[0001] 本发明属于功能材料技术领域，具体涉及一种可注射型骨组织修复复合支架及其制备方法和应用。

[0002] 由于创伤、感染、肿瘤以及先天性疾病引起的大面积骨缺损广泛存在，在临床上需要对骨缺损部位进行干预，因此骨缺损治疗已成为医学界普遍关注的问题。目前临床上修复骨缺损主要采用骨移植方法，然而骨移植存在供体来源有限、免疫排斥反应，二次伤害较大以及并发症多等问题，使得骨移植治疗方法应用受限。

[0003] 近年来，组织工程技术的兴起给骨缺损修复带来新的希望。水凝胶具有3D网络结构，可以包载多种小分子化合物，并具有易于调控的理化性质、生物相容性和生物降解性等优势，是组织工程领域新兴的生物材料。以水凝胶为材料的骨组织工程支架在临床骨缺损修复中得到了广泛应用。目前常用的水凝胶支架材料主要有胶原（Collagen）、明胶（Gelatin）、壳聚糖（Chitosan，CS）、可德胶（Curdlan，CUD）、透明质酸（Hyaluronic acid）等。

[0004] CS又称可溶性甲壳素，是一种从甲壳类动物中提取出来的天然多糖，具有良好的抗菌性、生物降解性、无毒性以及免疫原性低等特征，在骨组织工程领域具有良好的潜力。已有研究表明，CS支架可诱导细胞黏附和增殖，促进新生血管的形成以及骨再生。然而，由CS机械强度较弱，常温下溶解度较低，细胞黏附性低等缺陷限制了其广泛应用。因此目前CS作为支架研究主要集中在纳米金属材料、生物陶瓷材料、生物高分子材料等材料的复合。曾有研究发现，CS与磷酸化羟基磷石灰（HAp）的复合支架没有毒性且比CS水凝胶支架的机械强度高，具有良好的骨诱导性、骨传导性以及上调成骨细胞的活性与迁移，从而促进骨再生。此外，CS与纳米金属材料、生物陶瓷材料的复合材料虽然提高了凝胶的机械强度以及促进细胞黏附，但是在骨再生方面并不理想。因此，寻找具有优良的生物相容性和生物降解性的生物高分子材料至关重要。

[0005] 近年研究发现，天然高分子材料CUD在骨缺损再生中有其独特的作用。CUD是由β‑1,3‑糖苷键构成的水不溶性葡聚糖，作为食品添加剂已广泛应用。CUD具有免疫调节、抗病毒、抗炎等生物活性，还具有独特的温度响应成胶特性。CUD不溶于水，但其水分散体在加热处理后能形成凝胶，基于这一特性，CUD被称作“热凝胶”。CUD在不同制备方法下形成的凝胶性质不同，热诱导法是目前生物医药应用中最为广泛的制备CUD水凝胶的方法。在不同的诱导温度下，CUD水分散体有两种不同的凝胶状态：当CUD水悬液加热到55℃ 60℃后冷却，可~
形成热可逆凝胶；而加热到80℃ 90℃再退火时，可形成热不可逆凝胶。热不可逆凝胶的凝~
胶强度较高，而热可逆凝胶的凝胶强度较弱。此外，CUD具有生物相容性，可用于药物递送系统，曾有研究发现，载纳米银的CUD水凝胶具有较好的机械性能，可促进成纤维细胞的附着、扩散和生长，并能有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，促进受感染皮肤的伤口愈合。在骨再生方面，CUD可通过促进间充质干细胞粘附于骨修复支架、分化为成骨细胞进而促进骨生长，它还通过与Dectin‑1受体相互作用抑制破骨细胞生成，进一步加快骨组织再生。最近研究显示，基于CS和CUD制备的一种新型骨再生支架结合了两种生物聚合物的优点，并具有CUD的免疫调节性可促进细胞迁移，其降解速度比CS慢，使得支架在很长时间内保持良好的机械性能，因此在骨组织工程中具有较大应用潜力。

[0006] 复合材料水凝胶的骨组织工程支架在临床骨缺损修复中得到了广泛应用，目前利用化学交联、物理交联的方法制备的复合水凝胶具有诸如形成三维网络结构、可植入性、良好的力学和降解性能以及优异的生物相容性，但是此类水凝胶支架需要进行二次创伤以实现支架的植入，这使感染及炎症更易发生同时降低患者的依从性。因此，可注射原位成型水凝胶得到迅速发展，研究发现，聚乙二醇与多肽共聚物制备出一种可注射生物活性水凝胶支架，该支架操作简便，可注射的热敏水凝胶成胶温度与体温接近，以及具备填充不规则缺损的塑形能力和密封伤口的优点。所以，与传统水凝胶相比可注射型水凝胶支架优点明显，实现临床微创治疗，明显改善了患者的依从性。可注射的流动性，也确保水凝胶材料与缺损部位完全接触，从而促进骨再生。

[0007] 纳米技术的蓬勃发展给骨缺损修复指出了新的方向。黑磷（Black Phosphorus，BP）纳米材料，也称为黑磷烯，是一种新型二维材料，已广泛应用于骨再生。最近研究显示，与其他二维材料相比，BP纳米材料在骨再生方面具有良好的生物相容性和促骨修复功能。BP近红外吸收效率高，具有良好的光热响应特性，在近红外照射下BP加速降解为磷酸盐，增
2+
强BP化学活性，增强磷酸盐和Ca 结合，促进原位生物矿化。然而，BP的高降解性和较低的生物黏附性使其在生物工程领域应用受限，将BP载入可注射型水凝胶支架可促使BP原位降解为增强骨再生的磷酸盐。研究发现，制备BP水凝胶支架具有矿化作用，这种矿化过程可以通过调节近红外光照射时间和位置来控制。载有黑磷纳米片的聚乳酸‑羟基乙酸（BPs@PLGA）
3‑
也具有高效的近红外光热响应性，其可完全生物降解，降解产物是无害的H2O，CO2和PO4 （骨骼的必需成分）。低强度周期性近红外照射BPs@PLGA可上调热休克蛋白的表达，体外和体内实验均表明其可促进成骨，因此在骨科应用中具有很大的潜力。在近红外光照射下，植入大鼠股骨缺损的BP‑SrCl2/PLGA微球具有良好的组织相容性和促进骨再生能力，靶部位触发
2+
Sr 释放可实现精准的骨再生治疗。因此，制备一种基于CUD与CS良好生物相容性、生物可降解性的原位凝胶支架，包载具有骨修复潜力的BP纳米材料，得到新型光响应原位凝胶骨组织修复复合支架，在骨组织修复中具有广泛的应用前景。

[0028] 下面以具体实施例对本发明做进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

[0029] 除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

[0030] 实施例1.骨组织修复复合支架（CGC）的成分及制备方法。

[0031] 本发明所提供了一种在室温下为液态，体温下迅速原位成胶的组织工程学骨组织修复支架，其为包载纳米BP的可德胶（curdlan，CUD）/壳聚糖（chitosan，CS）/甘油磷酸钠（glycerophosphate，GP）的复合支架（CGCB）。其中，纳米BP分散于CGC复合支架的三维网络结构孔洞内。

[0032] 制备方法包括如下步骤。

[0033] S1：将BP分散于蒸馏水中，加入CUD，配制得到浓度为20mg/mL的CUD混悬液，超声震荡；也可以将CUD混悬液经纯水配制后，加入BP分散液中，制得CUD/BP混悬液。

[0034] S2：将CS分散于醋酸溶液中，持续搅拌直至形成澄清溶液。冰浴条件下，将GP溶液在搅拌下缓慢滴入CS溶液中，持续搅拌1h，形成质量分数为18%的凝胶，4℃冰箱保存。

[0035] S3：将S1所得的CUD/BP混悬液提前30min在0‑4℃条件下预冷，然后在0 4℃条件下~向S2所得的CS溶液中缓慢滴加的CUD/BP混悬液，使CUD/BP混悬液比例为40%，并在磁力搅拌器上迅速混匀，得到包载纳米BP的CGC支架（CGCB），4℃冰箱保存。

[0036] 本发明所公开的CGCB放入37℃水浴中，5 min内即可迅速成胶。本发明采用物理交联的方法将CUD与CS交联制备生物相容性水凝胶支架，其为孔径约50μm的三维网状多孔结构，再将具有骨修复潜力的纳米BP均匀分布于水凝胶三维网状孔洞内，得到了包载纳米BP的CGC骨组织修复复合支架（CGCB）。

[0037] 具体实验结果如下。

[0038] 图1表明已成功制备CGC支架。如图所示，本发明制备的CGC支架在室温（25℃）为可流动液体，在体温（37℃）下发生相变，呈凝胶态。

[0039] 图2是CGC的扫描电镜图。从图2中可以看出CGC为明显的三维网状多孔结构，孔径约50μm，这有利于包载纳米BP。

[0040] 图3是发明的支架及支架原料的红外光谱图。如图所示，CUD的红外光谱图中，−1 −1 −13355cm 对应结构中O‑H的伸缩振动峰，2868 cm 和1419 cm 分别是‑CH2的伸缩振动峰与−1 −1
弯曲振动峰。在指纹区，1150cm 处的吸收峰是C1‑O‑C3糖苷键的伸缩振动峰，1023cm 处的−1
吸收峰是C1‑O‑C5糖苷键的伸缩振动峰。CUD结构中的特征吸收峰894cm ，是其分子结构中−1
的β‑（1→3）糖苷键变形振动峰，并且在CUD的红外光谱图中没有出现840cm 的吸收峰，证明−1
CUD结构中不存在α构型。在CS谱图中，3600–3200cm 范围内的宽谱带对应O‑H与N‑H的伸缩−1 −1
振动，2925cm 是‑CH2的伸缩振动峰。1620cm 处的吸收峰是N‑H变形振动峰，在指纹区−1 −1
1200cm ‑1000cm 出现的谱带可证实CS中存在吡喃糖环。观察GP的谱图，可以看到其结构
3‑ −1 −1
中PO4 的特征吸收峰962cm 和519cm 。在CGC凝胶的红外谱图中，CUD、GP、CS的特征吸收峰−1 −1 −1 −1
1571cm 、969cm 、873cm 和515cm 均出现，表明了通过物理交联成功制备了水凝胶。

[0041] 图4是发明的支架及支架原料的X射线衍射图。如图所示，CUD在2θ=11.60/20.76/28.34/40.65处有明显的衍射峰，源自CUD分子链中规整的六边型三螺旋结晶区结构，这是CUD难溶于水的原因。CS在2θ=20.11有一较弱的衍射峰。而制备的CUD/GP/CS凝胶无明显衍射峰，这是因为物理交联过程中，CUD和CS原有的分子结构被破坏。粉末X射线衍射结果表明，CGC凝胶中已没有两种多糖原有的结晶结构。

[0042] 图5是本发明制备的CGC支架的溶胀率。如图所示，本发明制备的CGC的溶胀率明显高于CUD，说明制得的CGC支架的三维网状结构孔径较大，利于纳米BP载入。

[0043] 实施例2.骨组织修复复合支架（CGCB）制备条件对成胶效果的影响。

[0044] CS凝胶的质量分数对成胶效果的影响实验。

[0045] 按实施例1中所述的制备方法制备骨组织修复复合支架（CGCB），区别在于CS混悬液质量分数按照下述步骤进行操作，并观察成胶效果如下：18%、20%、22%的CS凝胶对CGCB的形态无影响，其中18%的CS注射性较好。

[0046] CUD混悬液的比例对成胶效果的影响实验。

[0047] 按实施例1中所述的制备方法制备骨组织修复复合支架（CGCB），区别在于CUD混悬液比例按照下述步骤进行操作，并观察成胶效果如下：在一些实施方案中，CUD混悬液的比例与是否成胶、成胶温度、成胶时间体内可注射性的关系如下表。

[0048] 。

[0049] 实验结果：CUD混悬液的比例为20%，此时在10℃时形成低强度凝胶；CUD混悬液的比例为40%，此时37℃水浴5min形成高强度凝胶；CUD混悬液的比例为60%，此时37℃水浴5min不形成凝胶，在37℃水浴锅中温浴10min时形成低强度凝胶，之后凝胶强度不随时间变化而变化；CUD混悬液的比例为80%，此时37℃水浴5min不形成凝胶，之后凝胶不随时间变化而变化。

[0050] 实施例3.本发明的生物骨修复的应用方案。

[0051] 本发明所述骨组织修复复合支架（CGCB）用于骨组织修复时，由于CGCB体系在室温下为液态，可采取注射方式给药，给药后在生理温度下迅速在原位成胶，支撑骨骼；且BP可显著抑制炎症细胞因子，促进巨噬细胞向M2型极化。在体内，这种促成骨微环境通过上调筛选基因和成骨相关基因（IBSP、SPP1、ALP、Osterix、OPN、R2、BMP2）来促进骨髓间充质干细胞（hBMSC）的增殖和分化，精准调控骨缺损区域免疫反应，有序激活M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞，释放成血管相关因子VEGF和PDGF‑BB，实现血管的内源性再生。

[0052] 具体实验过程如下所述。

[0053] 1. 动物模型制备。

[0054] 首先通过手术方法建立裸鼠骨折模型：戊巴比妥钠腹腔注射麻醉；手术操作：遵循无菌操作原则使用安尔碘将手术区域充分消毒，进行常规铺巾，将裸鼠仰卧位固定，铺洞巾，暴露手术区域，对裸鼠右下肢内侧5mm皮肤竖直切口，使用顿性剥离法将肌肉剥离，用高速牙科磨钻，钻头2mm直径，小心对裸鼠胫骨开窗。使用4‑0带针缝合线逐层地小心缝合切开的肌肉和皮下组织，使用3‑0带针缝合线间断缝合切开的皮肤。将造模后的裸鼠于笼中饲养，使其自由活动。

[0055] 2. 按照实施例1中所述制备方法制备骨组织修复复合支架（CGCB），并在室温下向CGCB复合凝胶支架中加入浓度为5mg/mL的罗丹明（RhB）荧光染料。制备浓度为5mg/mL的RhBCGCB复合凝胶支架。

[0056] 3. 用无菌注射器抽取2中制备的RhBCGCB复合凝胶支架100μL，对裸鼠造模部位进行肌肉注射；另用无菌注射器抽取5mg/mL的罗丹明水溶液100μL，对裸鼠造模部位进行肌肉注射。另对裸鼠造模部位注射100μL生理盐水作为对照。

[0057] 4. 注射120min后利用小动物活体成像仪观察RhBCGCB体内分布情况。

[0058] 5. 实验结果。

[0059] 如图6所示。本发明制备的CGCB水凝胶支架造模部位给药后的活体成像图。从图中可知，RhBCGCB复合凝胶支架组的裸鼠造模部位荧光强度较高，而RhB solution组在造模部位荧光强度远低于RhBCGCB复合凝胶支架组，control组在造模部位几乎无荧光信号，证明本发明制备的CGCB复合凝胶支架具备原位成胶特点。

[0060] 以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。