[0001] 本发明属于微生物制药领域，涉及一种含有(‑)‑α‑红没药醇合酶突变体的酵母工程菌及其应用。

[0002] (‑)‑α‑红没药醇((‑)‑α‑Bisabolol)，是一种从洋甘菊中分离提取的单环倍半萜醇，分子式为C15H26O。(‑)‑α‑红没药醇通过诱导细胞周期停滞、线粒体死亡和抑制PI3K/Akt信号通路，对A549 NSCLC细胞产生抗癌作用，因此具有抗癌活性。(‑)‑α‑红没药醇具有较低的生理毒性，还具有抗炎、杀菌、抗菌、皮肤舒缓和保湿的特性，已被用于药品和化妆品中。此外，(‑)‑α‑红没药醇因其镇痛功能可能应用于临床。综上，(‑)‑α‑红没药醇具有良好的应用价值和市场前景。

[0003] 天然的(‑)‑α‑红没药醇主要是从洋甘菊中提取，通过有机试剂萃取、多次减压蒸馏等提取手段制备，其提取过程比较复杂和繁琐。此外，植物提取的产量也比较低，周期较长。近年来，随着合成生物学技术的发展，已有研究采用微生物细胞工厂异源生物合成(‑)‑α‑红没药醇，该方法能够提高效率、降低成本、打破自然条件限制，从而有效缓解榄香烯的供需矛盾。

[0004] 目前生物合成(‑)‑α‑红没药醇主要是表达(‑)‑α‑红没药醇合酶来生成(‑)‑α‑红没药醇。此外已经有在大肠杆菌和酿酒酵母中报道相关的合成基因，这为异源合成(‑)‑α‑红没药醇奠定了良好的基础。毕赤酵母作为公认的生物安全菌株，其生长速度快，环境耐受性高，发酵条件简单，而且其表达蛋白的能力强，因此毕赤酵母有望作为理想的宿主来合成萜类产物。目前暂未有利用毕赤酵母生产(‑)‑α‑红没药醇的相关报道。

[0028] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

[0029] 下述实施例中，采用的辅助质粒IntX pTEFtAOX1、IntX pGAPt0547、HZP‑sgRNA、HHP‑sgRNA和HGP‑sgRNA均由公司合成。IntX pTEF tAOX1、IntX pGAPt0547主要是氨苄霉素抗性基因表达盒、复制子、pTEFtAOX1或pGAP tAOX1以及插入位点上下游300‑500bp同源臂组成，其中IntX是指插入到毕赤酵母GS115基因组上的位置。而辅助质粒HZP‑sgRNA、HHP‑sgRNA和HGP‑sgRNA主要是由通用骨架、抗性基因表达盒、位点对应的sgRNA以及BsaI酶切位点组成，Z、H、G分别代表博来霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和G418抗性基因。

[0030] 下述实施例中所用的毕赤酵母初始菌株为GS115‑Cas9，是由质粒pGAP‑Cas9转入到毕赤酵母GS115，将Cas9核酸酶编码基因整合到毕赤酵母GS115的HIS4位点上获得，其中Cas9序列由公司合成。

[0031] 本发明所述的(‑)‑α‑红没药醇合酶CCBOS的氨基酸以及编码基因、法尼基焦磷酸合酶ERG20的编码基因、基因异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1的编码基因、3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶1tHMG1的编码基因、甲羟戊酸激酶ERG12的编码基因和甲羟戊酸‑5‑二磷酸脱羧酶ERG19的编码基因均为本领域公知，已在现有文献中充分公开。

[0032] 本发明采用的红没药醇合酶来自于Cynara cardunculus var.Scolymus(CcBOS,GenBank XP_024994640.1)。((‑)‑α‑Bisabolol Production in Engineered Escherichia coli Expressing a Novel(‑)‑α‑Bisabolol Synthase from the Globe Artichoke Cynara cardunculus var.Scolymus.J Agric Food Chem.2021Aug 4；69(30):8492‑8503.doi:10.1021/acs.jafc.1c02759).

[0033] 实施例1：(‑)‑α‑红没药醇酵母出发重组菌株和突变体重组菌株的构建

[0034] 以质粒IntX‑pTEF‑tAOX1作为出发质粒，利用无缝克隆方式构建重组载体Int1‑pTEF‑tAOX1，然后以载体中酶切位点BamHI引入(‑)‑α‑红没药醇合酶CCBOS基因得到重组载体Int1‑pTEF‑CCBOS‑tAOX1。同时设计不同引物以重组载体Int1‑pTEF‑CCBOS‑tAOX1为模板，获得6个不同突变体。以辅助质粒HZP‑sgRNA为出发载体，利用载体中酶切位点BsaI引入sgRNA‑Int1得到重组载体HZP‑sgRNA‑Int1。然后以重组载体Int1‑pTEF‑CCBOS‑tAOX1和6个突变体为模板设计donor引物，进行PCR得到对应的Int1‑donor、Int1‑donor‑1、Int1‑donor‑2、Int1‑donor‑3、Int1‑donor‑4、Int1‑donor‑5、Int1‑donor‑6，将其分别和对应的重组guide质粒HZP‑sgRNA‑Int1转化进入毕赤酵母细胞GS115‑Cas9中，获得出发重组菌株CCBOS‑0以及6株突变体重组菌株，分别为CCBOS1‑1、CCBOS1‑2、CCBOS1‑3、CCBOS1‑4(亦为CCBOS‑1)、CCBOS1‑5、CCBOS1‑6，具体步骤如下：

[0035] 1.Int1‑pTEF‑tAOX1重组载体的构建

[0036] 以质粒IntX‑pTEF‑tAOX1作为出发质粒，设计骨架引物intX‑gj‑F/intX‑gj‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示)，进行PCR获得骨架片段，同时设计抗生素表达框引物amp‑F/amp‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示)，然后分别设计int1‑L(引物int1‑L‑F/int1‑L‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示)和int1‑R(int1‑R‑F/int1‑R‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示)同源臂，将四个片段进行无缝克隆，转化大肠杆菌DH5α菌株从而获得重组载体Int1‑pTEF‑tAOX1。

[0037] 2.重组质粒Int1‑pTEF‑CCBOS‑tAOX1的构建

[0038] (‑)‑α‑红没药醇合酶CCBOS基因由金斯瑞生物科技有限公司合成，以CCBOS基因为模板，设计引物CCBOS‑F/CCBOS‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示)扩增目的基因CCBOS，利用无缝克隆方法将其与酶切后的载体Int1‑pTEF‑tAOX1进行组装，转化大肠杆菌DH5α菌株从而获得重组载体Int1‑pTEF‑CCBOS‑tAOX1。

[0039] 3.不同突变体质粒的构建

[0040] 以Int1‑pTEF‑CCBOS‑tAOX1为模板，设计6种突变体，分别为Mut1(L57E)(即为(‑)‑α‑红没药醇合酶CCBOS中第57位的亮氨酸(L)突变成谷氨酸(E)所形成的突变体，以下突变体的命名方式同)、Mut2(V318S)、Mut3(T323I)、Mut4(F324Y)(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)、Mut5(L403A)和Mut6(T421S)，对应的引物分别是CCBOS‑57‑F/CCBOS‑57‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示)，CCBOS‑318‑F/CCBOS‑318‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示)，CCBOS‑323‑F/CCBOS‑323‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示)，CCBOS‑324‑F/CCBOS‑324‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示)，CCBOS‑403‑F/CCBOS‑403‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示)，CCBOS‑421‑F/CCBOS‑421‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示)，获得不同突变体质粒，分别为Int1‑pTEF‑CCBOS(L57E)‑tAOX1、Int1‑pTEF‑CCBOS(V318S)‑tAOX1、Int1‑pTEF‑CCBOS(T323I)‑tAOX1、Int1‑pTEF‑CCBOS(F324Y)‑tAOX1、Int1‑pTEF‑CCBOS(L403A)‑tAOX1和Int1‑pTEF‑CCBOS(T421S)‑tAOX1。

[0041] 4.sgRNA重组表达载体HZP‑sgRNA‑Int1的构建

[0042] 以质粒HZP‑sgRNA为模板，设计引物Int1‑sgRNA‑F(SEQ ID NO.25)和Int1‑sgRNA‑R(SEQ ID NO.26)，利用载体HZP‑sgRNA中酶切位点BsaI引入Int1‑sgRNA，通过T4酶连接得到重组载体HZP‑sgRNA‑Int1。

[0043] 5.(‑)‑α‑红没药醇酵母重组菌株的构建

[0044] 以重组载体Int1‑pTEF‑CCBOS‑tAOX1以及6种突变体质粒为模板设计引物Int1‑donor‑F(SEQ ID NO.27)和Int1‑donor‑R(SEQ ID NO.28)，进行PCR得到对应的片段Int1‑donor、Int1‑donor‑1、Int1‑donor‑2、Int1‑donor‑3、Int1‑donor‑4、Int1‑donor‑5、Int1‑donor‑6，将其分别和对应的重组guide质粒HZP‑sgRNA‑Int1转化进入毕赤酵母细胞GS115‑Cas9，获得不同重组菌株，分别是CCBOS‑0、CCBOS1‑1、CCBOS1‑2、CCBOS1‑3、CCBOS1‑4(亦为CCBOS‑1)、CCBOS1‑5、CCBOS1‑6。同时传代几次丢掉抗性质粒。

[0045] 实施例2：(‑)‑α‑红没药醇酵母重组菌株CCBOS‑2的构建

[0046] 以突变体质粒Int1‑pTEF‑CCBOS(F324Y)‑tAOX1为出发载体，构建Int1‑pTEF‑ERG20‑(PA)5‑CCBOS(F324Y)‑tAOX1重组表达载体。以Int1‑pTEF‑CCBOS(F324Y)‑tAOX1作为出发质粒，设计骨架引物进行全质粒PCR获得载体骨架，再设计引物引入ERG20，通过同源重组得到重组载体Int1‑pTEF‑ERG20‑(PA)5‑CCBOS(F324Y)‑tAOX1。采用的sgRNA为HZP‑sgRNA‑Int1。以重组载体Int1‑pTEF‑ERG20‑(PA)5‑CCBOS(F324Y)‑tAOX1为模板设计donor引物，进行PCR得到对应的Int1‑ERG20‑donor，将其和对应的重组guide质粒HZP‑sgRNA‑Int1转化进入毕赤酵母细胞GS115‑Cas9，获得重组菌株CCBOS‑2，具体步骤如下：

[0047] 1.重组载体Int1‑pTEF‑ERG20‑(PA)5‑CCBOS(F324Y)‑tAOX1的构建

[0048] 以突变体质粒Int1‑pTEF‑CCBOS(F324Y)‑tAOX1为模板，设计骨架引物int1‑gujia‑F/int1‑gujia‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示)进行全质粒PCR获得载体骨架。另外以毕赤酵母基因组为模板设计引物ERG20‑F/ERG20‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32所示)扩增目的基因ERG20，利用无缝克隆方法将其与骨架载体Int1‑pTEF‑CCBOS(F324Y)‑tAOX1进行组装，转化大肠杆菌DH5α菌株从而获得重组载体Int1‑pTEF‑ERG20‑(PA)5‑CCBOS(F324Y)‑tAOX1。

[0049] 2.sgRNA重组表达载体HZP‑sgRNA‑Int1的构建

[0050] 同实施例1中重组表达载体HZP‑sgRNA‑Int1。

[0051] 3.(‑)‑α‑红没药醇酵母重组菌株CCBOS‑2的构建

[0052] 以重组载体Int1‑pTEF‑ERG20‑(PA)5‑CCBOS(F324Y)‑tAOX1为模板设计引物Int1‑ERG20‑donor‑F(SEQ ID NO.33)和Int1‑ERG20‑donor‑R(SEQ ID NO.34)，进行PCR得到对应的线性化的片段Int1‑ERG20‑donor，将其和对应的重组guide质粒HZP‑sgRNA‑Int1同时转化进入毕赤酵母细胞GS115‑Cas9，获得重组菌株CCBOS‑2。同时传代几次丢掉抗性质粒。

[0053] 实施例3：(‑)‑α‑红没药醇酵母重组菌株CCBOS‑3‑1的构建

[0054] 以质粒IntX‑pTEF‑tAOX1作为出发质粒，利用无缝克隆方式构建重组载体Int2‑pTEF‑tAOX1，然后以载体中酶切位点BamHI引入IDI1，得到重组载体Int2‑pTEF‑IDI1‑tAOX1。以质粒IntX‑pGAP‑t0547作为出发质粒，利用无缝克隆方式构建重组载体Int1‑pGAP‑t0547，然后以载体中酶切位点AatⅡ引入tHMG1，得到重组载体Int1‑pGAP‑tHMG1‑t0547。以Int2‑pTEF‑IDI1‑tAOX1为模板进行PCR获得骨架，利用无缝克隆插入片段pGAP‑tHMG1‑t0547，最终获得载体Int2‑pTEF‑IDI1‑tAOX1‑pGAP‑tHMG1‑t0547。以辅助质粒HZP‑sgRNA为出发载体，利用载体中酶切位点BsaI引入sgRNA‑Int2得到重组载体HZP‑sgRNA‑Int2。以重组载体int2‑pTEF‑IDI1‑tAOX1‑pGAP‑tHMG1‑t0547为模板设计donor引物，进行PCR得到对应的Int2‑donor，将其和对应的重组guide质粒HZP‑sgRNA‑Int2转化进入实施例2酵母CCBOS‑2中获得重组菌株CCBOS‑3‑1。同时传代几次丢掉抗性质粒。具体步骤如下：

[0055] 1.重组载体Int2‑pTEF‑IDI1‑tAOX1的构建

[0056] (1)构建重组载体Int2‑pTEF‑tAOX1：以质粒IntX‑pTEF‑tAOX1作为出发质粒，设计骨架引物intX‑gj‑F/intX‑gj‑R进行PCR获得骨架片段，同时设计抗生素表达框引物amp‑F/amp‑R，然后分别设计int2‑L(引物int2‑L‑F/int2‑L‑R，核苷酸序列如SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36所示)和int2‑R(引物int2‑R‑F/int2‑R‑R，核苷酸序列如SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38所示)同源臂，将四个片段进行无缝克隆，转化大肠杆菌DH5α菌株从而获得重组载体Int2‑pTEF‑tAOX1。

[0057] (2)构建重组载体Int2‑pTEF‑IDI1‑tAOX1：以酿酒酵母基因组为模板，设计引物IDI1‑F/IDI1‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40所示)扩增目的基因IDI1，利用无缝克隆方法将其与经BamHI酶切后的载体Int2‑pTEF‑tAOX1进行组装，转化大肠杆菌DH5α菌株从而获得重组载体Int2‑pTEF‑IDI1‑tAOX1。

[0058] 2.重组载体Int1‑pGAP‑tHMG1‑t0547的构建

[0059] (1)构建重组载体Int1‑pGAP‑t0547：以质粒IntX‑pGAP‑t0547作为出发质粒，设计骨架引物int1‑gj‑F/int1‑gj‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42所示)进行PCR获得骨架片段，同时设计抗生素表达框引物amp‑F/amp‑R，然后分别设计Int1‑L(引物Int1‑L‑F/Int1‑L‑R，核苷酸序列如SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44所示)和Int1‑R(Int1‑R‑F/Int1‑R‑R，核苷酸序列如SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46所示)同源臂，将四个片段进行无缝克隆，转化大肠杆菌DH5α菌株从而获得重组载体Int1‑pGAP‑t0547。

[0060] (2)构建重组载体Int1‑pGAP‑tHMG1‑t0547t：以酿酒酵母基因组为模板，设计引物tHMG1‑F/tHMG1‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48所示)扩增目的基因tHMG1，利用无缝克隆方法将其与经AatⅡ酶切后的载体Int1‑pGAP‑t0547t进行组装，转化大肠杆菌DH5α菌株从而获得重组载体Int1‑pGAP‑tHMG1‑t0547t。

[0061] 3.重组载体Int2‑pTEF‑IDI1‑tAOX1‑pGAP‑tHMG1‑t0547的构建

[0062] 以Int2‑pTEF‑IDI1‑tAOX1为模板，设计骨架引物int2‑IDI1‑gj‑F/int2‑IDI1‑gj‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.50所示)进行PCR获得骨架，利用无缝克隆插入片段pGAP‑tHMG1‑t0547(引物GAP‑tHMG1‑F/GAP‑tHMG1‑R，核苷酸序列如SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52所示)，转化大肠杆菌DH5α菌株从而获得重组载体Int2‑pTEF‑IDI1‑tAOX1‑pGAP‑tHMG1‑t0547。

[0063] 4.sgRNA重组表达载体HZP‑sgRNA‑Int2的构建

[0064] 以质粒HZP‑sgRNA为模板，设计引物Int2‑sgRNA‑F(SEQ ID NO.53)和Int2‑sgRNA‑R(SEQ ID NO.54)，利用载体HZP‑sgRNA中酶切位点BsaI引入Int2‑sgRNA，通过T4酶连接得到重组载体HZP‑sgRNA‑Int2。

[0065] 5.(‑)‑α‑红没药醇毕赤酵母重组菌株CCBOS‑3‑1的构建

[0066] 以重组载体Int2‑pTEF‑IDI1‑tAOX1‑pGAP‑tHMG1‑t0547为模板，设计引物Int2‑donor‑F(SEQ ID NO.55)和Int2‑donor‑R(SEQ ID NO.56)，进行PCR得到对应的线性化的片段Int2‑donor，将其和对应的重组guide质粒HZP‑sgRNA‑Int2同时转化进入毕赤酵母细胞CCBOS‑2获得重组菌株CCBOS‑3‑1。同时传代几次丢掉抗性质粒。

[0067] 实施例4：(‑)‑α‑红没药醇酵母重组菌株CCBOS‑3的构建

[0068] 以质粒IntX‑pTEF‑tAOX1作为出发质粒，利用无缝克隆方式构建重组载体Int3‑pTEF‑tAOX1，然后以载体中酶切位点BamHI引入ERG12，得到重组载体Int3‑pTEF‑ERG12‑tAOX1。以质粒IntX‑pGAP‑t0547作为出发质粒，利用无缝克隆方式构建重组载体Int1‑pGAP‑t0547，然后以载体中酶切位点AatⅡ引入ERG19，得到重组载体Int1‑pGAP‑ERG19‑t0547。以Int3‑pTEF‑ERG12‑tAOX1为模板进行PCR获得骨架，利用无缝克隆插入片段pGAP‑ERG19‑t0547最终获得载体Int3‑pTEF‑ERG12‑tAOX1‑pGAP‑ERG19‑t0547。以辅助质粒HGP‑sgRNA为出发载体，利用载体中酶切位点BsaI引入sgRNA‑Int3得到重组载体HGP‑sgRNA‑Int3。以重组载体Int3‑pTEF‑ERG12‑tAOX1‑pGAP‑ERG19‑t0547为模板设计donor引物，进行PCR得到对应的Int3‑donor，将其和对应的重组guide质粒HZP‑sgRNA‑Int3转化进入实施例3酵母CCBOS‑3‑1中，获得重组菌株CCBOS‑3。同时传代几次丢掉抗性质粒。

[0069] 具体步骤如下：

[0070] 1.重组载体Int3‑pTEF‑ERG12‑tAOX1的构建

[0071] (1)构建Int3‑pTEF‑tAOX1重组载体：以质粒IntX‑pTEF‑tAOX1作为出发质粒，设计骨架引物int3‑gj‑F/int3‑gj‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58所示)进行PCR获得骨架片段，同时设计抗生素表达框引物amp‑F/amp‑R，然后分别设计int3‑L(引物int3‑L‑F/int3‑L‑R，核苷酸序列如SEQ ID NO.59、SEQ ID NO.60所示)和int3‑R(int3‑R‑F/int3‑R‑R，核苷酸序列如SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62所示)同源臂，将四个片段进行无缝克隆，转化大肠杆菌DH5α菌株从而获得重组载体Int3‑pTEF‑tAOX1。

[0072] (2)构建重组载体Int3‑pTEF‑ERG12‑tAOX1：以毕赤酵母基因组为模板，设计引物ERG12‑F/ERG12‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64所示)扩增目的基因ERG12，利用无缝克隆方法将其与经BamHI酶切后的载体Int3‑pTEF‑tAOX1进行组装，转化大肠杆菌DH5α菌株从而获得重组载体Int3‑pTEF‑ERG12‑tAOX1。

[0073] 2.重组载体Int1‑pGAP‑ERG19‑t0547的构建

[0074] 以质粒Int1‑pGAP‑t0547作为出发质粒，以毕赤酵母基因组为模板，设计引物ERG19‑F/ERG19‑R(核苷酸序列如SEQ ID NO.65、SEQ ID NO.66所示)扩增目的基因ERG19，利用无缝克隆方法将其与经AatⅡ酶切后的载体Int1‑pGAP‑t0547t进行组装，转化大肠杆菌DH5α菌株从而获得重组载体Int1‑pGAP‑ERG19‑t0547t。

[0075] 3.重组载体Int3‑pTEF‑ERG12‑tAOX1‑pGAP‑ERG19‑t0547的构建

[0076] 以Int3‑pTEF‑ERG12‑tAOX1为模板设计引物int3‑ERG12‑gj‑F/int3‑ERG12‑gj‑R(核苷酸如SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68所示)，进行PCR获得骨架，利用无缝克隆插入片段pGAP‑ERG19‑t0547(引物GAP‑ERG19‑F/GAP‑ERG19‑R，核苷酸如SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70所示)，转化大肠杆菌DH5α菌株从而获得重组载体Int3‑pTEF‑ERG12‑tAOX1‑pGAP‑ERG19‑t0547。

[0077] 4.sgRNA重组表达载体HGP‑sgRNA‑Int3的构建

[0078] 以质粒HGP‑sgRNA为模板，设计引物Int3‑sgRNA‑F(SEQ ID NO.71)和Int3‑sgRNA‑R(SEQ ID NO.72)，利用载体HGP‑sgRNA中酶切位点BsaI引入Int3‑sgRNA，通过T4酶连接得到重组载体HZP‑sgRNA‑Int3。

[0079] 5.(‑)‑α‑红没药醇毕赤酵母重组菌株CCBOS‑3的构建

[0080] 以重组载体Int3‑pTEF‑ERG12‑tAOX1‑pGAP‑ERG19‑t0547为模板设计引物Int3‑donor‑F(SEQ ID NO.73)和Int3‑donor‑R(SEQ ID NO.74)，进行PCR得到对应的线性化的片段Int3‑donor，将其和对应的重组guide质粒HGP‑sgRNA‑Int3同时转化进入毕赤酵母细胞CCBOS‑3‑1获得重组菌株CCBOS‑3。同时传代几次丢掉抗性质粒。

[0081] 实施例5：(‑)‑α‑红没药醇酵母重组菌株CCBOS‑4的构建

[0082] 以辅助质粒HHP‑sgRNA为出发载体，利用载体中酶切位点BsaI引入sgRNA‑IntERG9得到重组载体HHP‑sgRNA‑IntERG9。以毕赤酵母基因组为模板设计donor引物，进行PCR得到对应的IntERG9‑donor，将其和对应的重组guide质粒HHP‑sgRNA‑IntERG9转化进入CCBOS‑3中获得重组菌株CCBOS‑4，同时传代几次丢掉抗性质粒。具体步骤如下：

[0083] 1.sgRNA重组表达载体HHP‑sgRNA‑IntERG9的构建

[0084] 以质粒HHP‑sgRNA为模板，设计引物IntERG9‑sgRNA‑F(SEQ ID NO.75)和IntERG9‑sgRNA‑R(SEQ ID NO.76)，利用载体HHP‑sgRNA中酶切位点BsaI引入IntERG9‑sgRNA，通过T4酶连接得到重组载体HHP‑sgRNA‑IntERG9。

[0085] 2.(‑)‑α‑红没药醇毕赤酵母重组菌株CCBOS‑4的构建

[0086] 以毕赤酵母基因组为模板设计引物IntERG9‑donor‑F(SEQ ID NO.77)和IntERG9‑donor‑R(SEQ ID NO.78)，进行PCR得到对应的线性化的片段IntERG9‑donor，将其和对应的重组guide质粒HHP‑sgRNA‑IntERG9同时转化进入毕赤酵母细胞CCBOS‑3获得重组菌株CCBOS‑4。同时传代几次丢掉抗性质粒。

[0087] 实施例6：多拷贝(‑)‑α‑红没药醇酵母重组菌株CCBOS‑5的构建

[0088] 构建ERG20‑(PA)5‑CCBOS(F324Y)的表达盒以及对应的guide质粒，将其依次转入到上述重组菌株CCBOS‑4中，经过转化最终得到重组菌株CCBOS‑5，具体步骤如下：

[0089] 1.sgRNA重组表达载体HZP‑sgRNA‑Int4、HGP‑sgRNA‑Int5的构建

[0090] 以辅助质粒HZP‑sgRNA为模板，设计引物Int4‑sgRNA‑F(SEQ ID NO.79)和Int4‑sgRNA‑R(SEQ ID NO.80)，利用载体HZP‑sgRNA中酶切位点BsaI引入Int4‑sgRNA，通过T4酶连接得到重组载体HZP‑sgRNA‑Int4。以辅助质粒HGP‑sgRNA为模板，设计引物Int5‑sgRNA‑F(SEQ ID NO.81)和Int5‑sgRNA‑R(SEQ ID NO.82)，利用载体HGP‑sgRNA中酶切位点BsaI引入Int5‑sgRNA，通过T4酶连接得到重组载体HGP‑sgRNA‑Int5。

[0091] 2.(‑)‑α‑红没药醇酵母重组菌株CCBOS‑5的构建

[0092] 以重组载体Int1‑pTEF‑ERG20‑(PA)5‑CCBOS(F324Y)‑tAOX1为模板设计引物Int4‑donor‑F(SEQ ID NO.83)和Int4‑donor‑R(SEQ ID NO.84)，进行PCR得到对应的线性化的片段Int4‑donor，将其和对应的重组guide质粒HZP‑sgRNA‑Int4同时转化进入毕赤酵母细胞CCBOS‑3获得重组菌株CCBOS‑5‑1。

[0093] 以重组载体Int1‑pTEF‑ERG20‑(PA)5‑CCBOS(F324Y)‑tAOX1为模板设计引物Int5‑donor‑F(SEQ ID NO.85)和Int5‑donor‑R(SEQ ID NO.86)，进行PCR得到对应的线性化的片段Int5‑donor，将其和对应的重组guide质粒HGP‑sgRNA‑Int5同时转化进入毕赤酵母细胞CCBOS‑5‑1获得重组菌株CCBOS‑5。同时传代几次丢掉两轮连续转化的抗性质粒。

[0094] 实施例7：毕赤酵母工程菌株高效生产(‑)‑α‑红没药醇

[0095] 将实施例1‑6中构建的重组菌株，经过固体YPD平板划线活化后，挑取单菌落到5mL试管中培养，再以1％接种量转接到50mL摇瓶中培养4天后处理样品进行产物分析。具体步骤如下：

[0096] 1.重组菌株的培养

[0097] 从平板上挑取GS115‑Cas9、CCBOS‑0、CCBOS‑1、CCBOS‑2、CCBOS‑3、CCBOS‑4、CCBOS‑5单菌落，分别接种于5mL YPD(葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L)试管中培养，
30℃、220rpm培养12h，然后分别将其以1％接种量分别接种到50mL的YPD摇瓶培养基中，每个菌株三个平行，培养基上层加入10％的正十二烷覆盖，30℃、220rpm培养4天，每48h补加
2％的葡萄糖。

[0098] 2.(‑)‑α‑红没药醇的检测方法

[0099] (1)样品处理：取上层发酵液1mL，12000rpm离心10min，取上层有机相过0.22μm尼龙滤膜，样品用乙酸乙酯稀释1000倍后进行GC‑MS检测。

[0100] (2)GC‑MS检测条件如下：

[0101] 进样口温度250℃，进样体积1ul，不分流；色谱柱：HP‑5ms(30m*0.25mM)；色谱条件：初始温度为60℃，按照10℃/min的速度上升到160℃，然后5℃/min上升到200℃，最后10℃/min上升到230℃。用(‑)‑α红没药醇的标准品进行定性定量。

[0102] 3.重组菌株(‑)‑α‑红没药醇产量比较

[0103] 采用GC‑MS检测方法测定各毕赤酵母工程菌株的(‑)‑α‑红没药醇产量，质谱检测图如图1所示。

[0104] 实施例1中出发重组菌株和不同突变体重组菌株摇瓶培养获得(‑)‑α‑红没药醇的产量如图2所示，结果显示突变体CCBOS‑1‑1、CCBOS‑1‑4相较于出发重组菌株CCBOS‑0产量进一步提高，其中重组菌株CCBOS‑1‑4的产量相较于出发重组菌株CCBOS‑0提高了73％。

[0105] 重组菌株CCBOS‑0，CCBOS‑1、CCBOS‑2、CCBOS‑3、CCBOS‑4、CCBOS‑5摇瓶培养获得(‑)‑α‑红没药醇的产量如图3所示，从图中可以看出，重组菌株CCBOS‑5的产量达到最高，达到70mg/L，相较于出发重组菌株CCBOS‑0提高了35倍。