP‑IV抑制肽的报道相对较少，即便有在使用的DPP‑IV抑制肽，其普遍存在降血糖效果较差的问题。

[0047] 本发明提供了一种具有降血糖活性的竹多肽，所述竹多肽包括：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的竹多肽和/或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽。

[0048] 在本发明中，所述竹多肽根据原料的不同可以分别称之为竹笋多肽、退笋多肽和嫩竹多肽等。

[0049] 在本发明中，所述竹多肽可以采用常规多肽合成方法直接制备得到，也可以采用本发明提供的制备方法制备得到。

[0050] 本发明提供上述技术方案所述竹多肽的制备方法，包括以下步骤：

[0051] 将竹匀浆液进行发酵，得到发酵液；

[0052] 收集所述发酵液中分子量小于3kDa的多肽，得到竹多肽。

[0053] 本发明将竹匀浆液进行发酵，得到发酵液。本发明优选先进行竹匀浆液的制备；所述竹匀浆液的制备方法优选包括以下步骤：将竹原料粉碎后与水进行混合，然后匀浆，得到竹匀浆液；所述竹原料与水混合的料液比优选为1kg:(5～15)L。在本发明中，所述竹原料优选包括竹笋、退笋和嫩竹的任一种或两种以上；所述嫩竹优选包括一年生以内的竹子；所述竹笋优选包括竹笋加工剩余物。本发明对所述竹原料的来源没有特殊限定，采用本领域常规的竹原料均可。得到竹原料后，本发明优选先将竹原料依次进行去壳、清洗和切块后再进行粉碎。本发明对所述去壳、清洗、切块和粉碎的方法没有特殊限定，采用常规方法均可。本3
发明所述粉碎的体积优选为2mm 。粉碎后，本发明优选得到粉碎物料。得到粉碎物料后，本发明优选将所述粉碎物料与水进行混合，得到混合物料；所述粉碎物料与水混合的料液比优选为1kg:(5～15)L，更优选为1kg:10L。在本发明中，所述水优选包括蒸馏水。得到混合物料后，本发明优选将混合物料进行匀浆；本发明对所述匀浆的方法没有特殊限定，采用本领域常规匀浆方法均可；本发明所述匀浆优选在室温条件下进行。匀浆完成后，本发明得到竹匀浆液。

[0054] 得到竹匀浆液后，本发明优选将所述竹匀浆液进行发酵。在本发明中，得到竹匀浆液后，优选将竹匀浆液灭菌后进行发酵；本发明对所述灭菌的条件没有特殊限定，采用常规灭菌方法均可。在本发明中，所述灭菌的温度优选为121℃；所述灭菌的时间优选为20min。在本发明中，所述发酵用菌剂优选包括高地芽孢杆菌ICBR‑C01；所述高地芽孢杆菌ICBR‑C01的保藏编号为CGMCC No.29900。本发明进行发酵时，所用菌剂的接种量为竹匀浆液体积
6 8
的6％～10％，更优选为8％；所用菌剂的菌活优选为1×10 ～1×10CFU/mL，更优选为1×
7 7
10CFU/mL。进一步地，本发明进行发酵时，优选将菌活为1×10CFU/mL的菌液按竹匀浆液体积的6％～10％进行接种。本发明所述发酵优选包括有氧发酵；所述发酵的温度优选为20℃～37℃，更优选为37℃；所述发酵的时间优选为8～15h，更优选为12h；所述发酵优选伴随搅动；所述搅动的转速优选为150～200rpm，更优选为200rpm。在本发明中，所述发酵优选在控温摇床中进行。发酵完成后，本发明优选将发酵产物离心后进行过滤，得到发酵液；所述离心的转速优选为6000rpm；所述离心的时间优选为10min；离心完成后，本发明优选进行过滤；所述过滤优选采用0.22μm滤膜进行。本发明采用0.22μm滤膜进行过滤主要是滤除发酵菌以终止发酵的进行。过滤完成后，本发明取滤液得到发酵液。

[0055] 得到发酵液后，本发明收集所述发酵液中分子量小于3kDa的多肽，得到竹多肽。在本发明中，所述收集的方法优选包括离心超滤。离心超滤优选采用超滤离心管进行；所述超滤离心管的截留分子量优选为3kDa；所述离心的转速优选为10000rpm；所述离心的时间优选为20min。离心完成后，本发明收集滤液，所述竹多肽存在于滤液中。

[0056] 得到竹多肽后，本发明优选将所述竹多肽鉴定后，进行DPP‑IV抑制肽和/或ACE抑制肽的筛选，得到具有降血糖和/或降血压活性的竹多肽。在本发明中，所述鉴定方法优选包括LC‑MS/MS检测、数据库检索和多肽组学分析。本发明对所述鉴定的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规方法均可。本发明优选通过多肽组学分析获得发酵液中新产生的多肽序列。得到多肽序列后，本发明优选通过多肽序列分析氨基酸结构，利用多肽活性预测工具筛选DPP‑IV抑制肽和/或ACE抑制肽。

[0057] 本发明采用上述技术方案所述制备方法制备得到的竹多肽与DPP‑IV和/或ACE的分子对接结果较好，与相应靶点具有较好的结合能力。经DPP‑IV抑制活性测定验证，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的竹多肽和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽对DPP‑IV的IC50分别为367.2438μM和305.1922μM。氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽对ACE的IC50为13.5211μM。通过上述结果说明：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的竹多肽和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽均对DPP‑IV具有明显的抑制作用；同时，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽还具有明显的ACE抑制作用。

[0058] 本发明提供了上述技术方案所述竹多肽或上述技术方案所述制备方法制备得到的竹多肽在制备降血糖产品中的应用。在本发明中，所述产品优选包括保健品和/或功能食品。本发明所述竹多肽与已报道的DPP‑IV抑制肽相比，具有明显的优势，可应用于制备具有辅助降血糖功能的保健品和功能食品，具有广阔的市场应用前景。

[0059] 本发明还提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽在制备降压产品中的应用。在本发明中，所述产品优选包括保健品和/或功能食品。本发明所述竹多肽与已报道的ACE抑制肽相比，具有明显的优势，可应用于制备具有辅助降压功能的保健品和功能食品，具有广阔的市场应用前景。

[0060] 本发明还提供了一种竹多肽在制备降血糖产品中的应用，所述竹多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。在本发明中，所述产品优选包括保健品和/或功能食品。在本发明中，所述竹多肽也是采用上述技术方案所述制备方法制备得到。在本发明中，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的竹多肽对DPP‑IV的IC50为541.7933μM。氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的竹多肽对DPP‑IV具有明显的抑制作用。本发明所述竹多肽与已报道的DPP‑IV抑制肽相比，具有明显的优势，可应用于制备具有辅助降血糖功能的保健品和功能食品，具有广阔的市场应用前景。

[0061] 为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0062] 实施例1

[0063] 竹笋多肽，其制备方法具体为：

[0064] 1.发酵液的制备

[0065] 将竹笋去壳清洗，切块粉碎2mm3大小，按笋肉与蒸馏水的料液比为1kg:10L匀浆，匀浆在室温条件下进行，得到匀浆液后，将匀浆液于121℃，灭菌20min，制成竹笋匀浆液。按8％(v：v)的接种量向竹笋匀浆液中接入高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)ICBR‑C01
7
菌液，所述菌液的菌活为1×10CFU/mL。于37℃有氧发酵12h，发酵时置于控温摇床，摇床转速为200rpm，之后将发酵液转入离心管中6000rpm离心10min，取上清过0.22μm滤膜终止反应。

[0066] 2.低分子量肽的回收

[0067] 采用离心超滤法回收分子量小于3kDa的多肽。取0.5mL离心后上清液于2mL、截留分子量是3kDa的超滤离心管中，10000rpm离心20min，收集滤液，滤液中含有竹笋多肽。

[0068] 3.样品还原烷基化前处理

[0069] (1)取步骤2中竹笋多肽滤液样品，加入浓度为1M二硫苏糖醇溶液使竹笋多肽滤液样品中二硫苏糖醇终浓度为10mmol/L，于56℃水浴中还原1h；

[0070] (2)加入浓度为10mM碘乙酰胺溶液使其终浓度为50mmol/L，避光反应40min；

[0071] (3)使用自填脱盐柱脱盐，于45℃真空离心浓缩仪中挥干溶剂。

[0072] 4.竹笋多肽的鉴定

[0073] 采用LC‑MS/MS检测，具体条件与步骤为：

[0074] (1)液相色谱条件

[0075] ①分析柱：AcclaimTM PepMapTM RPLC C18(150μm I.D.×150mm，3μm， )；

[0076] ②流动相A：体积分数0.1％甲酸水溶液；

[0077] ③流动相B：体积分数80％乙腈(含0.1％甲酸)水溶液；

[0078] ④流速：600nL/min；

[0079] ⑤分析时间：66min；

[0080] (2)质谱条件

[0081] ①一级质谱参数：Resolution：120,000；AGCtarget：Standard；MaximumIT：20ms；Scanrange：300to 1800m/z。

[0082] ②二级质谱参数：Resolution：50,000；AGCtarget：Standard；MaximumIT：22ms；TopN：20；NCE/steppedNCE：30。

[0083] (3)LC‑MS/MS检测

[0084] 当检测发酵前的竹笋多肽时，取竹笋匀浆过0.22μm滤膜后的滤液100μL，进行样品还原烷基化前处理后，进行LC‑MS/MS检测。LC‑MS/MS检测结果如图1所示。

[0085] 当检测发酵后的滤液中的竹笋多肽时，取步骤3还原烷基化处理后的样品，进行LC‑MS/MS检测。LC‑MS/MS检测结果如图2所示。

[0086] 其中图1为LC‑MS/MS检测发酵前总离子流图；图2为LC‑MS/MS检测发酵后总离子流图。

[0087] 图1中的数字从左到右依次为0.16，3.65，4.18，5.17，5.86，8.10，9.42，9.92，9.99，10.48，13.66，15.12，15.49，15.76，17.86，18.55，19.30，21.11，23.55，23.85，24.99，
27.39，27.52，29.69，30.77，32.14，34.74，34.91，36.75，38.62，41.17，43.43，43.97，
44.77，45.10，46.04，46.96，49.70，52.09，53.02，55.47。

[0088] 图2中数字从左到右依次为1.86，4.07，5.63，5.90，6.79，6.95，8.69，9.39，9.45，9.78，10.01，10.11，11.29，14.23，15.29，17.69，18.11，19.23，20.67，23.04，24.64，27.14，
28.90，30.52，30.97，32.93，33.61，34.65，36.43，36.68，39.04，40.49，42.27，42.77，
43.56，45.01，46.31，47.24，50.08，50.17，51.26，54.35，54.41，54.78，54.89，55.24。

[0089] 3)数据库检索

[0090] 质谱原始文件使用Peaks Studio10.6检索目标蛋白数据库，检索参数如下：固定修饰(Fixed  modifications)：Carbamidomethyl(C)；可变修饰(Variable modifications)：Oxidation(M)，Acetyl(Peptide N‑term)；酶(Enzyme)：None；数据库(Database)：Phyllostachys edulis；遗漏酶切位点(Maximum Missed Cleavages)：2；一级质谱误差(Peptide Mass Tolerance)：20ppm；二级质谱误差(FragmentMass Tolerance)：
0.02Da。

[0091] 4.DPP‑IV抑制肽的筛选

[0092] (1)LC‑MS/MS检测后，将原始下载数据直接提交到Peaks Studio10.6进行目标蛋白数据库检索，过滤掉常见污染蛋白及与之匹配的肽段，得到每个样品鉴定到的肽段序列结果。通过Peaks Studio10.6进行目标蛋白数据库检索和多肽组学分析后获得发酵后新产生的多肽序列。肽组学鉴定上述竹笋发酵前后共获得65条肽，65条肽中包括发酵前的35条肽，发酵后53条多肽，其中，发酵前后共有的肽有23条。

[0093] 其中，氨基酸序列如SEQ ID NO.1(GLAGPPGS)所示的竹多肽的结构鉴定图如图3所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.2(GGLAGPPGS)所示的竹多肽的结构鉴定图如图4所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.3(GFAGDDAPR)所示的竹多肽的结构鉴定图如图5所示。其中，图3中的横坐标轴表示m/z，纵坐标轴表示％intensity，峰图上的数字从左到右依次为654.900、676.759。图4中的横坐标轴表示m/z，纵坐标轴表示％intensity，峰图上的数字为711.807。
图5中的横坐标轴表示m/z，纵坐标轴表示％intensity，峰图上的数字为904.879。为使图3～5便于清晰查看，提供了图18～20，其中图18为图3的放大图；图19为图4的放大图；图20为图5的放大图。

[0094] 分析氨基酸结构，利用多肽活性预测工具初步筛选DPP‑IV抑制肽。

[0095] (2)从RCSB PDB数据库获取DPP‑IV对应的晶体结构(PDB ID：5J3J)。对获得的蛋白质晶体采用薛定谔软件的Protein PreparationWizard模块分别进行protein preprocess，regenerate states of native ligand，H‑bond assignment optimization，protein energy minimization，and remove waters的处理。

[0096] (3)采用Build Biopolymer from Sequence模块中的Peptide选项，对初步筛选的DPP‑IV抑制肽进行建模，并采用ProteinPreparationWizard模块对多肽进行预处理。

[0097] (4)先采用薛定谔中的SiteMap模块，预测最佳的结合位点后，然后采用薛定谔中的Receptor Grid Generation模块，设置最合适的Enclosing box将预测出来的结合位点完美包裹，并在此基础上获取只适用于多肽对接的蛋白质活性位点。

[0098] (5)采用Peptide Docking模块，将处理好的多肽分别与对应蛋白进行多肽‑蛋白对接，并设置多肽对接Pose为10个，对接得分越低代表是该多肽与蛋白质的结合可能性越高。

[0099] (6)将多肽与对应蛋白的活性位点进行MM‑GBSA计算分析，MM‑GBSA dG Bind可以近似代表配体与蛋白质的结合自由能情况，结合自由能越低，表示配体与蛋白的结合稳定性越高。

[0100] (7)将对接得分及结合自由能最低的多肽‑蛋白互作复合物不同链用不同颜色进行标注，并增加Surface，展示3D立体视图。此外，采用Protein InteractionAnalysis模块确定多肽‑蛋白结合的具体区段。

[0101] 综合分析对接与MM‑GBSA结果如图6～14所示。图6～8分别为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的竹多肽与DPP‑IV的分子对接最佳构象3D视图、局部图和相互作用2D图；图9～11分别为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽与DPP‑IV的分子对接最佳构象3D视图、局部图和相互作用2D图；图12～14分别氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的竹多肽与DPP‑IV的分子对接最佳构象3D视图、局部图和相互作用2D图。

[0102] 其中，综合分析对接与MM‑GBSA结果，氨基酸序列分别为GLAGPPGS(SEQ ID NO.1)、GGLAGPPGS(SEQ ID NO.2)、GFAGDDAPR(SEQ ID NO.3)的竹多肽与DPP‑IV的对接得分分别为‑6.941、‑7.7、‑7.358，MM‑GBSA结果分别为‑53.1kcal/mol、‑46.93kcal/mol、‑38.12kcal/mol，结合自由能与对接得分均低，表明这三条多肽与DPP‑IV结合均稳定。

[0103] 如图6～14可得，氨基酸序列如SEQ ID NO.1(GLAGPPGS)所示的竹多肽深入DPP‑IV活性袋内部，与DPP‑IV的Asn562、Val558、Pro510、Lys512和Met509残基各形成一个氢键，与Met509形成一个氢键。

[0104] 氨基酸序列如SEQ ID NO.2(GGLAGPPGS)所示的竹多肽深入DPP‑IV活性袋内部，与Arg560、Asn562和Pro510残基各形成一个氢键，与Glu452残基形成两个氢键，与Lys512残基形成范德华力。

[0105] 氨基酸序列如SEQ ID NO.3(GFAGDDAPR)所示的竹多肽深入DPP‑IV活性袋内部，与DPP‑IV的Tyr752、Trp563、Gly741和Tyr48残基各形成一个氢键，与Arg560残基形成两个氢键，与Tyr547残基形成一个π‑π键。

[0106] 5.氨基酸序列如SEQ ID NO.2(GGLAGPPGS)所示的竹多肽对ACE的抑制效果

[0107] (1)分析氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽氨基酸结构，利用多肽活性预测氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽多肽对ACE的抑制效果。

[0108] (2)从RCSB PDB数据库获取ACE对应的晶体结构(PDB ID：1O8A)。对获得的蛋白质晶体采用薛定谔软件的ProteinPreparationWizard模块分别进行protein preprocess，regenerate states of native ligand，H‑bond assignment optimization，protein energyminimization，andremove waters的处理。

[0109] (3)采用Build Biopolymer from Sequence模块中的Peptide选项，对氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽进行建模，并采用Protein Preparation Wizard模块对多肽进行预处理。

[0110] (4)先采用薛定谔中的SiteMap模块，预测最佳的结合位点后，然后采用薛定谔中的Receptor Grid Generation模块，设置最合适的Enclosing box将预测出来的结合位点完美包裹，并在此基础上获取只适用于多肽对接的蛋白质活性位点。

[0111] (5)采用Peptide Docking模块，将处理好的多肽分别与对应蛋白进行多肽‑蛋白对接，并设置多肽对接Pose为10个，对接得分越低代表是该多肽与蛋白质的结合可能性越高。

[0112] (6)将多肽与对应蛋白的活性位点进行MM‑GBSA计算分析，MM‑GBSA dG Bind可以近似代表配体与蛋白质的结合自由能情况，结合自由能越低，表示配体与蛋白的结合稳定性越高。

[0113] (7)将对接得分及结合自由能最低的多肽‑蛋白互作复合物不同链用不同颜色进行标注，并增加Surface，展示3D立体视图。此外，采用Protein InteractionAnalysis模块确定多肽‑蛋白结合的具体区段。

[0114] 氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽与ACE的分子对接复合模式图如图15～17所示，其中图15～17分别为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽与ACE的分子对接最佳构象3D视图、局部图和相互作用2D图。

[0115] 氨基酸序列如SEQ ID NO.2(GGLAGPPGS)所示的竹多肽与ACE对接得分为‑11.244，MM‑GBSA结果为‑52.94kcal/mol，结合自由能与对接得分均很低，表明GGLAGPPGS与ACE结合很稳定。

[0116] 氨基酸序列如SEQ ID NO.2(GGLAGPPGS)所示的竹多肽深入到ACE活性口袋内部，与ACE残基Lys454、Asp453、Asp415、Gln281、Asn277、Ala354、Tyr523、Hip383、Ala356、Ser517各形成一个氢键，与残基Gln281通过范德华力产生作用。

[0117] 实施例2

[0118] 氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽的ACE抑制率

[0119] 对氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽进行固相合成。

[0120] 固相合成为常规方法，具体合成顺序：从序列C端到N端，步骤如下：a.称取n当量树脂放入反应器，加入DCM(二氯甲烷)溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入序列中第一个氨基酸2n当量，加2n当量的DIEA，适量的DMF和DCM(适量是指以可使树脂充分鼓动起来为宜)，DIEA(二异丙基乙胺)、DMF(二甲基甲酰胺)、DCM，氮气鼓泡反应60min。然后加入约5n当量甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、MeOH洗净；b.往反应器中加入序列中第二个氨基酸(也为2n当量)，2n当量HBTU(苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸盐)及DIEA，N2鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除Fmoc(9‑芴甲氧羰基)保护基，洗净，茚三酮检测；c.依步骤b的方式依次加入序列中不同的氨基酸并进行各种修饰；d.将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量(切割液和树脂大约以10mL/g的比例)的切割液(组成是95％TFA，2％乙二硫醇，2％三异丙基硅烷，1％水)，振荡，滤掉树脂；e.得到滤液，然后向滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然后离心，清洗即可得到序列的粗产物；

[0121] 多肽纯化：将上述得到的粗产物用高效液相色谱将粗品提纯至要求纯度。

[0122] 多肽冻干：纯化好的液体放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。

[0123] 多肽检测：合成好的多肽经RP‑HPLC和LC/MS鉴定纯度及分子量，纯度＞95％。

[0124] N‑(3‑(2‑呋喃酰)丙烯酰‑苯氨酰‑谷氨酰‑谷氨酸(FAPGG，λmax＝340nm，ε＝‑1 ‑12270M cm ，分子量399.40)可以被ACE酶解成N‑[3‑(呋喃)丙稀醇酰]‑2‑苯丙氨酸(FAP，λ‑1 ‑1
max＝340nm，ε＝1512M cm )和双甘氨肽(GG，在340nm处无吸收)，因此可以作为ACE的模拟底物。1mM FAPGG完全转化成FAP和GG的吸光值为0.758，因此可根据340nm吸光度的变化值计算抑制率。

[0125] 按说明采用血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂活性测定试剂盒(Solarbio BC5575)检测样品对血管紧张素转换酶(ACE)的抑制活性。同时以卡托普利作为阳性对照。

[0126] 氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽和阳性对照组对ACE的抑制活性如表1所示。

[0127] 表1竹多肽和阳性对照组对ACE的抑制活性

[0128]   拟合方程 r IC50(μg/mL) 95％置信区间 IC50μMPD2 y＝4.1225+0.8926x 0.9863 9.6183 7.6938‑12.0243 13.5211
卡托普利 y＝6.0160+0.4418x 0.9453 0.0050 0.0010‑0.0251 0.0231

[0129] 注：PD2是氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽的代称。

[0130] 从表1可知，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的竹多肽对ACE的IC50为13.5211μM，说明其具有较好的ACE抑制活性。

[0131] 实施例3

[0132] 竹笋多肽的DPP‑IV抑制率

[0133] 对氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1(GLAGPPGS)、SEQ ID NO.2(GGLAGPPGS)和SEQ ID NO.3(GFAGDDAPR)所示的竹多肽分别进行固相合成，经RP‑HPLC和LC/MS鉴定纯度及分子量，纯度为＞95％。

[0134] 将肽样品溶于100mmol/LTris‑HCl(pH 8.0)缓冲液中，形成一定浓度(4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL)的溶液。将25μL肽样品和25μL底物(浓度为1.6mmol/L)加入96孔板中并混合，37℃下孵育10min。加入50μL DPP‑IV酶(酶活力为8U/L)，混合后将反应物在37℃下孵育60min。立即加入100μL 1mol/L乙酸‑乙酸钠(pH 4.0)缓冲液终止反应，并在酶标仪上测量405nm处的吸光度值。每组实验并行设置3次。DPP‑IV抑制活性计算如下。

[0135] DPP‑IV抑制活性(％)＝{1‑(As‑Asb)/(Anc‑Anbc)}×100％。

[0136] 其中：As为样品反应液在405nm处的吸光度值；Asb为以Tris‑HCl缓冲液代替DPP‑IV酶溶液作为样品空白对照在405nm处的吸光度值；Anc为Tris‑HCl缓冲液代替样品作为阴性对照在405nm处的吸光度值；Anbc为Tris‑HCl缓冲液代替DPP‑IV酶溶液和样品作为阴性空白对照在405nm处的吸光度值。

[0137] 同时以维格列汀为阳性对照。

[0138] 氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的竹多肽对DPP‑IV的抑制活性如表2所示。表2中拟合方程使用DPS数据处理系统，定义数据块→选择专业统计→生物测定→计数型机值分析，将浓度对数转换后，按照系统取默认值LD50、LD95，即可得到回归独立曲线和拟合方程等系列结果。

[0139] 表2PD1、PD2、PD3对DPP‑IV的抑制活性

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[0141] 注：PD1、PD2和PD3分别是氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的竹多肽的代称。

[0142] 从表2可知，氨基酸序列分别如SEQ  ID NO.1(GLAGPPGS)、SEQ ID NO.2(GGLAGPPGS)、SEQ ID NO.3(GFAGDDAPR)所示的竹多肽对DPP‑IV的IC50分别为367.2438μM、
305.1922μM、541.7933μM。说明其具有较好的DPP‑IV抑制活性。

[0143] 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。