技术领域
[0001] 本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种异嗜性抗体阻断剂和肌红蛋白检测试剂盒。
相关背景技术
[0002] 肌红蛋白(Myoglobin，Mb)是肌肉中储存和运载氧的蛋白质，由一条多肽链和一个辅基血红素构成，相对分子质量约为16700kD，含153个氨基酸残基，生理功能上有助于肌细胞将氧转运至线粒体。当心肌或骨骼肌细胞膜通透性增高时，肌红蛋白易从细胞浆逸脱进入血循环，并经肾脏排泄。因此，肌红蛋白是反映骨骼肌、心肌受损有其程度的灵敏指标。
[0003] 目前，通常采用乳胶增强透射比浊法、ELISA法和胶体金法等方法进行肌红蛋白的测定。但在检测过程中，由于异嗜性抗体等干扰的存在，导致检测结果可能会出现假阳性。
[0004] 异嗜性抗体也称为嗜异性抗体(Heterophile Antibody，HA)，是由已知或未知抗原物质刺激人体免疫系统分泌的，能与动物免疫球蛋白非特异性结合的一种内源性自身抗体。尤其是曾密切接触动物、进食受污染的食品、接受来源于单克隆动物抗体制剂治疗、感染、输血等都可能成为HA产生的原因。异嗜性抗体所产生的干扰归根到底是非特异性抗原、抗体竞争反应导致的误差。为消除异嗜性抗体的干扰，市面上常使用异嗜性抗体阻断剂去除干扰。
[0005] 目前，阻断剂在体外诊断试剂中应用广泛，主要有Roche的MARK33系列，Scantibodies的HBR系列，Meridian的TRUBLOCK系列，Millipore的CHEMIBLOCK系列以及菲鹏的HIER系列等，但不同类型、不同厂家的阻断剂阻断效果可能大相径庭，而且目前市面上的绝大多数阻断剂属于广谱性，针对性不强。
[0006] 据此，如果能研发出一种专门针对肌红蛋白检测的异嗜性抗体阻断剂，便能够大大提高试剂的性能，减少假阳率，为检测结果提供了可靠保证。
具体实施方式
[0024] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。同时，以下实施例中的所使用的试剂产品及实验方法，未经特别说明的，均为本领域常规试剂或方法，不再赘述。
[0025] 实施例1
[0026] 本实施例的一种自研4‑MR‑poly阻断剂抗体(异嗜性抗体阻断剂)，包括轻链和重链；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本实施例4‑MR‑poly阻断剂抗体能够结合血清中类似异嗜性抗体等干扰物质。
[0027] 实施例2
[0028] 本实施例的一种上述实施例中4‑MR‑poly阻断剂抗体的制备：
[0029] (1)CHO‑K1悬浮表达系统表达4‑MR‑poly阻断剂抗体
[0030] a.细胞复苏：取一支液氮冻存CHO细胞(约1x10E7细胞)，37℃水浴快速融化，300g，离心5min。用酒精棉擦拭冻存管后置于超净工作台，吸出上清，用20mL预温的CHO完全培养基重悬，并置于125mL摇瓶培养，37℃培养温度，5％CO2，120～130rpm转速。
[0031] b.质粒抽提：提前接种“含4‑MR‑poly阻断剂抗体的pCDNA4.2载体的DH5a菌株”(生物公司基因合成，4‑MR‑poly阻断剂抗体的序列见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)，并于37℃培养过夜，用商业化质粒抽提试剂盒抽提质粒。
[0032] c.细胞转染：细胞活率大于95％、无明显细胞聚团、密度在2到3x 10E6时，取4x 10E7 CHO细胞，300g、离心5min。去除上清，用Celetrix商业化电转液400uL重悬CHO细胞，质粒使用25ug，分别消耗CHO细胞2x10E7。用Celetrix细胞电转仪1250V电压下进行电转，电转后细胞静置恢复24h。
[0033] d.细胞转接及流加培养：细胞恢复后，将细胞转接至发酵培养基中，密度0.5x10E6。培养至Day5，开始流加补料，到Day7降温培养。
[0034] e.上清收取：培养至Day15或细胞活率低于60％，将培养上清离心，去除细胞沉淀，保留上清。
[0035] (2)亲和纯化“4‑MR‑poly阻断剂抗体”
[0036] a.亲和柱装填：计算所需商品化的镍填料，并将填料进行装柱，将装柱的填料用PBS平衡缓冲液进行清洗。
[0037] b.上样及清洗：将离心收集的细胞上清低流速上样，上样结束后用平衡缓冲液清洗10个柱体积，用20mM咪唑的预洗脱液A清洗10个柱体积。
[0038] c.洗脱与透析：将预洗脱液清洗后的填料，用250mM咪唑的Tris洗脱液进行洗脱，洗脱后的蛋白用20mM的PBS缓冲液透析过夜，透析换液后的抗体分装保存。
[0039] 实施例3
[0040] 本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法的肌红蛋白检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂。
[0041] R1试剂包括：10mmol/L Tris缓冲液，90g/L NaCl，15g/L聚乙二醇‑6000，3mL/L吐温‑20，3mL/L曲拉通X‑100，3g/L BSA，0.5mL/L PC300，50mg/L异嗜性抗体阻断剂(本发明自研4‑MR‑poly阻断剂抗体)。
[0042] R2试剂包括：10mmol/L Tris缓冲液，0.5mL/L吐温‑20，1.5g/L BSA，8g/LNaCl，0.5mL/L PC300，30mg/L胶乳肌红蛋白抗体。
[0043] 制备方法：
[0044] (1)配制R1试剂：
[0045] 将Tris加入到水中，初调pH至7.50；加入NaCl、聚乙二醇‑6000、吐温‑20、曲拉通X‑100、BSA、PC300，并调节pH至7.50±0.02；采用直径0.45μm的醋酸纤维素膜过滤溶液后，加入异嗜性抗体阻断剂。
[0046] (2)制备胶乳肌红蛋白抗体：
[0047] A.胶乳颗粒的洗涤及活化
[0048] ①将胶乳颗粒加入10mM的MES缓冲液中洗涤液离心，弃上清，重复洗涤3次；
[0049] ②将沉淀重悬于10mM的MES缓冲液中，加入EDC和NHS活化30min；
[0050] ③活化后的胶乳颗粒，用10mM MES缓冲液洗涤3次后重悬；
[0051] B.抗体偶联及封闭
[0052] ①取活化洗涤后的胶乳溶液，加入肌红蛋白抗体(成都汇瑞新元生物科技有限责任公司，货号301081，批号JE0270)，混匀后37℃摇床220rpm偶联2h；
[0053] ②用10mM MES缓冲液洗涤上述微球颗粒，重复3次；
[0054] ③加入封闭剂封闭2h；
[0055] ④用MES缓冲液洗涤上述微球颗粒，重复3次，获得“胶乳肌红蛋白抗体”。
[0056] (3)配制R2试剂：
[0057] 将Tris加入到水中，初调pH至7.50；加入吐温‑20、BSA、PC300，并调节pH至7.50±0.02；采用直径0.45μm的醋酸纤维素膜过滤溶液，再加入胶乳肌红蛋白抗体。
[0058] 实施例4
[0059] 本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法的肌红蛋白检测试剂盒试剂盒，包括R1试剂和R2试剂。
[0060] R1试剂包括：20mmol/L Tris缓冲液，100g/L NaCl，20g/L聚乙二醇‑6000，5mL/L吐温‑20，5mL/L曲拉通X‑100，5g/L BSA，1mL/L PC300，60mg/L异嗜性抗体阻断剂(本发明自研4‑MR‑poly阻断剂抗体)。
[0061] R2试剂包括：20mmol/L Tris缓冲液，1mL/L吐温‑20，2g/L BSA，10g/L NaCl，1mL/L PC300，40mg/L胶乳肌红蛋白抗体。
[0062] 制备方法：
[0063] (1)配制R1试剂：
[0064] 将Tris加入到水中，初调pH至8.0；加入NaCl、聚乙二醇‑6000、吐温‑20、曲拉通X‑100、BSA、PC300，并调节pH至7.50±0.02；采用直径0.45μm的醋酸纤维素膜过滤溶液后，加入异嗜性抗体阻断剂。
[0065] (2)制备胶乳肌红蛋白抗体：
[0066] A.胶乳颗粒的洗涤及活化
[0067] ①将胶乳颗粒加入20mM的MES缓冲液中洗涤液离心，弃上清，重复洗涤3次；
[0068] ②将沉淀重悬于20mM的MES缓冲液中，加入EDC和NHS活化30min；
[0069] ③活化后的胶乳颗粒，用20mM MES缓冲液洗涤3次后重悬；
[0070] B.抗体偶联及封闭
[0071] ①取活化洗涤后的胶乳溶液，加入肌红蛋白抗体(成都汇瑞新元生物科技有限责任公司，货号301081，批号JE0270)，混匀后37℃摇床220rpm偶联2h；
[0072] ②用MES缓冲液洗涤上述微球颗粒，重复3次；
[0073] ③加入封闭剂封闭2h；
[0074] ④用MES缓冲液洗涤上述微球颗粒，重复3次，获得“胶乳肌红蛋白抗体”。
[0075] (3)配制R2试剂：
[0076] 将Tris加入到水中，初调pH至7.8；加入吐温‑20、BSA、PC300，并调节pH至7.50±0.02；采用直径0.45μm的醋酸纤维素膜过滤溶液，再加入胶乳肌红蛋白抗体。
[0077] 实施例5
[0078] 本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法的肌红蛋白检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂。
[0079] R1试剂包括：30mmol/L Tris缓冲液，110g/L NaCl，25g/L聚乙二醇‑6000，8mL/L吐温‑20，8mL/L曲拉通X‑100，8g/L BSA，1.5mL/L PC300，70mg/L异嗜性抗体阻断剂(本发明自研4‑MR‑poly阻断剂抗体)。
[0080] R2试剂包括：30mmol/L Tris缓冲液，1.5mL/L吐温‑20，2.5g/L BSA，12g/LNaCl，1.5mL/L PC300，50mg/L胶乳肌红蛋白抗体。
[0081] 制备方法：
[0082] (1)配制R1试剂：
[0083] 将Tris加入到水中，初调pH至8.50；加入NaCl、聚乙二醇‑6000、吐温‑20、曲拉通X‑100、BSA、PC300，并调节pH至7.50±0.02；采用直径0.45μm的醋酸纤维素膜过滤溶液后，加入异嗜性抗体阻断剂。
[0084] (2)制备胶乳肌红蛋白抗体：
[0085] A.胶乳颗粒的洗涤及活化
[0086] ①将胶乳颗粒加入30mM的MES缓冲液中洗涤液离心，弃上清，重复洗涤3次；
[0087] ②将沉淀重悬于30mM的MES缓冲液中，加入EDC和NHS活化30min；
[0088] ③活化后的胶乳颗粒，用30mM MES缓冲液洗涤3次后重悬；
[0089] B.抗体偶联及封闭
[0090] ①取活化洗涤后的胶乳溶液，加入肌红蛋白抗体(成都汇瑞新元生物科技有限责任公司，货号301081，批号JE0270)，混匀后37℃摇床220rpm偶联2h；
[0091] ②用MES缓冲液洗涤上述微球颗粒，重复3次；
[0092] ③加入封闭剂封闭2h；
[0093] ④用MES缓冲液洗涤上述微球颗粒，重复3次，获得“胶乳肌红蛋白抗体”。
[0094] (3)配制R2试剂：
[0095] 将Tris加入到水中，初调pH至8.00；加入吐温‑20、BSA、PC300，并调节pH至7.50±0.02；采用直径0.45μm的醋酸纤维素膜过滤溶液，再加入胶乳肌红蛋白抗体。
[0096] 对比例1
[0097] 本对比例利用常规动物免疫方法制备异嗜性抗体阻断剂：
[0098] 利用抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。兔多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。具体实验步骤如下：
[0099] (1)兔子的准备
[0100] 挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只(约2.5Kg)，使其适应新的生活环境，稳定几天再进行首次取血。
[0101] a.预采血(作为阴性参照)。
[0102] b.将兔子小心的放入固定的架中，使兔子平静。
[0103] c.小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见。
[0104] d.用小棉球沾酒精涂抹血管部位，使血管膨胀。
[0105] e.用注射器从耳静脉抽取约10mL血液(约5mL血清)。
[0106] f.小心抽出针头，适当按压伤口以免流血，然后用酒精棉球消毒伤口。
[0107] g.将收集的血液置于37℃灭活30min，最后置于4℃过夜，使其凝结释放血清。
[0108] h.将凝结好的血液在12000r/min离心10min。
[0109] i.收集上清，即为血清。
[0110] (2)兔子的免疫
[0111] a.注射两只兔子的特殊抗原为1mL，特殊抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
[0112] b.将1mL的佛氏完全佐剂与准备好的1mL特殊抗原充分混匀，呈乳白色。
[0113] c.小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可)，每个部位250uL，针头呈45度角插入皮下1～2cm，注射完后停留数秒以防止特殊抗原外流。
[0114] d.免疫周期为20天，免疫完后7～10天取血(包括中途测试取血和最终放血)，总共免疫5～6次。
[0115] (3)效价检测
[0116] a.参照：阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液)；阳性参照为以前阳性血清。
[0117] b.于96孔板中每孔滴加100uL，1ug/mL特定抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2h。
[0118] c.倒掉抗原溶液，每孔加入200uL的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2h。
[0119] d.倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次，每次尽量拍干残留液体，若要放置一段时间，37℃烘干，并用封口袋封好于‑20℃存放。
[0120] e.取包被好的96孔板，第一孔加入阴性参照液100uL，第二孔加入阳性参照液100uL，第三孔加入1：500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1h。
[0121] f.倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100uL的HRP标记的小鼠抗兔IgG(1：2000稀释)，于37℃孵育45min。
[0122] g.倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100uL的TMB底物(Sigma单组份TMB)37℃孵育5～20min(根据颜色深浅来决定显色的时间)。
[0123] h.每孔加入50uL的终止液(2N H2SO4)，在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。
[0124] i.抗体效价检测达到1万以上后，对兔子进行终放血、抗体的纯化。
[0125] (4)抗体的亲和‑‑‑亲和柱的制备
[0126] a.称取1mg CNBr‑Sepherose 4B的琼脂糖凝胶加入2mmol/L的盐酸中，4℃过夜使其充分溶涨，可获得3mL溶涨胶。
[0127] b.将凝胶转移入纯化柱中，用约20mL、2mmol/L的盐酸洗介质3次。
[0128] c.用偶联缓冲液洗介质一次，因为活化基团在偶联缓冲液PH值下易水解，所以此步骤最好在几min内完成。
[0129] d.将溶解在5mL偶联缓冲液中的5～10mg的抗原加入凝胶中。
[0130] e.室温下轻轻混合摇动2～4h，或4℃过夜，如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。用20mL的偶联缓冲液洗介质一次。
[0131] f.加入15mL 1％ BSA溶液室温下孵育2h或4℃过夜。
[0132] g.用磷酸盐缓冲液洗涤介质3次以上，每次15mL以上。
[0133] h.抗原固相化完成，可用于纯化。
[0134] i.若不立即使用或者使用后，用20％的乙醇封存。
[0135] (5)抗血清的纯化和保存
[0136] a.抗血清用PBS等体积稀释，5000～10000r/min离心15min，取上清.
[0137] b.用10倍体积的PBS清洗抗原亲和柱以平衡柱子。
[0138] c.将稀释好的抗血清10mL加入平衡好的柱子中。
[0139] d.室温下轻轻混合摇动2～4h，或4℃过夜。
[0140] e.用10倍体积的PBS清洗抗原柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白。
[0141] f.用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到特异性抗体。
[0142] g.用10倍体积PBS平衡柱子。
[0143] h.用20％的酒精封存柱子，4℃保存。
[0144] i.在得到洗脱的抗体后，经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于PBS中透析除盐，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD值除以1.35为所测抗体的浓度，即为阻断剂的浓度，添加40～50％甘油，再加入proclin300，置于‑20℃可长期保存。
[0145] 对比例2
[0146] 本对比例利用杂交瘤细胞分泌具有特异性的单克隆抗体制备专用抗体阻断剂：
[0147] (1)通过杂交瘤技术获得杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞扩增培养至5×105个/mL，收集细胞后用无血清培养基重悬，接种到5L发酵罐中，补加无血清培养基至800mL；
[0148] (2)进入哺乳动物细胞发酵模式；24h后计数1.5×106个/mL，细胞活率90％，补加6
1000mL无血清培养基；48h后计数2.0×10个/mL，细胞活90％，补加1000mL无血清培养基；
6
72h后计数3.5×10 个/mL，细胞活率90％，补加2000mL无血清培养基、3g/L大豆水解物
6
200mL；96h后计数4.5×10个/mL，细胞活率70％，停止补料；
[0149] (3)待细胞活率降到40％，收集培养物离心去除细胞，得到发酵液；
[0150] (4)将发酵液用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到样品；将AKTA PURE开机UV冲至基线，调零，将Protein A纯化柱接入柱阀，使用PBS缓冲液平衡至电导参数及UV参数处于基线，将样品注入样品环；进样完毕后，使用PBS缓冲液平衡至电导参数及UV参数处于基线，接入洗脱液收集纯化产物，并立即用1M Tris缓冲液中和，得到纯化后的活性抗体；
[0151] (5)纯化后的活性抗体用规格为15mL、30K的超滤管换液浓缩，最终换液至PBS缓冲液中，在超净台内用孔径为0.22μm的滤膜进行无菌过滤，收集无菌过滤的滤液，取样进行SDS PAGE电泳验证其纯度，使用超微量分光光度计检测抗体浓度，获得包括活性抗体5mg/mL、KH2 PO4 2mM、NaCl 137mM、Na2HPO4 13mM、KCl 2.7mM的主动阻断剂，‑20℃保存。
[0152] 实验例
[0153] 本实验例用于验证本发明自研阻断剂4‑MR‑poly的应用效果。
[0154] 一、实验方法：
[0155] 设置一个对照组和六个实验组：
[0156] 对照组：R1试剂不添加任何阻断剂的试剂盒(以本发明实施例4试剂盒为例，去除其中的阻断剂)；
[0157] 实验组1：R1试剂添加“本发明自研4‑MR‑poly阻断剂抗体”的试剂盒(以本发明实施例4试剂盒为例)；
[0158] 实验组2：R1试剂添加“对比例1动物免疫产生阻断剂”的试剂盒(阻断剂以外的其他试剂组分同实验组1)；
[0159] 实验组3：R1试剂添加“对比例2杂交瘤细胞产生阻断剂”的试剂盒(阻断剂以外的其他试剂组分同实验组1)；
[0160] 实验组4：外购日本生研试剂(肌红蛋白测定试剂盒Mb‑CN：生化免疫检测试剂|Denka电化株式会社；规格：120ml；标准溯源：In‑house)”；
[0161] 实验组5：R1试剂添加“海源阻断剂R和M1(湖南海源医疗科技股份有限公司)”的试剂盒(阻断剂以外的其他试剂组分同实验组1)；
[0162] 实验组6：R1试剂添加“京达异嗜性抗体阻断剂(P‑异嗜性抗体阻断剂，南京京达生物技术有限公司，货号：HBR‑5)”的试剂盒(阻断剂以外的其他试剂组分同实验组1)。
[0163] 分别采用对照组和六个实验组试剂进行异常血清、心肌类朗道质控的测试，同时对对照组和实验组1试剂的定标结果和加速稳定性结果进行对比。
[0164] 二、实验结果：
[0165] 对照组和各实验组试剂的异常血清与心肌类朗道质控测试结果如表1～2所示。对照组和实验组1试剂的定标结果如表3所示，定标曲线如图1所示。加速稳定性结果如图2所示。
[0166] 表1异常血清测试结果(单位：ng/mL)
[0167]
[0168]
[0169] 表2心肌类朗道质控测试结果(单位：ng/mL)
[0170]
[0171]
[0172] 表3定标数据(单位：S1～S5(0～800)为ng/mL，其他为吸光度Abs)
[0173]
[0174] 以上结果表明：
[0175] (1)采用普通动物(兔)免疫产生的异嗜性抗体阻断剂和采购京达异嗜性抗体阻断剂阻断效果均较差，存在假阳的风险；
[0176] (2)利用杂交瘤细胞产生的单克隆抗体阻断剂和海源阻断剂M1、R阻断效果均较好，但杂交瘤细胞产生的单克隆抗体工艺复杂，且成本较高，海源阻断剂需要M1和R同时使用，成本也较高；
[0177] (3)本发明“试剂盒加自研4‑MR‑poly阻断剂抗体”和“日本生研试剂”测试结果接近，能很好阻断血清中的干扰物质。除此之外，在R1中加入自研4‑MR‑poly阻断剂抗体，不会对试剂的定标结果、朗道测试结果、加速稳定性产生影响。
[0178] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
