[0001] 本发明涉及免疫检测领域，尤其涉及一种用于免疫层析检测的样本稀释液及其应用。

[0002] 运动引起的肌肉损伤在运动员和从事体育活动的个人中是常见的损伤，早期监测肌肉损伤对于维护运动员和个人的身体健康至关重要，其中骨骼肌损伤占据了相当大的比例。目前，肌肉损伤的检测主要包含生化指标检测、超声检测以及肌电指标检测等手段。这些检测手段从不同的角度出发，基于不同的病理学模型，在检测效果和检测效率方面都有所不同，但是都是基本结构复杂，测量方式繁琐，因此急需一种操作简单、能准确反映肌肉损伤程度的快速检测方法。

[0003] 心肌蛋白(MYO)是一种在骨骼肌和心肌细胞中普遍存在的蛋白质，在肌肉损伤后会释放到血液中，最终通过尿液排出，MYO的释放与肌肉损伤密切相关，是一种被广泛认可的生物标志物，检测体内MYO的水平即可准确反映肌肉损伤程度。因此MYO在血液中的检测方式备受关注，然而基于血液样本的检测需要专业的采样工具，具有一定的局限性，使用尿液样本进行检测，更加方便快捷。MYO在尿液中的浓度通常较低，因此需要开发出更为精确和灵敏的尿液检测方法，以确保能够准确地监测MYO水平，为肌肉损伤的评估和康复策略提供更全面的支持。

[0004] CN107907691A公开了一种肌红蛋白检测试剂盒及其使用方法，所述肌红蛋白检测试剂盒包括：校准品、试剂R1、酶结合物工作液R2、磁珠结合物工作液M、清洗液和化学发光底物。所述试剂R1含有咪唑成分，其可以快速消除全血中的血细胞，有效避免血细胞吞进磁珠的可能；所述清洗液含有十二烷基硫酸钠成分，增强了清洗的效果，避免了化学发光底物的非特异性结合。

[0005] CN103389383A公开了一种测定血清中肌红蛋白含量的检测试剂盒，所述试剂盒是由试剂R1、试剂R2及校准品三部分组成，所述试剂R1为磷酸盐缓冲体系，所述试剂R2的组成为交联肌红蛋白抗体的致敏乳胶溶液，所述校准品为溶于磷酸缓冲液的重组人肌红蛋白，同时添加甘油、蔗糖、BSA、甘露醇和山梨醇作为保护剂，叠氮钠作为防腐剂。

[0006] 近年来，快速检测需求的上升推动了临床诊断、环境监测和食品安全分析等领域的技术革新。侧流层析技术(LFCA)是基于抗原抗体特异性识别的一种检测方法，借助毛细管的吸附作用使样品在层析材料上移动，样品中的待测物与层析材料上一定区域的抗体结合，通过酶促显色反应或直接使用着色标记物短时间获得直观的测试结果。试纸条的制备成本相对较低，使用操作相当简单，无需复杂的专业培训，能够在极短时间内提供结果，结果通常可以肉眼观察，无需复杂的仪器，这提高了结果的可读性和直观性。LFCA试纸的便携性，使其成为现场检测的理想选择。

[0007] 综上所述，如何快速检测尿液样本中的MYO含量，已成为目前本领域亟待解决的问题。

[0052] 为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

[0053] 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

[0054] 制备例1

[0055] 本制备例制备了一种用于免疫层析检测的样本稀释液，所述样本稀释液包括pH为8的0.1M Hepes、0.27M NaCl、5％v/v Tween20和5％w/v牛血清白蛋白。

[0056] 制备例2

[0057] 本制备例制备了一种用于免疫层析检测的样本稀释液，所述样本稀释液包括pH为7的0.3M Hepes、0.1M NaCl、3％v/v Tween20和7％w/v牛血清白蛋白。

[0058] 制备例3

[0059] 本制备例制备了一种用于免疫层析检测的样本稀释液，所述样本稀释液包括pH为10的0.05M Hepes、0.4M NaCl、8％v/v Tween20和3％w/v牛血清白蛋白。

[0060] 制备例4

[0061] 本制备例制备了一种用于免疫层析检测的样本稀释液，与制备例1的区别仅在于将Tween20替换为等量的Tween80。

[0062] 制备例5

[0063] 本制备例制备了一种用于免疫层析检测的样本稀释液，与制备例1的区别仅在于额外添加了2％w/v蔗糖。

[0064] 制备例6

[0065] 本制备例制备了一种用于免疫层析检测的样本稀释液，与制备例1的区别仅在于额外添加了2％w/v海藻糖。

[0066] 制备例7

[0067] 本制备例制备了一种用于免疫层析检测的样本稀释液，与制备例1的区别仅在于额外添加了0.1％w/v EDTA。

[0068] 对比制备例1

[0069] 本对比制备例制备了一种用于免疫层析检测的样本稀释液，与制备例1的区别仅在于将Hepes缓冲液替换为相同浓度和pH的PBS缓冲液。

[0070] 对比制备例2

[0071] 本对比制备例制备了一种用于免疫层析检测的样本稀释液，与制备例1的区别仅在于将Hepes缓冲液替换为相同浓度和pH的Tris‑HCl缓冲液。

[0072] 对比制备例3

[0073] 本对比制备例制备了一种用于免疫层析检测的样本稀释液，与制备例1的区别仅在于将Hepes缓冲液替换为相同浓度和pH的MES缓冲液。

[0074] 对比制备例4

[0075] 本对比制备例制备了一种用于免疫层析检测的样本稀释液，与制备例1的区别仅在于将牛血清白蛋白替换为等量的酪蛋白。

[0076] 实施例1

[0077] 本实施例提供了一种制备侧流免疫层析试纸条的方法，所述方法包括以下步骤：

[0078] (1)颗粒制备

[0079] a)配制溶液：

[0080] MES buffer：pH为6的50mM 2‑(N‑吗啉代)乙磺酸；

[0081] 封闭液：0.5％v/v乙醇胺和20mg/mL牛血清白蛋白；

[0082] EDC溶液：20mg/mL的EDC，使用MES buffer作为溶剂；

[0083] Sulfo‑NHS溶液：20mg/mL的Sulfo‑NHS，使用MES buffer作为溶剂；

[0084] b)荧光微球清洗：取100μL荧光微球，400μL MES buffer，超声混匀，16700g，4℃，离心10min；去除上清液，加入500μL MES buffer，超声混匀，16700g，4℃，离心10min，该步骤重复3次；去除上清液，加入350μL MES buffer，超声混匀；

[0085] c)荧光微球活化：加入12.5μL EDC溶液和12.5μL Sulfo‑NHS溶液，超声混匀，37℃，220rpm，反应45min；16700g，4℃，离心10min；去除上清液，加入500μL MES buffer，超声混匀，16700g，4℃，离心10min，该步骤重复两次；去除上清液，加入500μL MES buffer，超声混匀；

[0086] d)抗体包被：向步骤c)获得的悬液中加入肌红蛋白单克隆抗体，超声混匀，37℃，220rpm，反应120min；16700g，4℃，离心10min；去除上清液，加入500μL水，超声混匀，
16700g，4℃，离心10min，该步骤重复两次；去除上清液，加入200μL封闭液，超声混匀；37℃，
220rpm，反应30min，每10min超匀一次；16700g，4℃，离心10min；去除上清液，加入500μL水，超声混匀，16700g，4℃，离心10min，该步骤重复两次；去除上清液，加入200μL水，超声混匀，即得到第一荧光探针，参照该步骤制备第二荧光探针；

[0087] (2)结合垫处理

[0088] 将结合垫处理液(200mM Tris‑HCl，20％蔗糖，4％ S9，pH＝8)吸入喷金划膜仪中，并喷涂在结合垫表面，至于恒温干燥箱中37℃放置2小时即可取出使用。

[0089] (3)喷金

[0090] 以30cm的结合垫为例，将6％的第一荧光探针和1％的第二荧光探针吸入到XYZ三维划膜喷金仪，设置喷金参数为1cm结合垫喷敷5μL荧光探针，将喷敷好探针的结合垫在37℃烘箱中放置2h后室温保存备用。

[0091] (4)划膜

[0092] 将1mg/mL的肌红蛋白单克隆抗体的捕获探针和1mg/mL交联了牛血清白蛋白的二硝基苯酚的控制探针吸入到XYZ三维划膜喷金仪中，设置参数为1cm，硝酸纤维素膜划线1μL，将划线好的37℃烘箱中放置2h后室温保存备用。

[0093] (5)组装

[0094] 将样品垫(1.5cm×30cm)、结合垫(1cm×30cm)、硝酸纤维素膜(2.0cm×30cm)和吸水纸(3cm×30cm)安装在聚氯乙烯底板上(7.4cm×30cm)，每两个相邻的衬垫之间有2mm的重叠，试纸条结构及反应原理如图1所示。

[0095] 实施例2

[0096] 本实施例提供了一种制备侧流免疫层析试纸条的方法，与实施例1的区别仅在于步骤(3)中将1mg/mL的第一荧光探针吸入到XYZ三维划膜喷金仪中，步骤(4)中控制探针为羊抗鼠IgG抗体。

[0097] 实施例3

[0098] 本实施例提供了一种侧流免疫层析试纸条的使用方法，使用样本稀释液将尿液样本稀释，将试纸条放置在装置中，0.2mL稀释后的尿液加入装置中，15min后观察结果，使用过程如图2所示。

[0099] 应用例1

[0100] 本应用例提供了一种肌红蛋白的检测方法，使用制备例1提供的样本稀释液稀释尿液样本，制备使用实施例1方法获得的侧流免疫层析试纸条，使用实施例3提供的侧流免疫层析试纸条的使用方法对肌红蛋白进行检测。

[0101] 应用例2‑7

[0102] 本应用例提供了一种肌红蛋白的检测方法，与应用例1的区别仅在于使用制备例2‑7提供的样本稀释液稀释尿液样本。

[0103] 应用例8

[0104] 本应用例提供了一种肌红蛋白的检测方法，与应用例1的区别仅在于制备使用实施例2方法获得的侧流免疫层析试纸条。

[0105] 对比应用例1‑4

[0106] 本对比应用例提供了一种肌红蛋白的检测方法，与应用例1的区别仅在于使用对比制备例1‑4提供的样本稀释液稀释尿液样本。

[0107] 测试例1

[0108] 本测试例使用已知肌红蛋白浓度的尿液样本，使用应用例1‑7、对比应用例1‑4提供的肌红蛋白的检测方法，将肌红蛋白浓度稀释为200ng/mL，记录T/C的值，结果如表1所示。

[0109] 表1

[0110]   T/C值应用例1 3.5
应用例2 3.2
应用例3 3.27
应用例4 2.25
应用例5 2.32
应用例6 2.71
应用例7 2.04
对比应用例1 1.51
对比应用例2 1.3
对比应用例3 1.98
对比应用例4 1.64

[0111] 根据表1可以得出：

[0112] (1)将应用例1与应用例4进行比较可以得出，Tween20的效果优于Tween80，Tween20可以提高T/C值；

[0113] (2)将应用例1与应用例5‑7进行比较可以看出，除了本发明提供的四种样本稀释液成分以外，额外添加其他物质，如蔗糖、海藻糖或EDTA等，都会使T/C值下降；

[0114] (3)将应用例1与对比应用例1‑3进行比较可以看出，将本发明样本稀释液中的Hepes缓冲液替换为其他种类的缓冲液，如PBS缓冲液、Tris‑HCl缓冲液或MES缓冲液等，都会使T/C值下降；

[0115] (4)将应用例1与对比应用例4进行比较可以看出，将本发明样本稀释液中的牛血清白蛋白替换为其他种类的蛋白质，如酪蛋白等，会使T/C值下降。

[0116] 测试例2

[0117] 本测试例使用已知肌红蛋白浓度的尿液样本，使用应用例1和8提供的肌红蛋白的检测方法，将肌红蛋白浓度使用尿液样本稀释为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200和500ng/mL，以不含肌红蛋白的尿液样本为空白对照组，使用样本稀释液将样本稀释，将试纸条放置在装置中，加入不同浓度的0.2mL稀释后的尿液进入装置，15min后经紫外灯照射并拍照。结果如图3所示，将羊抗鼠IgG抗体划在C线上，无法对本发明的尿液样品起到质控的作用。

[0118] 测试例3

[0119] 本测试例使用已知肌红蛋白浓度的尿液样本，使用应用例1提供的肌红蛋白的检测方法，将肌红蛋白浓度稀释为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200和500ng/mL，建立了肌红蛋‑4 1.3 2白浓度与T/C值的标准曲线，y＝(3.2329e ‑6.1013)/(1+(x/51.2119) )+6.1013，R ＝
0.996。拟合结果如图4所示，表明本发明提供了一种灵敏度高、线性程度好的检测尿液中肌红蛋白含量的方法。

[0120] 综上所述，本发明提供了一种用于免疫层析检测的样本稀释液，通过使用样本稀释液将样本浓度调整至合适的检测范围，并减少样本中存在的干扰免疫层析检测的物质，从而提高检测的灵敏度和特异性。本发明还提供了一种侧流免疫层析试纸条，将使用样本稀释液稀释后的尿液样本加入试纸条中，改进的LFCA能够在低至1ng/mL的浓度下检测到肌红蛋白，低于现有技术中的检测限，可靠性简便性均有明显优势。

[0121] 申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。