技术领域
[0001] 本发明涉及的是食品加工技术领域，具体涉及一种高乳化活性绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物及应用。
相关背景技术
[0002] 乳液是常见的食品体系，但是，乳液具有不稳定性，在储藏过程中易发生聚结、絮凝、连续相和液滴之间的重力分离等物理失稳现象。在行业中，多使用乳化剂以提高乳液的稳定性。目前，常用的乳化剂包括合成乳化剂(如Tween 20和Span 85)和天然乳化剂(如蛋白质和卵磷脂)。近年来，由于对某些合成乳化剂安全性的担忧日益增加，天然乳化剂受到越来越多的关注。绿豆蛋白酶解物具有较高的溶解性，具有比蛋白更短的氨基酸序列，并且比蛋白质暴露出更多的疏水残基，可以更快地吸附到界面上，形成更小的乳液液滴，可以改善食品(特别是乳化食品)的乳化效果。此外，乳液中的油相在加工与贮藏过程中易发生氧化，进一步引起相邻的蛋白质发生氧化，从而引起乳液食品质量急剧下降，因此抑制乳液中的脂质氧化是至关重要的。
[0003] 在食品工业生产中，多采用的2,6‑二叔丁基‑4‑甲基苯酚(butyl hydroxyl toluene,BHT)、丁基羟基茴香醚(butyl hydroxyl anisole,BHA)、叔丁基对苯二酚(tert‑butyl hydro quinone,TBHQ)和没食子酸丙酯(propyl gallate,PG)等合成抗氧化剂，抑制其脂质氧化反应的发生，达到防腐保鲜的效果，进而延长乳化食品的货架期。但是，近年来研究发现乳化食品中的水相也极易受到自由基攻击进而加快食品品质的劣变。
[0004] 因此，制作一种高乳化活性绿豆蛋白酶解物‑丁香酚的复配物，并将其应用到食品制作中，以拓宽其在食品工业中的应用，是本领域技术人员亟需解决的问题。
具体实施方式
[0031] 下面对本发明做进一步的说明：
[0032] 实施例1：
[0033] 这种高乳化活性绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物通过以下步骤制备：
[0034] 步骤一、制备绿豆蛋白酶解物，使用碱性蛋白酶进行限制性酶解，得到分子量为700Da的绿豆蛋白酶解物，然后对酶解物进行超声处理，超声功率200W，超声时间在5min，温度为25℃，间歇时间为5s/5s。
[0035] 步骤二、制备丁香酚溶液：
[0036] 取一定量的丁香酚溶于0.01mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲复合PBS，得到质量分数为5mg/mL的丁香酚溶液；
[0037] 步骤三、制备绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物：
[0038] 将绿豆蛋白酶解物与5mg/mL的丁香酚溶液置于转速为1000rpm搅拌机中以1：4的质量体积比进行混合搅拌2h，调节pH为7.0，再使用高压微射流均质机进行均质，功率为60MPa，处理次数3次，得到绿豆蛋白酶解物与丁香酚复配物，绿豆蛋白酶解物与丁香酚复配物由绿豆蛋白酶解物‑丁香酚结合体、绿豆蛋白酶解物、丁香酚构成，绿豆蛋白酶解物与丁香酚复配物中绿豆蛋白酶解物‑丁香酚结合体的质量百分比含量为28.47％；
[0039] 步骤四、将制备的绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物放置在‑80℃下冷冻干燥24h，得到绿豆蛋白酶降解物‑丁香酚复配物，在4℃下密封在不透气的铝箔袋中，以备使用。
[0040] 这种绿豆蛋白酶降解物‑丁香酚复配物用于制备肉丸
[0041] 这种绿豆蛋白酶降解物‑丁香酚复配物用于制备肉丸的方法：
[0042] 第一步：原料的预处理：
[0043] 选取猪后腿肉清洗后，剔除筋膜(瘦肉800g，肥肉20g)，将肉切成3×3×3的方块，放入冰箱冷冻3h。
[0044] 第二步：搅拌成肉糜：
[0045] 第一次搅拌：取冰箱里的猪肉放入搅拌机里，加入12％的冰水搅拌50s；第二次搅拌：将1％的盐、3.5％的味精、0.3％的胡椒粉、0.6％的十三香依次放入搅拌机里搅拌50s；第三次搅拌：用1％的冰水溶解0.3％的小苏打，放入搅拌机里继续搅拌30s；第四次搅拌：将绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物加入到搅拌机里，添加量为0.1％，搅拌时间为30s。基础配料以原料肉总质量计。
[0046] 第三步：挤丸成型、蒸煮
[0047] 搅拌后的肉糜手工挤丸，肉丸直径在4cm左右，放入到沸水中蒸煮15min左右。
[0048] 实施例2：
[0049] 这种高乳化活性绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物通过以下步骤制备：
[0050] 步骤一、制备绿豆蛋白酶解物，使用碱性蛋白酶进行限制性酶解，得到分子量为900Da的绿豆蛋白酶解物，然后对酶解物进行超声处理，超声功率400W，超声时间在15min，温度为25℃，间歇时间为5s/5s。
[0051] 步骤二、制备丁香酚溶液：
[0052] 取一定量的丁香酚溶于0.01mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲复合PBS，得到质量分数为5mg/mL的丁香酚溶液；
[0053] 步骤三、制备绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物：
[0054] 将绿豆蛋白酶解物与5mg/mL的丁香酚溶液置于转速为1000rpm搅拌机中以1：10的质量体积比进行混合搅拌2h，调节pH为7.0，再使用高压微射流均质机进行均质，功率为60MPa，处理次数3次，得到绿豆蛋白酶解物与丁香酚复配物，绿豆蛋白酶解物与丁香酚复配物由绿豆蛋白酶解物‑丁香酚结合体、绿豆蛋白酶解物、丁香酚构成，绿豆蛋白酶解物与丁香酚复配物中绿豆蛋白酶解物‑丁香酚结合体的质量百分比含量为35.46％；
[0055] 步骤四、将制备的绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物放置在‑80℃下冷冻干燥24h，得到绿豆蛋白酶降解物‑丁香酚复配物，在4℃下密封在不透气的铝箔袋中，以备使用。
[0056] 这种绿豆蛋白酶降解物‑丁香酚复配物用于制备肉丸
[0057] 这种绿豆蛋白酶降解物‑丁香酚复配物用于制备肉丸的方法：
[0058] 第一步：原料的预处理：
[0059] 选取猪后腿肉清洗后，剔除筋膜(瘦肉800g，肥肉20g)，将肉切成3×3×3的方块，放入冰箱冷冻3h。
[0060] 第二步：搅拌成肉糜：
[0061] 第一次搅拌：取冰箱里的猪肉放入搅拌机里，加入12％的冰水搅拌50s；第二次搅拌：将1％的盐、3.5％的味精、0.3％的胡椒粉、0.6％的十三香依次放入搅拌机里搅拌50s；第三次搅拌：用1％的冰水溶解0.3％的小苏打，放入搅拌机里继续搅拌30s；第四次搅拌：将绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物加入到搅拌机里，添加量为0.5％，搅拌时间为30s。基础配料以原料肉总质量计。
[0062] 第三步：挤丸成型、蒸煮
[0063] 搅拌后的肉糜手工挤丸，肉丸直径在4cm左右，放入到沸水中蒸煮15min左右。
[0064] 实施例3：
[0065] 这种高乳化活性绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物通过以下步骤制备：
[0066] 步骤一、制备绿豆蛋白酶解物，使用碱性蛋白酶进行限制性酶解，得到分子量为1200Da的绿豆蛋白酶解物，然后对酶解物进行超声处理，超声功率500W，超声时间在25min，温度为25℃，间歇时间为5s/5s。
[0067] 步骤二、制备丁香酚溶液：
[0068] 取一定量的丁香酚溶于0.01mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲复合PBS，得到质量分数为5mg/mL的丁香酚溶液；
[0069] 步骤三、制备绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物：
[0070] 将绿豆蛋白酶解物与5mg/mL的丁香酚溶液置于转速为1000rpm搅拌机中以1：12的质量体积比进行混合搅拌2h，调节pH为7.0，再使用高压微射流均质机进行均质，功率为60MPa，处理次数3次，得到绿豆蛋白酶解物与丁香酚复配物，绿豆蛋白酶解物与丁香酚复配物由绿豆蛋白酶解物‑丁香酚结合体、绿豆蛋白酶解物、丁香酚构成，绿豆蛋白酶解物与丁香酚复配物中绿豆蛋白酶解物‑丁香酚结合体的质量百分比含量为42.92％；
[0071] 步骤四、将制备的绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物放置在‑80℃下冷冻干燥24h，得到绿豆蛋白酶降解物‑丁香酚复配物，在4℃下密封在不透气的铝箔袋中，以备使用。
[0072] 这种绿豆蛋白酶降解物‑丁香酚复配物用于制备肉丸
[0073] 这种绿豆蛋白酶降解物‑丁香酚复配物用于制备肉丸的方法：
[0074] 第一步：原料的预处理：
[0075] 选取猪后腿肉清洗后，剔除筋膜(瘦肉800g，肥肉20g)，将肉切成3×3×3的方块，放入冰箱冷冻3h。
[0076] 第二步：搅拌成肉糜：
[0077] 第一次搅拌：取冰箱里的猪肉放入搅拌机里，加入12％的冰水搅拌50s；第二次搅拌：将1％的盐、3.5％的味精、0.3％的胡椒粉、0.6％的十三香依次放入搅拌机里搅拌50s；第三次搅拌：用1％的冰水溶解0.3％的小苏打，放入搅拌机里继续搅拌30s；第四次搅拌：将绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物加入到搅拌机里，添加量为0.9％，搅拌时间为30s。基础配料以原料肉总质量计。
[0078] 第三步：挤丸成型、蒸煮
[0079] 搅拌后的肉糜手工挤丸，肉丸直径在4cm左右，放入到沸水中蒸煮15min左右。
[0080] 实施例4：
[0081] 这种高乳化活性绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物通过以下步骤制备：
[0082] 步骤一、制备绿豆蛋白酶解物，使用碱性蛋白酶进行限制性酶解，得到分子量为800Da的绿豆蛋白酶解物，然后对酶解物进行超声处理，超声功率600W，超声时间在25min，温度为25℃，间歇时间为5s/5s。
[0083] 步骤二、制备丁香酚溶液：
[0084] 取一定量的丁香酚溶于0.01mol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲复合PBS，得到质量分数为5mg/mL的丁香酚溶液；
[0085] 步骤三、制备绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物：
[0086] 将绿豆蛋白酶解物与5mg/mL的丁香酚溶液置于转速为1000rpm搅拌机中以1：8的质量体积比进行混合搅拌2h，调节pH为7.0，再使用高压微射流均质机进行均质，功率为60MPa，处理次数3次，得到绿豆蛋白酶解物与丁香酚复配物，绿豆蛋白酶解物与丁香酚复配物由绿豆蛋白酶解物‑丁香酚结合体、绿豆蛋白酶解物、丁香酚构成，绿豆蛋白酶解物与丁香酚复配物中绿豆蛋白酶解物‑丁香酚结合体的质量百分比含量为30.86％；
[0087] 步骤四、将制备的绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物放置在‑80℃下冷冻干燥24h，得到绿豆蛋白酶降解物‑丁香酚复配物，在4℃下密封在不透气的铝箔袋中，以备使用。
[0088] 这种绿豆蛋白酶降解物‑丁香酚复配物用于制备肉丸
[0089] 这种绿豆蛋白酶降解物‑丁香酚复配物用于制备肉丸的方法：
[0090] 第一步：原料的预处理：
[0091] 选取猪后腿肉清洗后，剔除筋膜(瘦肉800g，肥肉20g)，将肉切成3×3×3的方块，放入冰箱冷冻3h。
[0092] 第二步：搅拌成肉糜：
[0093] 第一次搅拌：取冰箱里的猪肉放入搅拌机里，加入12％的冰水搅拌50s；第二次搅拌：将1％的盐、3.5％的味精、0.3％的胡椒粉、0.6％的十三香依次放入搅拌机里搅拌50s；第三次搅拌：用1％的冰水溶解0.3％的小苏打，放入搅拌机里继续搅拌30s；第四次搅拌：将绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物加入到搅拌机里，添加量分为1.3％，搅拌时间为30s。基础配料以原料肉总质量计。
[0094] 第三步：挤丸成型、蒸煮
[0095] 搅拌后的肉糜手工挤丸，肉丸直径在4cm左右，放入到沸水中蒸煮15min左右。
[0096] 为了证明本发明，进行了验证实验：
[0097] 1.实验设计
[0098] (1)以分子量为1200～700Da的绿豆蛋白酶解物为对照组，对酶解物进行超声处理，超声功率为400W，超声时间为15min，温度为25℃，间歇时间为5s/5s。
[0099] (2)将丁香酚配置成5mg/mL的溶液，以绿豆蛋白酶解物分子量(2800‑2300、2300‑1700、1700‑1200、1200～700Da)为因变量，将绿豆蛋白酶解物与丁香酚按1：12(w/v)的比例复配，确定最适的绿豆蛋白酶解物分子量。
[0100] (3)确定绿豆蛋白酶解物分子量后，将绿豆蛋白酶解物与丁香酚分别以1：4、1：8、1：10、1：12的比例复配，进行乳化活性和抗氧化活性的测定。
[0101] (4)以实验设计(3)筛选出的最佳条件比例制备绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物，放置在‑80℃冷冻干燥24h，应用到肉丸时，添加量以原料肉总量(1kg)计，分别为肉总量的0.1％、0.5％、0.9％、1.3％。
[0102] 2.实验方法
[0103] 2.1乳化活性的测定
[0104] 采用高速分散均质机将大豆油与绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物按1：9的比例进行均质，转速为10000r/min，均质时间为3min。均质后取距离心管底部0.5cm处的乳状液100μL，用0.1％的SDS复合物稀释50倍，振荡混匀后测吸光度(500nm)记为A0。将混合液静置20min后，在上述相同位置处取100μL样液，后续操作同上，测定吸光度记为A1；乳化性和乳化稳定性计算公式如下：
[0105] 2.2结合率的测定
[0106] 采用Folin‑Ciocalteu法分析复配物的结合率，使用0.01mol/L，pH 7.4的磷酸盐缓冲液将冻干后的绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物粉末配置成1mg/mL的样品溶液。取0.5mL样品与2.5mL的0.2g/L Folin‑Ciocalteu’s phenol试剂混合，反应5min，然后加入2mL Na2CO3(0.075g/mL)到溶液中。在黑暗中反应2h。在760nm处测量样品的吸光度。配制不同浓度的丁香酚标准溶液，绘制标准曲线。最后根据曲线得到样品中丁香酚的含量，通过丁香酚的含量计算绿豆蛋白酶解物‑丁香酚结合体的含量，结合率(BR)的计算公式为：
[0107]
[0108] 式中：m0、m1分别为透析前后样品中丁香酚的含量(g)，m1为样品中丁香酚的含量(g)；m0为透析前反应物中丁香酚含量(g)。
[0109] 2.3DPPH自由基清除率的测定
[0110] 采用0.01mol/L，pH 7.4的磷酸盐缓冲液将冻干后的绿豆蛋白酶解物与绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物粉末配置成1mg/mL的样品溶液，与DPPH乙醇溶液按1：1的比例混合,于室温条件下避光反应30min，在517nm处测定样品吸光度A；(以磷酸盐缓冲液作为空白对照组)DPPH自由基清除率计算公式为：
[0111]
[0112] 式中：A‑‑‑样品溶液吸光度；A0‑‑‑对照组的吸光度。
[0113] 2.4ABTS自由基清除率的测定
[0114] 在室温避光条件下，将7.35mmol/L过硫酸钾溶液与7mmol/L ABTS溶液以1:2的比例混合，并放置16小时，得到ABTS自由基储备液。使用前，用0.2mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲液将ABTS自由基储备液稀释至734nm处吸光值为0.70±0.02。采用0.01mol/L，pH 7.4的磷酸盐缓冲液将冻干后的绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物粉末配置成1mg/mL的样品溶液，与ABTS自由基储备液按1：4的比例混合，于室温条件下避光反应10min，在734nm测定吸光度值；(以磷酸盐缓冲溶液作为空白对照组)ABTS自由基清除能力的计算公式为：
[0115]
[0116] 式中：A‑‑‑样品溶液吸光度；A0‑‑‑空白对照组的吸光度。
[0117] 2.5TBARs的测定
[0118] 配置0.12mol/L氯化钾和5mmol/L组氨酸缓冲液定容至500mL，然后转移至烧杯中调pH至6.8，称取5g大豆卵磷脂分散在其中，在4℃下超声40分钟，得到脂质体悬浊液。采用0.01mol/L，pH 7.4的磷酸盐缓冲液将冻干后的绿豆蛋酶解物粉末配置成1mg/mL的样品溶液，与脂质体悬浊液按1：4的比例混合至5mL，脂质体氧化由0.1mL100μmol/L FeCl3溶液和
0.1mL 2mmol/L抗坏血酸溶液引发，并37℃下保温1小时。反应完成后取上述液体0.5mL加入
1.5mL1％硫代巴比妥酸溶液和8.5mL2.8％三氯乙酸溶液，沸水浴30分钟。冷却至室温后加入5mL氯仿去除脂类的影响，在532nm处读取吸光度值。TBARs的计算公式为：
[0119]
[0120] 式中：A532‑‑‑样品组在532nm的吸光值；Vs‑‑‑待测样品的体积(1mL)；9.48‑‑‑由摩‑1 ‑1尔消光系数(152000M cm )转换而得。
[0121] 2.6扫描电镜的测定
[0122] 将冻干样品均匀地铺在双面导电胶带的样品台上，涂上一层金，电子枪加速电压为15.0kV，在2000倍下观察样品的结构变化，并用计算机捕获图像。
[0123] 2.7肉丸乳化稳定性的测定
[0124] 称取适量猪肉糜(M1)在50mL离心管(M0)中，以5000×g离心5min，后加盖密封，在70℃恒温水浴中加热30min，加热结束将离心管取出倒扣在已称重的称量瓶(M2)上，静置3h，称量离心管和猪肉糜总重量(M3)，将称量瓶和收集到的液体于105℃加热3h，加热结束取出称重(M4)，按以下公式计算：
[0125] 3.结果：
[0126] 由图1(a)(b)可知，与绿豆蛋白和绿豆蛋白酶解产物相比，超声处理的绿豆蛋白酶解物DPPH自由基清除能力显著提高，TBARs值显著降低，也就是抗氧化能力显著增加，这可能是因为超声处理产生的剪切力，使酶解物暴露出更多的具有抗氧化的小分子肽或疏水氨基酸，从而增强了其抗氧化能力。图1(c)扫描电镜可以看出，绿豆蛋白是一种具有光滑表面的不规则球形结构，单一酶解处理得到的绿豆蛋白酶解产物表面出现凌乱、不均匀、光滑的颗粒状结构，超声处理酶解液组得到的产物颗粒状更小，并出现多孔结构，这可能是超声处理会产生高剪切力和湍流效应，疏水性氨基酸逐渐暴露，大分子的肽分裂释放出更小的肽，这与抗氧化能力提高的结果一致。因此，选择超声处理绿豆蛋白酶解物溶液进行下一步实验。
[0127] 由图2可知，不同程度绿豆蛋白酶解产物与丁香酚复配物的乳化活性显著不同，高分子量的绿豆蛋白酶解物(1700‑2800Da)‑丁香酚复合物乳化活性与绿豆蛋白相比，乳化活性差异不显著；而低分子量的绿豆蛋白酶解物(700‑1200Da)‑丁香酚复配物的乳化活性最强，因为，酶解物相对分子量小可以与丁香酚形成更多的绿豆蛋白酶解产物与丁香酚结合体，在油水界面形成高黏弹性的保护膜。而低分子量的绿豆蛋白酶解物(700‑1200Da)‑丁香酚复配物的抗氧化活性也最强，因此选择分子量在700‑1200Da的绿豆蛋白酶解物进行下一步实验。
[0128] 表1
[0129]
[0130] 由表1可知，随着比例的增加，绿豆蛋白酶降解物‑丁香酚的结合率逐渐提高，图3(a)乳液的乳化程度也逐渐升高，与图3(b)乳化活性的结果一致，当比例为1：12时，乳化稳定性也最高，这是因为绿豆蛋白酶解产物与丁香酚结合体的提高可以增强乳化活性。而由图3(d)(e)可知，DPPH自由基和ABTS自由基清除率随丁香酚浓度的增加而增加。
[0131] 根据以上实验结果，制备最佳比例的的绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物，放置在‑80℃下冷冻干燥24h，应用到肉丸中。由图4(a)(b)可知，随着添加比例增多，水分渗出率和脂肪渗出率降低，说明绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物可以明显的改变肉丸的乳化特性，并改变肉丸的品质。
[0132] 综上所述，本发明提供了一种高乳化活性绿豆蛋白酶解物‑丁香酚复配物的制作方法，并将其以不同的比例添加到肉丸中，改善了肉丸的乳化特性。
