[0001] 本发明涉及硒肥技术领域，具体涉及一种硒肽、硒肽有机肥及其制备方法和应用。

[0002] 硒是植物生长发育过程中一种必不可少的微量元素，具有促进植物生长、改善果实品质、增强植物抗氧化功能、参与植物蛋白质代谢、对抗重金属和环境胁迫等作用。传统硒肥一般是指从金属矿藏的副产物中提取而来的无机硒；无机硒有较大的毒性，且不易吸收，不适合作为肥料；小分子硒肽肥作为有机硒肥的一种，其毒性弱，施用便捷，而且能高效补充作物所需的硒元素，近年来受到了广泛关注。

[0003] 硒肽作为生物活性肽的重要组成部分，不仅能促进作物生长，更是优质的硒补充剂，由于我国硒资源分配不均及生产技术的限制，目前硒肽主要从富硒植物中获取。小分子硒肽是指通过特定方式破坏硒肽所形成的肽片段，具有分子量小，容易被作物吸收利用的特点。目前小分子硒肽常用的制备方法为酶解法、硒化修饰法和化学合成法。酶解法存在效率低、纯化难度大、及酶解产物复杂等问题；硒化修饰法虽操作简便，但制备效率较低，无法满足工业生产需求；化学合成法具有成本低、适用范围广、保护基种类多等优势，但存在操作难度大及产品分离复杂等问题。如何提高制备硒肽的效率和提高硒肽有机肥的质量是现有技术需要解决的技术问题。

[0022] 本申请所公开的“范围”以下限和上限的形式来限定，给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的，选定的下限和上限限定了特别范围的边界。这种方式进行限定的范围可以是包括端值或不包括端值的，并且可以进行任意地组合，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，如果针对特定参数列出了60～120和80～110的范围，理解为60～110和80～120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1～3、1～4、1～5、2～3、2～4和2～5。在本申请中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0～5”表示本文中已经全部列出了“0～5”之间的全部实数，“0～5”只是这些数值组合的缩略表示。另外，当表述某个参数为≥2的整数，则相当于公开了该参数为例如整数2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12等。

[0023] 如果没有特别的说明，本申请所提到的“包括”和“包含”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”和“包含”可以表示还可以包括或包含没有列出的其他组分，也可以仅包括或包含列出的组分。

[0024] 如果没有特别的说明，在本申请中，术语“或”是包括性的。举例来说，短语“A或B”表示“A，B，或A和B两者”。更具体地，以下任一条件均满足条件“A或B”：A为真(或存在)并且B为假(或不存在)；A为假(或不存在)而B为真(或存在)；或A和B都为真(或存在)。

[0025] 本具体实施方式提供了一种硒肽的制备方法，包括以下步骤：

[0026] S0、将富硒大豆晒干、粉碎过筛、脱脂离心后得到脱脂富硒大豆；富硒大豆的脱脂包括：将离心粉碎过筛后的富硒大豆加入丙酮进行脱脂，再进行离心得到所述脱脂富硒大豆；所述丙酮与所述大豆的质量比为(10‑12):1；

[0027] S1、将脱脂富硒大豆进行浸泡和打浆得到浆液，以所得浆液进行离心得到上清液；调节所述上清液的pH至4‑4.5得到硒蛋白；

[0028] S2、将硒蛋白与水混合得到硒蛋白溶液，之后加入枯草芽孢杆菌蛋白酶和碱性蛋白酶进行水解得到硒肽；所述枯草芽孢杆菌蛋白酶和所述碱性蛋白酶的质量比为1:(1.2‑1.6)；

[0029] S3、将得到的所述硒肽进行超声处理；所述超声处理的超声功率为450‑500W，超声频率为25‑30kHz，超声温度为40‑45℃，超声时间为40‑50min。超声处理后的硒肽，分子量变小从而更容易被作物吸收，从而更好地促进作物生长，提高作物产量。

[0030] 本具体实施方式还提出一种硒肽，由上述制备方法制备得到。

[0031] 本具体实施方式还提出上述制备方法制得的硒肽或者上述硒肽在制备硒肽有机肥中的应用。

[0032] 本具体实施方式还提出一种硒肽有机肥，包括水25‑28份、氨基酸22‑24份、尿素15‑17份、磷酸二氢钾18‑20份、山梨糖醇5‑7份、矿源黄腐酸钾5‑7份、七水硫酸锌1‑2份、乙二胺四乙酸铁钠1‑2份、硫酸锰1‑2份、硼酸1‑2份、四水硝酸钙1‑2份和上述硒肽2‑4份。

[0033] 本具体实施方式还提出一种上述硒肽有机肥的制备方法，包括以下步骤：将水、氨基酸、尿素、磷酸二氢钾、山梨糖醇、矿源黄腐酸钾、七水硫酸锌、乙二胺四乙酸铁钠、硫酸锰、硼酸和四水硝酸钙混合并加热至55‑60℃以转速400‑450r/min螯合30‑35min，之后添加硒肽继续搅拌得到所述硒肽有机肥。

[0034] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0035] 在本发明中，涉及到“一些实施例”、“本实施例”以及举例等等，其描述了所有可能实施例的子集，但是可以理解，“一些实施例”可以是所有可能实施例的相同子集或不同子集，并且可以在不冲突的情况下相互结合。

[0036] 如果申请文件中出现“第一/第二”的类似描述则增加以下的说明，在以下的描述中，所涉及的术语“第一\第二\第三”仅仅是是区别类似的对象，不代表针对对象的特定排序，可以理解地，“第一\第二\第三”在允许的情况下可以互换特定的顺序或先后次序，以使这里描述的实施例能够以除了在这里图示或描述的以外的顺序实施。

[0037] 本实施例中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如对象A和/或对象B，可以表示：单独存在对象A，同时存在对象A和对象B，单独存在对象B这三种情况。

[0038] 以下，说明本申请的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0039] 实施例1

[0040] 本实施例提出一种硒肽的制备方法，包括如下步骤：

[0041] S0、预处理：取富硒大豆自然晒干、粉碎过筛、脱脂离心后得到脱脂富硒大豆；脱脂富硒大豆按照以下方法进行制备：将富硒大豆自然晒干后进行粉碎过40目筛，先加入丙酮进行脱脂，再进行离心，其中丙酮与大豆的质量比为10:1，离心转速为7500rpm，离心时间8min；离心所得沉淀即为脱脂富硒大豆；

[0042] S1、取脱脂富硒大豆进行浸泡和打浆得到浆液，以所得浆液进行离心，其中离心转速为11000rpm，离心时间为5min；收集离心上清液并加入体积浓度为12％盐酸调节pH至4.5，得到硒蛋白，所得沉淀则继续加水溶解后，重复脱脂离心步骤；

[0043] S2、将硒蛋白加水配制成硒蛋白溶液，加入质量比例为1:1.4的枯草芽孢杆菌蛋白酶和碱性蛋白酶进行水解1h，水解结束后得到硒肽溶液并将酶用盐析法进行分离纯化，以备下次使用。底部少量乳化物加入水中，重复离心过滤步骤；

[0044] S3、将步骤S2得到的硒肽溶液进行超声处理，得到含小分子硒肽的硒肽溶液，其中超声功率为450W，超声频率为25kHz，超声温度为40℃，超声50min，硒肽溶液浓度为5mg/kg；

[0045] 本实施例还提出一种硒肽有机肥，按照重量份数计算，包括水25份、氨基酸22份、尿素17份、磷酸二氢钾18份、山梨糖醇7份、矿源黄腐酸钾7份、七水硫酸锌1份、乙二胺四乙酸铁钠1份、硫酸锰1份、硼酸1份、四水硝酸钙1份和硒肽溶液3份。

[0046] 本实施例还提出上述硒肽有机肥的制备方法，包括将水、氨基酸、尿素、磷酸二氢钾、山梨糖醇、矿源黄腐酸钾、七水硫酸锌、乙二胺四乙酸铁钠、硫酸锰、硼酸、四水硝酸钙依次加入到反应釜中加热至60℃，以转速400r/min螯合30min，之后将硒肽溶液加入反应釜中进行搅拌得到硒肽有机肥。

[0047] 实施例2

[0048] 本实施例提出一种硒肽的制备方法，包括如下步骤：

[0049] S0、预处理：取富硒大豆自然晒干、粉碎过筛、脱脂离心后得到脱脂富硒大豆；脱脂富硒大豆按照以下方法进行制备：将富硒大豆自然晒干后进行粉碎过40目筛，先加入丙酮进行脱脂，再进行离心，其中丙酮与大豆的质量比为11:1，离心转速为8000rpm，离心时间为7min；离心所得沉淀即为脱脂富硒大豆；

[0050] S1、取脱脂富硒大豆进行浸泡和打浆得到浆液，以所得浆液进行离心，其中离心转速为11000rpm，离心时间为5min；收集离心上清液并加入体积浓度为11％盐酸调节pH至4.4，得到硒蛋白，所得沉淀则继续加水溶解后，重复脱脂离心步骤；

[0051] S2、将硒蛋白加水配制成硒蛋白溶液，加入质量比例为1:1.5的枯草芽孢杆菌蛋白酶和碱性蛋白酶进行水解1h，水解结束后得到硒肽溶液并将酶用盐析法进行分离纯化，以备下次使用。底部少量乳化物加入水中，重复离心过滤步骤；

[0052] S3、将步骤S2得到的硒肽溶液进行超声处理，得到小分子硒肽，其中超声功率为500W，超声频率为30kHz，超声温度为40℃，超声45min，硒肽溶液浓度为5mg/kg。

[0053] 本实施例还提出一种硒肽有机肥，按照重量份数计算，包括水25份、氨基酸22份、尿素17份、磷酸二氢钾18份、山梨糖醇7份、矿源黄腐酸钾7份、七水硫酸锌1份、乙二胺四乙酸铁钠1份、硫酸锰1份、硼酸1份、四水硝酸钙1份和硒肽3份。

[0054] 本实施例还提出上述硒肽有机肥的制备方法，包括将水、氨基酸、尿素、磷酸二氢钾、山梨糖醇、矿源黄腐酸钾、七水硫酸锌、乙二胺四乙酸铁钠、硫酸锰、硼酸、四水硝酸钙依次加入到反应釜中加热至60℃，以转速400r/min螯合30min，之后将硒肽加入反应釜中进行搅拌得到硒肽有机肥。

[0055] 实施例3

[0056] 本实施例提出一种硒肽的制备方法，包括如下步骤：

[0057] S0、预处理：取富硒大豆自然晒干、粉碎过筛、脱脂离心后得到脱脂富硒大豆；脱脂富硒大豆按照以下方法进行制备：将富硒大豆自然晒干后进行粉碎过40目筛，先加入丙酮进行脱脂，再进行离心，其中丙酮与大豆的质量比为10:1，离心转速为8000rpm，离心时间为7min；离心所得沉淀即为脱脂富硒大豆。

[0058] S1、取脱脂富硒大豆进行浸泡和打浆得到浆液，以所得浆液进行离心，其中离心转速为11000rpm，离心时间为5min；收集离心上清液并加入体积浓度为11％盐酸调节pH至4，得到硒蛋白，所得沉淀则继续加水溶解后，重复脱脂离心步骤；

[0059] S2、将硒蛋白加水配制成硒蛋白溶液，加入质量比例为1:1.2的枯草芽孢杆菌蛋白酶和碱性蛋白酶进行水解1.5h，水解结束后得到硒肽溶液并将酶用盐析法进行分离纯化，以备下次使用。底部少量乳化物加入水中，重复离心过滤步骤；

[0060] S3、将步骤S2得到的硒肽溶液进行超声处理，得到小分子硒肽，其中超声功率为480W，超声频率为27kHz，超声温度为40℃，超声50min，硒肽溶液浓度为5mg/kg。

[0061] 本实施例还提出一种硒肽有机肥，按照重量份数计算，包括水28份、氨基酸23份、尿素15份、磷酸二氢钾20份、山梨糖醇5份、矿源黄腐酸钾6份、七水硫酸锌2份、乙二胺四乙酸铁钠1份、硫酸锰2份、硼酸2份、四水硝酸钙2份和硒肽4份。

[0062] 本实施例还提出上述硒肽有机肥的制备方法，包括将水、氨基酸、尿素、磷酸二氢钾、山梨糖醇、矿源黄腐酸钾、七水硫酸锌、乙二胺四乙酸铁钠、硫酸锰、硼酸、四水硝酸钙依次加入到反应釜中加热至55℃，以转速450r/min螯合35min，之后将硒肽加入反应釜中进行搅拌得到硒肽有机肥。

[0063] 实施例4

[0064] 本实施例提出一种硒肽的制备方法，包括如下步骤：

[0065] S0、预处理：取富硒大豆自然晒干、粉碎过筛、脱脂离心后得到脱脂富硒大豆；脱脂富硒大豆按照以下方法进行制备：将富硒大豆自然晒干后进行粉碎过40目筛，先加入丙酮进行脱脂，再进行离心，其中丙酮与大豆的质量比为10:1，离心转速为8000rpm，离心时间为7min；离心所得沉淀即为脱脂富硒大豆。

[0066] S1、取脱脂富硒大豆进行浸泡和打浆得到浆液，以所得浆液进行离心，其中离心转速为11000rpm，离心时间为5min；收集离心上清液并加入体积浓度为11％盐酸调节pH至4，得到硒蛋白，所得沉淀则继续加水溶解后，重复脱脂离心步骤；

[0067] S2、将硒蛋白加水配制成硒蛋白溶液，加入质量比例为1:1.6的枯草芽孢杆菌蛋白酶和碱性蛋白酶进行水解1h，水解结束后得到硒肽溶液并将酶用盐析法进行分离纯化，以备下次使用。底部少量乳化物加入水中，重复离心过滤步骤；

[0068] S3、将步骤S2得到的硒肽溶液进行超声处理，得到小分子硒肽，其中超声功率为500W，超声频率为30kHz，超声温度为45℃，超声45min，硒肽溶液浓度为5mg/kg。

[0069] 本实施例还提出一种硒肽有机肥，按照重量份数计算，包括水27份、氨基酸22份、尿素16份、磷酸二氢钾19份、山梨糖醇6份、矿源黄腐酸钾7份、七水硫酸锌1份、乙二胺四乙酸铁钠2份、硫酸锰1份、硼酸2份、四水硝酸钙1份和硒肽3份。

[0070] 本实施例还提出上述硒肽有机肥的制备方法，包括将水、氨基酸、尿素、磷酸二氢钾、山梨糖醇、矿源黄腐酸钾、七水硫酸锌、乙二胺四乙酸铁钠、硫酸锰、硼酸、四水硝酸钙依次加入到反应釜中加热至60℃，以转速480r/min螯合32min，之后将硒肽加入反应釜中进行搅拌得到硒肽有机肥。

[0071] 对比例1

[0072] 本实施例与实施例1的区别在于，在硒肽的制备方法中，没有进行超声处理，其他的制备步骤与实施例1相同。

[0073] 对比例2

[0074] 本对比例与实施例1相比，硒肽的制备方法中，在步骤S2中只采用枯草芽孢杆菌蛋白酶进行酶促水解，而没有采用碱性蛋白酶进行水解，本对比例中枯草芽孢杆菌蛋白酶的用量为实施例1中枯草芽孢杆菌蛋白酶和碱性蛋白酶的质量和；其他步骤与实施例1相同。

[0075] 对比例3

[0076] 本对比例与实施例1相比，硒肽的制备方法中，在步骤S2中只采用碱性蛋白酶进行酶促水解，而没有采用枯草芽孢杆菌蛋白酶进行水解，本对比例中碱性蛋白酶的用量为实施例1中枯草芽孢杆菌蛋白酶和碱性蛋白酶的质量和；其他步骤与实施例1相同。

[0077] 需要说明的是，本发明中小分子硒肽是指粒径在700nm以下的硒肽。

[0078] 表1不同实施例和对比例的硒肽含量及平均粒径

[0079]

[0080] 结合表1和图1‑4，可以得知本发明实施例1‑2制得的硒肽中小分子硒肽含量≥80％，粒径在500‑700nm，平均粒径不到600nm；对比例1‑3的小分子硒肽含量较低，且平均粒径较大。

[0081] 本发明实施例3‑4制得的硒肽中小分子硒肽含量、粒径均与实施例1‑2相当。

[0082] 此外，本专利还开展营养液培试验，试验作物为生菜。将不同处理组稀释500倍后得到营养液，将生菜根系直接浸润于营养液中，待成熟后测量其平均叶长、叶宽及根长。

[0083] 表2施用不同处理组对生菜平均叶长、叶宽及根长的影响

[0084] 处理组 平均叶长/cm 平均叶宽/cm 平均根长/cm实施例1 16.41 9.28 11.5
实施例2 16.52 8.93 11.7
对比例1 12.35 5.17 7.02
对比例2 12.82 6.00 8.21
对比例3 11.06 5.60 7.31

[0085] 根据表2可以得知本发明施用实施例1和2的生菜的平均叶长、平均叶宽和平均根长均高于对比例，即实施例1和2所得的硒肽有机肥能更好地促进作物生长。

[0086] 其他有益效果：

[0087] 1)本发明不仅创制了酶解加超声协同处理硒肽的新方法，同时提供了一种小分子硒肽的整套制备工艺。与传统工艺对比，该制备工艺采用酶解与超声处理协同处理的方式制备小分子硒肽，该工艺简单高效，所得产品得率≥80％，制备效率高，能满足工业化的需求。

[0088] 2)小分子硒肽在克服了传统无机硒毒性高缺点的同时，与硒肽相比，其分子量小从而更容易被作物吸收，从而更好地促进作物生长，提高作物产量。同时，本发明也在新工艺流程下提供了一种小分子硒肽有机肥配方。

[0089] 本发明的小分子硒肽有机肥配方中营养成分全面，能够有效代替化肥，补充土壤硒含量，提高土壤肥力，具有广阔的市场前景。

[0090] 本发明以提高制备效率和提高产品质量为问题核心，通过创制新的方法将物理形式和生物形式有机组合在一起，从而形成了一套以高效制备小分子硒肽为目的制备工艺。

[0091] 以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。