[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及约氏乳杆菌与罗伊氏乳杆菌在制备抗结肠癌药物中的应用。

[0002] 落叶松为松科落叶松属，是我国东北高山针叶林的主要树种。落叶松在我国具有很远的用药历史，具有行经络、止痛等功效。目前主要用于木制品的开发，这不可避免地留下大量的落叶松废料。落叶松心材中黄酮类化合物的含量远高于云杉，是二氢槲皮素的主要植物来源之一。阿拉伯半乳聚糖(AG)是二氢槲皮素提取过程中的副产品，对AG的研究也进一步开发利用了落叶松。东北地区丰富的落叶松资源为AG提供了充足的原材料。

[0003] AG具有良好的生物学活性。Sinha等从番泻叶中提取的AG，其具有良好的铁还原抗氧化能力和DPPH自由基清除能力；表明，AG在体外抗氧化方面具有良好的活性。AG可以通过抑制α‑葡萄糖苷酶活性、改善糖耐量和减少晚期糖基化终产物(AGEs)的积累，从而对由高血糖引发的骨质疏松症起到治疗作用。此外，AG因其能增强对巨噬细胞的损伤、抑制促炎因子的活性。De等从甜菊叶中提取AG，发现AG的粗提物、碱性提取物和均相提取物都具有体外抗单纯疱疹病毒1型(HSV‑1)的活性。王佩佩等从三七中分离得到AG，通过抗血管生成实验表明，AG能降低内皮细胞在基质上的迁移活性和成管能力，但对内皮细胞的生长无影响；进一步研究发现AG可以通过BMP2信号通路发挥抗血管生成的作用。AG因其具有抗氧化、抗炎、抗血管生成、抗糖尿病、抗病毒等多种生物活性，在医疗领域具有良好的发展前景。

[0004] 为了扩大中药多糖(AG)的生物活性，采用化学修饰的方法改变其化学结构和构象。目前，中药多糖的修饰方法主要有硫酸化、磷酸化、羧甲基化、硒化、甲基化和乙酰化等。改变其结构不仅可以改善生物学特性，有时还可以产生新的生物活性。不同的修饰方法会产生不同的DS，并对活性产生不同的影响。因此，为实现落叶松的综合利用，有必要从落叶松中提取并分离纯化AG，并对AG及其衍生物的生物活性进一步研究。

[0056] 下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0057] 实施例1阿拉伯半乳聚糖的提取分离及结构鉴定；

[0058] 1.材料与方法

[0059] 1.1实验材料

[0060] 落叶松根由吉林省长白山林场提供，并由吉林农业大学中药材学院刘文丛教授、李伟教授共同鉴定为松科落叶松属长白落叶松(Larix gmelinii(Rupr.)Kuzen.)。

[0061] 1.2主要试剂

[0062] 阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡聚糖标准品购自成都普思生物科技有限公司；1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮(PMP)购自北京索莱宝科技有限公司；苯酚、浓硫酸购自国药集团化学试剂北京有限公司；乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠购自天津市华东试剂厂；乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)购自美国赛默飞公司；CCK8试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司。

[0063] 1.3阿拉伯半乳聚糖的提取纯化

[0064] 1.3.1落叶松中粗多糖的提取

[0065] 将500g落叶松根粉末加入到烧杯内，加入无水乙醇(1:5，w/v)进行12h脱脂。经过滤风干后，将粉末干燥并用蒸馏水(1:20，w/v)在70℃下超声辅助提取1h，共提取3次。合并上清液并浓缩至约200mL。向浓缩溶液中加入无水乙醇直至乙醇浓度达到90％，4℃静置过夜，并通过离心(3500rpm，10min)收集沉淀。将沉淀重溶解于蒸馏水中，加入Sevage试剂(CHCl3/BuOH＝4:1，v/v)去除蛋白质，通过透析和冻干得到粗多糖。

[0066] 1.3.2粗多糖的分级沉淀

[0067] 称取50.0g粗多糖，加入2倍量的蒸馏水使其充分溶解，向溶液中加入无水乙醇至溶液的醇浓度达到30％，4℃下放置过夜，离心(3500rpm，10min)。用同样的方法，在乙醇浓度为40％、50％、60％、70％和80％的条件下得到沉淀物，分别命名为AG‑30、AG‑40、AG‑50、AG‑60、AG‑70和AG‑80。

[0068] 1.3.3粗多糖对LPS致IEC‑6细胞炎症的保护作用

[0069] 将IEC‑6细胞用10％胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5％ CO2条件下的恒温培养箱中培养。

[0070] CCK‑8分析：取96孔细胞培养板，每孔加入细胞悬液100μL，当细胞生长至细胞对数期时，药物预处理组加入受试化合物，培养24h后，模型组和药物预处理组加入一定浓度的LPS，药物处理组加入受试药物，对照组加入等量细胞培养液，共同作用24h后，每孔加10％CCK‑8，培养箱内继续培养1.5h后，酶标仪检测450nm波长处吸光度。根据实验结果计算受试化合物抵抗外源刺激致IEC‑6细胞活力下降的能力。

[0071] 1.3.4DEAE‑52纤维素离子交换层析

[0072] 准确称取AG‑40样品1.00g，用蒸馏水定容至1.00mL容量瓶。将DEAE‑52纤维素湿法装柱(2.8cm×40cm)，用蒸馏水平衡三个柱体积后用于分离。用NaCl溶液(0～0.3mol/L)以1mL/min(10mL/管)的流速进行洗脱。采用苯酚‑硫酸法检测每个馏分，在490nm处检测吸光度并绘制洗脱曲线。共获得三种成分，分别命名为AG‑40‑I、AG‑40‑II和AG‑40‑III。将所有获得的组分浓缩、透析和冻干。

[0073] 1.3.5Superose 12葡聚糖凝胶柱层析

[0074] 准确称取AG‑40‑I样品20.00mg，用蒸馏水定容至1.00mL容量瓶。将Superose 12葡聚糖凝胶湿法装柱，用0.15mol/L的NaCl溶液平衡三个柱体积后用于分离。用0.15mol/L的NaCl溶液以0.15mL/min(3mL/管)的流速进行洗脱。采用苯酚‑硫酸法检测每个馏分，在490nm处检测吸光度并绘制洗脱曲线，得到最终组分AG‑40‑I‑II。AG‑40‑I‑II经过透析和冻干后，保存备用。

[0075] 1.4AG‑40‑I‑II的结构表征

[0076] 1.4.1分子量及均一性测定

[0077] 采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定AG‑40‑I‑II的分子量(Mw)，以葡聚糖为标准品。HPGPC分析采用高效液相色谱(HPLC)(Waters e2695，American Waters)检测系统，在TSK‑Gel G3000 SWXL色谱柱(7.8mm×300mm)上配备示差折光检测器(RID‑20A，日本Shimazu)。在35℃，用NaCl(0.2mol/L)溶液以0.6mL/min的流速洗脱该柱。进样量为20μL。进样前，AG‑40‑I‑II通过0.22μm水膜过滤。

[0078] 1.4.2单糖组成分析

[0079] 溶液配制：2mol/L H2SO4：将1.087mL的浓硫酸，加入到8.913mL的蒸馏水；2mol/L NaOH：2g NaOH溶于蒸馏水定容至于25mL容量瓶；0.5mol/L PMP：0.87g PMP溶于甲醇定容至10mL容量瓶；0.3mol/L NaOH：1.2g NaOH溶于100mL蒸馏水；0.3mol/L盐酸：0.25mL的37％盐酸加蒸馏水定容至100mL。

[0080] 标准品溶液配制：取甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖标准品各适量，加蒸馏水定容配置成1mg/mL的标准品溶液。

[0081] 磷酸盐缓冲液配制：8.954g Na2HPO4·12H2O和2.496g NaH2PO4·2H2O溶于410mL娃哈哈矿泉水中，过0.22μm滤膜过滤备用。

[0082] 多糖样品水解：准确多糖样品20.00mg，加入2mol/L H2SO4溶液2mL，充入N2保护，在100℃水解6h。冷却至室温后逐滴加入2mol/L NaOH溶液调至pH＝7.0。

[0083] 标准品PMP衍生化：取标准品溶液0.5mL，加入0.5mL的PMP溶液与0.2mol/L的NaOH溶液，70℃水浴30min，冷却至室温后加入0.2mol/L盐酸将pH调至中性，加入1mL蒸馏水中止反应。加入1mL氯仿溶液震荡混匀，除去有机层，重复操作3次，将水层过0.22μm滤膜，备用。

[0084] 多糖样品的PMP衍生化：与标准品衍生化方法相同。

[0085] HPLC检测条件：检测器：Waters 2689UV Detector，色谱柱：COSMOSIL C18色谱柱(4.6×250mm,5μm)，流动相磷酸盐缓冲液：乙腈＝87:13，柱温30℃，检测波长：245nm，流速1mL/min，检测时间：40min。

[0086] 1.4.3红外光谱扫描

[0087] 对多糖进行红外光谱扫描分析其官能团特征信息。将多糖样品放置在傅里叶变换‑1红外光谱仪上，进行红外扫描。扫描范围在4000‑450cm 。

[0088] 1.4.4紫外光谱扫描

[0089] 使用紫外光谱仪在200‑900nm的扫描模式下进行紫外光谱扫描。

[0090] 1.4.5多糖甲基化分析

[0091] 在分析多糖结构中，多糖甲基化应用广泛。通过甲基化可以推测出多糖中糖苷键的连接方式，具体反应流程如图1所示。

[0092] NaOH‑DMSO混悬液配制：将100mg NaOH研碎成粉末，加入10mL的DMSO，超声使其充分混溶。

[0093] 样品溶液配制：取10.00mg多糖样品，加入10mL的DMSO溶液，超声使其充分混溶。

[0094] 甲基化反应：将NaOH‑DMSO混悬液加入到多糖样品中，并充入N2保护，充分混匀后加入3mL碘甲烷，反应1h后加入1mL蒸馏水终止反应，用三氯甲烷萃取3次，再用蒸馏水对三氯甲烷清洗三次，备用。

[0095] 红外光谱检测：将甲基化后的样品用FT‑IR检测，观察3400cm‑1处无吸收峰，证明甲基化完全。

[0096] 甲基化多糖酸水解：在甲基化的多糖样品中加入3mL甲酸，充入N2保护，100℃水解4h后，加入无水乙醇反复蒸干，除尽甲酸。再加入2mol/L的TFA 3mL，充入N2保护，100℃水解
6h，水解完成后加入无水乙醇反复蒸干，除尽TFA。

[0097] 还原：取蒸干的多糖样品，加入30mg/mL NaBH4溶液1mL，室温搅拌反应10h，反应完成后，加入甲醇反复蒸干，除尽NaBH4。

[0098] 乙酰化：取蒸干的多糖样品，加入无水乙酸酐和无水吡啶各0.5mL。充入N2保护，100℃反应2h，然后多次加入甲醇反复蒸干，除尽乙酸酐。

[0099] 样品检测：用二氯甲烷将多糖样品溶解，过0.22μm滤膜，备用。

[0100] 1.4.6核磁共振分析(NMR)

[0101] 称取20.00mg多糖，溶解于0.5mL D2O中，冻干。再加入0.5mL D2O溶解，重复3次。然1 13 1 1
后进行H‑NMR、C‑NMR、HSQC、HMBC和H‑HCOSY的核磁共振波谱检测。

[0102] 2.实验结果

[0103] 2.1AG的分离纯化

[0104] 用粗多糖对IEC‑6细胞进行干预。通过CCK8试剂盒检测细胞活力可以发现，在1.25‑100μg/mL浓度下粗多糖对IEC‑6细胞均无毒性。特别的是，在40和80μg/mL浓度下，细胞的活力达到了最高(图2A)。因此，本发明选取40和80μg/mL进行后续的细胞实验。

[0105] 本发明在经过乙醇分级沉淀后，共获取AG‑30(7.15％)、AG‑40(65.06％)、AG‑50(23.04％)、AG‑60(3.26％)、AG‑70(1.00％)和AG‑80(0.49％)六个组分的多糖(简称AG30、AG40、AG50、AG60、AG70、AG80)。对LPS致IEC‑6细胞炎症模型进行干预。通过CCK8检测结果可以看出，AG‑40组分在40和80μg/mL的浓度下都能减少IEC‑6细胞因LPS导致的细胞死亡(图2B‑C)。同时，本发明结合各个组分的含量最终选取AG‑40组分进行后续的分离实验。

[0106] AG‑40在经过DEAE‑52纤维素柱分离后，本发明共检测到三个组分。本发明对含量较高的两个组分(AG‑40‑I和AG‑40‑II)进行了收集。根据两个多糖组分对LPS致IEC‑6细胞炎症实验的干预结果分析，AG‑40‑I在40和80μg/mL时对IEC‑6细胞的保护能力强于AG‑40‑II。因此，本发明对AG‑40‑I进一步的分离。最终，利用Superose 12葡聚糖凝胶柱分离获取了均一的组分AG‑40‑I‑II(图2D)。

[0107] 2.3AG‑40‑I‑II的结构表征

[0108] 2.3.1分子量及均一性

[0109] 通过HPGPC测定AG‑40‑I‑II的分子量和均一性，证明AG‑40‑I‑II是分子量为16.8kDa的均一多糖(图3A)。

[0110] 2.3.2单糖组成

[0111] 粗多糖和AG‑40‑I‑II单糖组成分析的HPLC色谱结果如图3B‑D所示。上述结果表明，粗多糖主要由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。AG‑40‑I‑II主要由半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成，摩尔比为12.5:1:0.05。

[0112] 2.3.3红外及紫外光谱

[0113] 从FT‑IR分析结果(图4A)来看，3350cm‑1处的独特宽带是由于‑OH的振动造成的。‑1 ‑1
2910cm 处的弱带是由‑CH的伸缩振动引起的。1650cm 处的弱峰是由于C＝O的不对称伸缩‑1 ‑1 ‑1
振动峰造成的。1450cm 附近的强吸收峰表明‑CH的振动。同时，1300cm 至1000cm 的吸收‑1 ‑1
峰是C‑O的伸缩振动峰。1100cm 处的弱峰归属于C‑O‑C伸缩振动峰。同时，1050cm 处的吸‑1
收峰证明了吡喃糖的存在。1744cm 处无吸收峰，证明不存在葡萄糖醛酸。上述结果也证明了AG‑40‑I‑II为中性多糖。

[0114] 在紫外光谱中(图4B)，260nm和280nm处没有核酸和蛋白质吸收峰，证明AG‑40‑I‑II没有与其他物质结合。

[0115] 2.3.4甲基化分析

[0116] 多糖经过甲基化后，通过水解、还原和衍生化，GC‑MS检测到多糖的完全甲基化产物。测试结果如表1和图5所示。

[0117] 表1多糖AG‑40‑I‑II的连接片段分析

[0118] PMAA Linkage pattern Major mass fragments(m/z) Ratio(％)2,3,5‑Me3‑Araf Araf‑(1→ 81,97,111,123,151,165 11.88
2,3,6‑Me3‑Glcp →4)‑Glcp‑(1→ 83,101,112,129,147,178,207 6.65
2,4,6‑Me3‑Galp →3)‑Galp‑(1→ 85,95,109,124,151 64.12
2,4‑Me2‑Galp →3,6)‑Galp‑(1→ 81,97,109,123,137,165,205 17.35

[0119] 2.3.5NMR分析

[0120] 根据13C NMR结果，本发明在δ160‑190ppm内没有观察到明显的糖醛酸特征化学位移信号，证明多糖是中性多糖。该结果与单糖组成及FT‑IR光谱分析结果一致。同时，在碳谱100‑110ppm异头碳信号区域，在103.36、103.60和103.73ppm处发现了3个明显的特征信号，
1
证实了3个单糖基团的存在，这与单糖组成分析结果相对应。多糖的H NMR谱包含三个可观察到的异头氢信号，分别为δ4.74、4.56和4.31ppm，其中4.31ppm处的异头氢信号最明显。异头氢化学位移值小于δ5.00ppm，表明多糖糖基具有β‑构型糖苷键。同时，组合碳谱的三个信号均大于101ppm，这也证实了多糖物质的主要构成单元具有β构型残基。

[0121] 根据HSQC谱，发现异头氢(H1)/异头碳(C1)信号δ4.35/103.12、4.58/103.61、4.75/103.60ppm彼此对应，且δ4.35/103.12的单糖残基信号最强，证明其含量最高，该单糖残基是该多糖的主要结构。而δ4.75/103.60ppm最弱，证明其含量最少。根据以上结果，推测其组成为：→3)‑β‑Gal‑(1→3，及少量→4)‑β‑Glc‑(1→4和D‑β‑Araf‑(1→(表2)。

[0122] 表2单糖的H和C NMR化学位移

[0123]Residues H1 C1
→3)‑β‑Gal‑(1 4.35 103.12
→4)‑β‑Glc‑(1 4.75 103.60
D‑arabinoseβ‑Araf‑(1→ 4.58 103.61

[0124] 通过分析HSQC、HMBC和1H‑1H COSY的二维NMR谱，结合1H和13C NMR谱，可以确定化学1 1
位移。半乳糖残基的异头氢和异头碳信号的化学位移为δ4.35/103.12ppm。在H‑H COSY谱中，可以发现δ4.41/3.46ppm相关信号是H1/H2信号。通过HSQC谱图，可以找到δ3.43/
1 1
70.34ppm的相关信息，进而确定该单糖残基的C2化学位移为70.34ppm。然后，通过 H‑ H COSY谱发现与H2相关的H3的化学位移为3.61ppm，并且在HSQC中发现与H3对应的C3的化学位移为74.74ppm。分析发现单糖残基的H4/C4、H5/C5和H6/C6的化学位移分别为3.81/
73.27、3.55/72.30和3.67/60.55。根据HMBC谱图，测试结果显示4.34/68.87异头氢与C‑4位之间存在较强的干扰，证实了半乳糖异头位与糖残基C‑4位之间的联系是主要成分。同时，有一小部分与葡萄糖糖残基的C‑3碳相连，HMBC谱中的信号强度证实了该位置的糖苷构成了多糖的主要结构。同时，HMBC谱图中的4.48/103.12ppm构成了分子之间的另一个连接，它是上面主链的侧链部分，被证实是β‑半乳糖C‑6和阿拉伯糖异头物链接之间的链接。

[0125] AG‑40‑I‑II(以下称为AG)的结构如图6所示。根据单糖组成、FT‑IR光谱分析、甲基化分析和NMR分析结果，该多糖为AG‑Ⅱ型多糖。

[0126] 本实施例从落叶松中提取了一种粗多糖，并通过乙醇分级沉淀获取不同的多糖组分。根据不同多糖组分对LPS致IEC‑6细胞炎症的保护作用，利用DEAE‑52纤维素柱联合Superose12葡聚糖凝胶柱对其进行分离纯化。最终，对获取的多糖进行物理和化学结构的表征，确定其为AG‑II型的多糖。

[0127] 实施例2硫酸化阿拉伯半乳聚糖的制备及结构鉴定

[0128] 多糖的硫酸化改性有多种方法，如氯磺酸‑吡啶法、SO3‑吡啶法、浓硫酸法等。其中，氯磺酸法因其高得率和DS而被广泛应用。DS和分子量(Mw)是影响硫酸化多糖生物活性的关键因素，并且两者都受到所使用的硫酸化方法的影响。不同的硫酸化方法在不同的位置连接硫酸基团，产生不同类型的硫酸化多糖。硫酸基团的衍生化改变了天然多糖的结构，这些结构变化影响其生物活性。

[0129] 本实施例采用氯磺酸法和浓硫酸法制备硫酸化阿拉伯半乳聚糖(SAG)，根据DS和得率的不同确定硫酸化的具体方法(选取用DMF作为多糖的溶剂，以氯磺酸和吡啶作为酯化试剂进行磺化反应)。同时，对获取的SAG使用Superose 12葡聚糖凝胶柱进行分离，获取均一的SAG，并对硫酸化阿拉伯半乳聚糖的结构表征。

[0130] 1.方法

[0131] 1.1硫酸化阿拉伯半乳聚糖的具体制备方法：

[0132] 300mg多糖样品(AG‑40‑I‑II)加入25mL DMF室温搅拌，使其完全溶解。量取无水吡啶12mL，冰水浴冷却。逐滴加入氯磺酸3mL，得到浅黄色的酯化试剂。将多糖DMF溶液加入到酯化试剂，在50℃下反应1h，加入2.5mol/L的NaOH溶液中和，调节pH至7.0。加入无水乙醇使多糖沉淀，离心收集沉淀，透析后冻干，获取SAG，得率：65.24％，DS：0.53％。

[0133] 之后对获取的粗SAG用Superose 12葡聚糖凝胶柱进行纯化，收集含量最高组分用以后续的实验(见图7)。

[0134] 1.2参照实施例1的方法对硫酸化阿拉伯半乳聚糖的结构表征。

[0135] 2.实验结果

[0136] 2.1硫酸化阿拉伯半乳聚糖的结构表征

[0137] 2.1.1分子量及均一性测定

[0138] 根据HPGPC的结果，确定SAG的分子量为17.9kDa。此外，SAG的洗脱曲线呈现对称性可以观察出SAG为均一多糖。

[0139] 2.1.2单糖组成分析

[0140] SAG经酸水解后，经HPLC检测，SAG由半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成，摩尔比为6.7:1:0.3。通过对比AG与SAG的分子量大小、单糖组成及比例，推测可能在硫酸化修饰过程中导致AG多糖链中的主链被分解，导致半乳糖的比例出现降低的情况。

[0141] 2.1.3红外及紫外光谱

[0142] 硫酸化后，3450cm‑1处的‑OH伸缩振动峰和2920cm‑1处的‑CH伸缩振动峰均发生蓝‑1移。‑SO4伸缩振动峰出现在1260cm 处。以上结果证明硫酸化是成功的。

[0143] 在紫外光谱中，260nm和280nm处没有核酸和蛋白质吸收峰，证明SAG没有与核酸和蛋白质结合。

[0144] 2.1.4NMR分析

[0145] 本发明通过与AG的NMR进行对比，SAG的13C NMR出现了变化。根据13C的一些论文中13
硫酸化多糖的NMR数据，在 C NMR光谱中出现了一个81.49ppm的信号，表明SAG羟基的一部
13
分被化学转化为硫酸基团。C的信号强度在约66‑67ppm时显著增加，也可以表明SAG的伯羟基被硫酸化。本发明根据对比发现新出现在70.66、70.24和69.19ppm处的异头碳的信号可能也是受到硫酸基团引入影响的。因此，推测SAG的伯羟基被化学转化为硫酸基团(具体结构见图6)。

[0146] 实施例3阿拉伯半乳聚糖及其衍生物对急性结肠炎的治疗作用

[0147] 本实施例利用实施例1获取的阿拉伯半乳聚糖(AG)和实施例2获取的硫酸化阿拉伯半乳聚糖(SAG)对DSS诱导的IBD小鼠进行干预，初步探究AG、SAG对IBD小鼠影响。

[0148] 1.材料与方法

[0149] 1.1主要试剂

[0150] 硫酸葡聚糖钠盐购自南京都莱生物科技有限公司；粪便潜血定性检测试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；白介素‑1β试剂盒、白介素‑10试剂盒、肿瘤坏死因子‑α试剂盒、脂多糖试剂盒、苏木素、伊红购自南京建成生物工程研究所；阿利新蓝8GX、核固红购自上海麦克林生化科技股份有限公司；一抗：Mucin‑2、ZO‑1、Occludin、TLR4、MyD88、IκBα、p‑IκBα、NF‑κB、p‑NF‑κB、NLRP3、ACS、Caspase1、IL‑1β和β‑actin，二抗：兔抗鼠均购自武汉三鹰生物技术有限公司；超敏ECL化学发光试剂盒购自广州赛国生物科技有限公司。

[0151] 1.2DSS致小鼠急性结肠炎模型的建立

[0152] 8周龄雄性ICR小鼠(体重18‑21g)，购自长春亿思实验动物有限公司，质量证书编号：SCXK(JI)‑2016‑0003(中国长春)。小鼠在12h明暗循环下适应性喂养一周。所有动物处理和实验程序均按照吉林农业大学实验动物伦理委员会批准进行。

[0153] 将雄性ICR小鼠随机分组，每组8只。Normal组：给予正常水，用0.9％生理盐水连续灌胃7天。DSS组：给予3.5％ DSS水溶液，用0.9％生理盐水连续灌胃7天。给药组：给予3.5％ DSS水溶液，拟将受试化合物分3个剂量组(AG 400mg/kg、SAG 200mg/kg、SAG 400mg/kg)，连续灌胃7天。单独处理组：给予正常水，连续灌胃400mg/kg SAG 7天。收集小鼠的粪便用于肠道微生物的测定和短链脂肪酸含量的测定。实验完成后，通过眼眶静脉采集血液并解剖。将收集到的小鼠血清以3000rap/min离心2次取其上清液，每次10分钟，并将血清保存在‑80℃的超低温冰箱中直至检测。同时，取小鼠结肠部位并拍照，记录各组结肠的长度。将结肠固定在10％中性福尔马林缓冲液中并包埋在石蜡中和包在锡纸中放液氮快速冷冻并储存在‑80℃中用于后续的实验检测。

[0154] 1.3疾病活动指数评分(DAI)

[0155] DAI根据每只小鼠的体重减轻程度、粪便稠度和粪便隐血指数确定。使用隐血指数测定试剂盒中提供的说明测量小鼠粪便中的隐血指数。

[0156] 1.4生化指标检测

[0157] 按照TNF‑α、IL‑1β、IL‑10的ELISA试剂盒提供的说明书，将供试品溶液、标准溶液、显色试剂依次加入ELISA板中。最后加入终止液，在15min内用酶标仪在450nm处测定各种OD值，计算结果以确定TNF‑α、IL‑1β和IL‑10的含量。同时采用试剂盒检测血清中LPS的含量和结肠组织匀浆中髓过氧化物酶(MPO)的含量。

[0158] 1.5组织形态学染色

[0159] 组织病理学染色：为了评估结肠组织的病理学变化，确定使用H&E和阿利新蓝染色分析。取出固定在中性福尔马林缓冲液中的结肠组织，经过常规处理(梯度乙醇脱水和二甲苯透化)，将结肠组织包埋在石蜡中。待蜡块冷却后，将蜡块在旋转切片机(Leica,RM2235,Solms,Germany)上切成5μm厚的切片。然后，切片用H&E和阿利新蓝染色试剂盒进行染色，并使用光学显微镜(Leica,DM750,Solms,Germany)检查结肠组织的病理变化情况。

[0160] 免疫荧光染色：将厚度为5μm的结肠组织切片去除石蜡并重新水化。将切片置于柠檬酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH 6.0)中进行抗原修复20min后并用PBS缓冲液洗涤3次。然后，将其与3％牛血清蛋白(BSA)孵育30min以防止非特异性染色。吸去多余液体后，将一抗滴在结肠组织切片上，孵育过夜。第二天，用PBS洗涤3次后，在黑暗条件下将切片与荧光二抗孵育1h。之后，去除二抗用PBS洗涤3次，每次10min。最后使用Leica显微镜(Leica,TCS SP8,Solms,Germany)进行拍摄。

[0161] 免疫组化染色：将厚度为5μm的结肠组织切片去除石蜡并重新水化。将切片置于柠檬酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH 6.0)中进行抗原修复20min后并用PBS缓冲液洗涤3次。然后，将其与3％牛血清蛋白(BSA)孵育30min以防止非特异性染色。吸去多余液体后，将一抗滴在结肠组织切片上，孵育过夜。第二天，用PBS洗涤3次后，在黑暗条件下将切片与二抗孵育1h。之后，去除二抗用PBS洗涤3次，每次10min。最后使用Leica显微镜(Leica,TCS SP8,Solms,Germany)进行拍摄。

[0162] 1.6蛋白质印迹分析

[0163] 结肠组织用RIPA Lysis Buffer溶解后，在垂直电泳仪上用10％或12％ SDS‑PAGE凝胶分离等量的蛋白质，并转移至PVDF膜(0.22μm)上。目的条带用5％脱脂奶封闭2.5h，并与特异性一抗孵育2h。然后用TBS·T(TBS+0.4％Tween‑20)洗膜3次，HRP标记二抗室温孵育1.5h。蛋白质在凝胶成像系统中可视化，并通过Image‑Pro plus 6.0软件计算蛋白的灰度值。

[0164] 1.7短链脂肪酸的测定

[0165] 取盲肠内容物适量，加入2mL溶液(1:3磷酸水溶液)，混匀后用2mL乙醚提取，低温离心20min(4000rpm/min)。再次用乙醚萃取，合并并稀释至2mL，进行GC‑MS分析。按公式W＝(C‑C0)×V×N/m计算。(W：短链脂肪酸含量；C：供试品溶液中短链脂肪酸浓度；C0：对照品中目标物质浓度；V：定容体积；N：稀释倍数；m：重量的样本)。

[0166] 1.8肠道微生物测定

[0167] 通过16S rRNA测序收集、合并和处理盲肠内容物。本发明使用Illumina MiSeq对物种16S核糖体RNA基因的V3‑V4区域进行了测序。通过对原始数据进行聚类分析，按照丰度对序列进行排序，规定相似度97％下得到的OUT单元视为一个物种。经过Silva(Release 132，https://www.arb‑silva.de/)数据库分类和注释后，使用基因云平台(https://www.genescloud.cn/home)对结果进行分析。

[0168] 1.9统计分析

[0169] 所有数据均表示为在不同实验中建立的平均值±标准差(平均值±SD)，并通过单向方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后检验进行分析。用。统计图由GraphPad Prism 8.0.2软件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)生成。p＜0.05或0.01被认为具有统计学意义。

[0170] 2实验结果

[0171] 2.1AG和SAG减轻DSS诱导的小鼠结肠炎

[0172] DAI评分和结肠长度直接反映动物模型中IBD的严重程度，通常用于初步评估结肠炎的严重程度。给予ICR小鼠AG(400mg/kg)和SAG(200mg/kg和400mg/kg)。

[0173] 第8‑17天各组小鼠的DAI评分和体重如图9A‑B所示。DAI评分标准按表3进行。小鼠饮用DSS后，模型组小鼠体重呈现明显下降趋势，并在接下来的几天内持续下降，并伴有严重的小鼠腹泻和大便出血。与DSS组相比，其他组小鼠的体重和DAI指数有显著差异。给小鼠AG和不同剂量的SAG后，体重减轻、腹泻、便血症状均有不同程度的缓解。

[0174] 表3DAI评分标准

[0175]

[0176]

[0177] 本发明还观察了不同组小鼠的结肠状况。对照组和SAG400组小鼠结肠未见明显水肿，但模型组小鼠结肠长度明显缩短并出现水肿。给小鼠注射不同剂量的AG后，结肠长度增加，水肿减轻。上述结果表明AG和SAG可以显著缓解IBD，并且SAG的治疗效果优于AG。

[0178] 2.2AG和SAG降低促炎细胞因子的水平并抑制炎症细胞向结肠的浸润

[0179] 细胞因子主要由淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和上皮细胞产生，具有促炎作用，如TNF‑α和IL‑1β，或具有抗炎作用，如IL‑10。健康个体中的细胞因子处于稳态，在免疫调节、组织修复、肠道屏障功能和肠道稳态中发挥关键作用。小鼠在DSS干预后，IL‑1β、TNF‑α和IL‑10的表达水平显著升高，且AG和SAG能够显著抑制促炎因子IL‑1β和TNF‑α的产生。当炎症发生时，机体会产生IL‑10抗炎因子来抵抗炎症反应。与对照组相比，DSS组IL‑10表达增加，且经AG和SAG处理后，IL‑10水平显著上调来抑制炎症的发生(图10A‑C)。

[0180] 当小鼠发生结肠炎时，血液中的LPS(脂多糖)会增加，增加的LPS会不断刺激免疫系统，加剧炎症反应。为了进一步研究AG和SAG对DSS诱导的结肠炎的作用，检测了小鼠血液中LPS的浓度。与对照组相比，DSS组LPS浓度显著升高，给予小鼠AG和SAG后LPS浓度降低(图10D)。

[0181] MPO(过氧化物酶)的水平反映了结肠炎诱导后结肠组织中中性粒细胞的浸润情况。与对照组相比，DSS组小鼠结肠组织匀浆中MPO含量升高，给予AG和SAG后MPO含量降低(图10E)。

[0182] DSS处理的小鼠结肠组织中肠上皮细胞被侵蚀，从而增加结肠粘膜通透性。为了直观的表现各组小鼠结肠损伤情况，本发明对H&E染色进行评分(表4)。H&E染色显示模型组小鼠结肠组织肠壁水肿加重，隐窝结构变形或消失，杯状细胞破坏或消失(图11A‑B)。与DSS组相比，在AG和SAG治疗后，上述结肠组织的损伤有所减轻。SAG400组小鼠结肠组织状况与对照组相似，可以证明SAG对小鼠结肠组织没有损伤。

[0183] 结合细胞因子的表达情况和结肠组织的损伤情况可以看出，AG和SAG均可以减轻DSS带来的结肠损伤，并且同剂量下，SAG的治疗效果优于AG。

[0184] 表4H&E染色的评分标准

[0185]

[0186]

[0187] 2.3AG和SAG增加结肠组织肠粘膜厚度并促进Mucin‑2蛋白表达

[0188] 使用阿尔新蓝(AB)染色观察结肠粘膜以确定从近端结肠到直肠的粘液层的厚度。在图12A中，可以观察到与对照组相比，DSS组结肠杯状细胞数量的减少并且粘液层变薄。与DSS组相比，AG和SAG可促进结肠杯状细胞的分化形成，促进杯状细胞合成粘液，增加结肠粘液层厚度，增加结肠上皮细胞的覆盖范围。同时，单独使用SAG处理的小鼠对结肠组织影响不大，其粘液层厚度与对照组一致。Mucin‑2是杯状细胞分泌到大肠腔内的主要粘蛋白。通过Mucin‑2免疫荧光染色评估粘液层厚度、杯状细胞数量和粘液分泌功能(图12B‑C)。AG和SAG可显著增加粘液层厚度，改善DSS引起的杯状细胞数量减少。

[0189] 根据对结肠粘液层厚度的评价可以观察到，AG和SAG均能改善因DSS引起的粘液层厚度减少，并且促进Muc‑2蛋白的表达。SAG的治疗效果优于同剂量下AG的治疗效果。同时，SAG400组并没有对粘液层厚度产生影响，可见SAG对小鼠结肠没有产生不利影响。

[0190] 2.4AG和SAG促进结肠组织中TJ蛋白的表达

[0191] TJ蛋白作为肠道屏障的重要组成部分，具有降低肠道通透性、阻止肠粘膜吸收LPS等外源物质的作用。在DSS诱导小鼠结肠炎期间，肠道通透性发生显着改变，TJ蛋白变得尤为重要。在DSS处理的结肠组织中，TJ蛋白ZO‑1和Occludin的表达显着降低。然而，给小鼠AG和SAG干预后，ZO‑1和Occludin的表达显示出改善并呈现增加趋势(图13A‑B)。

[0192] 2.5AG和SAG对结肠组织TLR4/MyD88/NF‑κB信号通路和NLPR3炎性体及PPARγ的影响

[0193] 通过Western blot检测NF‑κB信号通路中相关蛋白的表达，探讨炎症水平变化的机制。在DSS干预小鼠后，通过与TLR4识别刺激MyD88从而增加其下游蛋白p‑IκB‑α/IκB‑α和p‑NF‑κB/NF‑κB的表达(图14A‑E)。在给予小鼠AG和SAG后，能够抑制TLR4和MyD88的表达，从而降低p‑IκB‑α/IκB‑α和p‑NF‑κB/NF‑κB的表达。与对照组相比，SAG 400组中TLR4、MyD88、p‑IκB‑α/IκB‑α和p‑NF‑κB/NF‑κB的蛋白表达量几乎没有明显变化。

[0194] Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体是一种位于细胞内的蛋白复合物，可以调节机体的炎症反应。结果表明，在DSS干预后，能够刺激NLRP3和ASC的表达，从而显著增加其下游蛋白Caspase 1和IL‑1β的表达，引起炎症反应。在给予小鼠AG和SAG治疗后，能够抑制NLRP3和ASC的表达，从而减少对Caspase 1和IL‑1β的刺激，降低炎症反应的发生。在SAG 400对正常小鼠进行干预后，并没有对NLRP3、ASC、Caspase 1和IL‑1β蛋白的表达产生影响(见图15)。

[0195] 有报道PPARγ在急性结肠炎模型中发挥良好的抗炎作用。结果表明，与对照组相比，DSS组中PPARγ的表达显著降低，并且通过给予AG和SAG可以显著增加PPARγ的表达水平。同时，本发明发现SAG 400组与对照组相比PPARγ的表达水平增加(图16A‑B)。

[0196] 2.6AG和SAG促进短链脂肪酸的代谢

[0197] 众所周知，短链脂肪酸(尤其是乙酸盐、丁酸盐和丙酸盐)是肠道微生物的主要代谢产物。目前，越来越多的报道证实了SCFAs在免疫调节中的作用。本发明采用GC‑MS检测小鼠粪便中SCFAs的含量。研究结果发现，在DSS干预后，小鼠的盲肠内容物的SCFAs代谢减少。通过AG和SAG治疗后，能够促进小鼠盲肠内容物中SCFAs的量。在SAG 400组中，小鼠能够产生更多的乙酸盐和丁酸盐。重要的是，有研究已经证明丁酸盐有助于治疗急性结肠炎。由此可见，AG和SAG能够改善小鼠SCFAs的代谢，从而改善DSS诱导的小鼠急性结肠炎。

[0198] 2.7AG和SAG改变了小鼠肠道微生物的物种分类和丰度

[0199] 在DSS干预后，OUT数量呈现降低的趋势，证明DSS在一定程度上降低了肠道微生物的多样性。利用物种组成热图对各组肠道微生物的组成进一步分析，DSS的干预改变了正常小鼠的肠道微生物群，并且在AG和SAG的调节下，逐步趋向于正常小鼠的肠道微生物群。

[0200] 为了更加清晰的分析AG和SAG对小鼠肠道微生物的影响，本发明对肠道微生物在门、属水平的相对丰度进行了评价。在门水平上，DSS干预后改变小鼠的肠道微生物，降低了Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度。在AG和SAG的干预后，增加了Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度(图17A‑C)。在属水平，DSS干预后降低了Allobaculum和
Lactobacillus的相对丰度。在AG和SAG干预后改变这一趋势，增加了Allobaculum和
Lactobacillus的相对丰度(图17D‑F)。

[0201] 2.8AG和SAG对DSS诱导的小鼠肠道微生物多样性的影响

[0202] 对各组肠道微生物的α多样性指数进行分析，并制作相应的稀释曲线。结果，各组样品的稀疏曲线随测量深度的增加呈现出首先上升后趋平的趋势，表明所测样品种类的多样性、丰富度和均匀性较好。Simpson指数和Shannon指数用来评价微生物的多样性，其指数越大，多样性越高；Chao1指数估计样本中包含的OTU数量。Chao1指数越大，样本中含有的物种越多，而Goods‑Coverage指数则代表样本中微生物的真实情况。本发明结果表明，对照组小鼠肠道菌群的Simpson、Shannon和Chao1指数与DSS组小鼠相比发生了变化，表明DSS组小鼠肠道微生物的多样性和丰度已经被影响。在AG和SAG进行治疗后，各项指标均受到了影响，表明AG和SAG可以影响肠道微生物的多样性。同时，在AG和SAG干预后，Goods‑Coverage指数的增加也能充分证明数据的可信度。

[0203] 为了进一步揭示样品间菌群多样性的差异，采用主坐标分析(PCoA)来比较样品间的差异。第一主坐标(PCoA1)和第二主坐标(PCoA2)分别为15.5％和9.3％(图18A)。通过PCA分析可以观察到在DSS干预后，肠道微生物与对照组小鼠呈现出离散的趋势。在经过AG和SAG治疗后，与DSS组肠道微生物出现了离散，证明AG和SAG能够调节因DSS引起的肠道微生物改变。重要的是，AG和SAG的治疗对肠道微生物的改变并没有与正常小鼠的肠道微生物一致。同时，SAG 400组并没有出现与Control组改变的结果，证明SAG并没有改变正常小鼠的肠道微生物组成。

[0204] UPGMA层次聚类可以直观地显示不同样品中微生物的差异程度(图18B)。DSS组与对照组的距离表明，DSS干预的肠道微生物与对照组有显著差异，肠道菌群结构也发生了变化。给予AG和SAG后与DSS组出现了分离，说明AG和SAG有助于调节DSS诱导结肠炎小鼠肠道微生物结构和组成的变化。通过组间差异分析(图18C‑D)，经过DSS处理后的小鼠肠道微生物群与对照组出现了差异。AG和SAG对小鼠治疗后，与DSS组出现了差异。

[0205] 上述结果证明，AG和SAG能够调节因DSS对肠道微生物带来的改变。SAG400组与对照组进行对比，肠道微生物发生了改变。可见，SAG能够调节正常小鼠的肠道微生物。

[0206] 2.9AG和SAG对DSS诱导结肠炎小鼠肠道菌群的物种差异分析

[0207] 为了进一步分析AG和SAG对肠道微生物的影响，本发明在门、属水平上对不同组之间的差异进行分析，发现DSS干预后与Control组小鼠的肠道微生物发生了分离。在低剂量SAG的干预下，与DSS组小鼠的肠道微生物部分接近，但是已经出现了远离的趋势。在高剂量AG和SAG的干预下，与DSS组小鼠的肠道微生物几乎无接近部分，使肠道微生物发生很大的变化。SAG对正常小鼠的干预结果可以观察到，SAG能够使小鼠的肠道微生物发生轻微的变化，与β多样性的结果一致。

[0208] 根据对肠道微生物的结果分析，在DSS干预后能够改变小鼠肠道微生物的组成和相关丰度。利用AG和SAG进行干预的过程中，可以改变因DSS引起的肠道微生物变化，向恢复正常肠道微生物稳态的方向发展。

[0209] 实施例4SAG对肠道微生物的调节、分离

[0210] 1.材料与方法

[0211] 1.1小鼠粪便取自实施例3中的小鼠粪便(SAG治疗DSS诱导急性结肠炎小鼠粪便)。

[0212] 1.2主要试剂

[0213] MRS固体培养基、MRS液体培养基购自南京都莱生物科技有限公司；革兰氏染液购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；人工胃液、人工肠液购自上海源叶生物科技有限公司。

[0214] 1.3肠道微生物的分离步骤如下：

[0215] 选取MRS培养基对乳杆菌进行分离，将MRS液体培养基和固体培养基配置后，使用高压蒸汽灭菌锅进行高压灭菌后，将小鼠粪便放置于MRS液体培养基中。将MRS液体培养基置于37℃培养箱中培养24h，之后转移到更大的锥形瓶内进行扩大培养。取培养液并进行逐步稀释，将培养液划线接种于MRS固体培养基，倒置平板，37℃培养24h。使用接种环挑取单菌落再次接种到MRS液体培养基，37℃培养24h后，划线接种于MRS固体培养基，直至确保MRS固体培养基内均为单菌落。挑取最终的单菌落培养。

[0216] 1.4菌种的鉴定

[0217] 1.4.1平板形态

[0218] 取液体培养基中的菌液划线接种于固体培养基表面，倒置平板，37℃培养24h后观察菌落形态。

[0219] 1.4.2革兰氏染色

[0220] 取培养24h后的液体菌液进行革兰氏染色，革兰氏染色步骤按照海博革兰氏染色说明书进行。染色结束后使用油镜进行观察。

[0221] 1.4.3扫描电子显微镜观察

[0222] 取培养24h的液体菌液以6000r/min离心5min，用无菌PBS清洗三次后收集菌泥，加入2.5％戊二醛固定液，4℃避光固定12h后除去戊二醛，使用无菌PBS清洗三次，使用30％、50％、70％、90％和100％乙醇各洗脱15min，洗脱后的菌泥冻干后置于扫描电镜下观察。

[0223] 1.4.4 16S rDNA测序

[0224] 取适量菌体溶于50μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(CodeNo.D304)中变性后离心取上清作为模板(Template DNA)。使用2×TransHigh Fidelity(HiFi)PCR SuperMix I(TransGen Biotech，Code No：AS131)，进行PCR扩增目的片段。使用DNA测序仪进行测序。利用BLAST功能组件将测得的基因序列与Genebank数据库中16S rDNA序列进行同源性比较。

[0225] 1.5耐胃液能力测定

[0226] 将菌液涂布接种于固体培养基中，倒置培养24h，计算菌落数量。将菌液与人工胃液在37℃下培养3h后，涂布接种于固体培养基内，倒置培养24h。根据菌落数量计算菌种的耐胃液能力。

[0227] 1.6耐肠液能力测定

[0228] 吸取在胃液中培养三小时的菌液与人工肠液共培养，在4h和8h时涂布接种于固体培养基内，倒置培养24h。根据菌落数量计算菌种的耐肠液能力。

[0229] 2.实验结果

[0230] 2.1菌种的鉴定

[0231] 本发明通过MRS培养基筛选，共分离获取了两种菌。根据16S rDNA测序结果得出分别为Limosilactobacillus reuteri strain HDB1243和Lactobacillus johnsonii strain 1696，均为乳杆菌。通过平板观察形态可以发现，Limosilactobacillus reuteri strain HDB1243表面光滑、圆形、乳白色、边缘整齐、中间凸起的单菌落，Lactobacillus johnsonii strain 1696则为表面光滑、圆形、半透明、边缘整齐、四周凸起的单菌落。通过革兰氏染色可以看出，两种菌均为革兰氏阴性细菌。扫描电子显微镜观察到
Limosilactobacillus reuteri strain HDB1243为短杆状的结构，无鞭毛，无芽孢；
Lactobacillus johnsonii strain 1696为杆状结构，较Limosilactobacillus reuteri strain HDB1243长，无鞭毛，无芽孢。

[0232] 表5菌种的16S rDNA测序

[0233]

[0234] 2.2耐肠液能力

[0235] 药物进入消化系统，在肠道中经过的时间大约为8h。从在人工胃液中培养的菌液吸取放置于人工肠液中，在37℃下继续培养。Limosilactobacillus reuteri strain HDB1243和Lactobacillus johnsonii strain 1696在人工肠液中培养4和8h后涂布接种仍然能够存活。在4h时Limosilactobacillus reuteri strain HDB1243的存活率为96.9％，Lactobacillus johnsonii strain1696的存活率为78.4％。在8h时Limosilactobacillus reuteri strain HDB1243的存活率为28.9％，Lactobacillus johnsonii strain 1696的存活率为42.5％(证明两株菌可以顺利通过胃肠道系统达到结肠部位)。可见，两株菌能够耐受胃液与肠液的环境进入到结肠，在结肠部位发挥作用的的潜能。

[0236] 实施例5硫酸化阿拉伯半乳聚糖对结肠癌的治疗作用

[0237] 1.材料与方法

[0238] 1.1实验材料

[0239] SAG选自实施例2制备的多糖，Limosilactobacillus reuteri strain HDB1243和Lactobacillus johnsonii strain 1696选自实施例4分离的肠道菌。

[0240] 1.2DSS联合AOM诱导小鼠结肠癌模型的建立

[0241] 建立小鼠结肠癌模型：将雄性ICR小鼠随机分组，每组14只。Control组：用0.9％生理盐水连续灌胃，给予正常水。DSS/AOM组：腹腔注射10mg/mL AOM，并给予2％ DSS水溶液7天，给予正常水14天为一个周期，共造模3个周期。用0.9％生理盐水连续灌胃。给药组：连续给药(SAG/肠道菌)连续灌胃，并造模三个周期。收集小鼠的粪便用于肠道微生物的测定。实验完成后，通过眼眶静脉取血并解剖。将收集到的小鼠血液以3000rpm/min离心2次取上清液，每次10min，血清用于生化指标检测。同时，取小鼠结肠部位并拍照。将结肠固定在10％中性福尔马林缓冲液并包埋在石蜡中，或包在锡纸中放于液氮快速冷冻并储存在‑80℃中。

[0242] 1.3生化指标检测

[0243] 对小鼠的TNF‑α、IL‑1β、GSH、MDA和铁含量进行检测。具体操作参照实施例3的方法。

[0244] 1.4组织形态学染色

[0245] 组织病理学染色和免疫组化染色见实施例3的方法。

[0246] TUNEL染色：将组织切片除蜡后加入蛋白酶K溶液，室温水解15min，去除组织蛋白。使用含2％过氧化氢的PBS，室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。除去载玻片上多余液体，滴加2滴TdT酶缓冲液，置于室温1～5min。用滤纸吸去多余液体，在切片上滴加54μL TdT酶反应液，置湿盒中于37℃反应1h。加入洗涤与终止反应缓冲液，于37℃终止30min。滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。滴加新鲜配制的0.05％ DAB溶液，室温显色3～6min。室温用甲基绿进行复染10min。封片、干燥后，在光学显微镜下观察。

[0247] ROS染色：将厚度为5μm的结肠组织切片去除石蜡并重新水化。按照1:1000稀释DCFH‑DA，终浓度为10μmol/L，加入适当体积稀释的DCFH‑DA工作液。清洗去除未进入组织内的DCFH‑DA，封片干燥后使用激光共聚焦显微镜直接观察。

[0248] 1.5透射电子显微镜分析

[0249] 取小鼠新鲜结肠组织，尽量减小牵拉、挫伤与挤压等机械损伤，组织体积一般不超过2mm×2mm×2mm，迅速放入电镜固定液4℃固定2～4h。组织使用0.1mol/L的PBS(pH＝7.4)漂洗3次，每次15min；然后使用1％的锇酸0.1mol/L的PBS在室温下固定2h，继续用0.1mol/L的PBS缓冲液中漂洗3次，每次15min；最后，组织依次放入50％‑70％‑80％‑90％‑95％‑100％‑100％乙醇‑100％丙酮‑100％丙酮中进行脱水，每次15min。在脱水完成后，组织在丙酮:812包埋剂＝1:1的条件下渗透2～4h。初次渗透完成后，再将组织放在丙酮:812包埋剂＝1:2的溶液中渗透过夜。之后使用812包埋剂进行组织包埋，5～8h后将812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37℃过夜。第二天，将样品置于60℃聚合48h。包埋完成后，利用超薄切片机切成60～80nm的超薄切片，用2％醋酸铀饱和酒精溶液和枸橼酸铅各染色
15min。染色完成后，切片室温干燥过夜；最后，在透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

[0250] 2.实验结果

[0251] 2.1SAG和肠道菌减轻DSS/AOM联合诱导的小鼠结肠癌

[0252] 在DSS/AOM联合干预的情况下，DSS/AOM组小鼠结肠部位有肿瘤的出现。对不同组小鼠的结肠部位进行了拍照，对比不同组结肠的状态。在经过肠道菌Limosilactobacillus reuteri strain HDB1243、Lactobacillus johnsonii strain 1696(以下称为菌1和菌2)和SAG的长期干预下，能够减少结肠部位肿瘤的数量。并且，在菌1、菌2和SAG的干预下，能够在一定程度上缓解结肠变短的情况(图19)。

[0253] 2.2SAG和肠道菌降低促炎细胞因子的水平并抑制炎症细胞向结肠的浸润

[0254] 在DSS联合AOM的干预下，小鼠血清中的炎症因子TNF‑α和IL‑1β的水平有所升高，在经过菌1、菌2和SAG的长期干预下，能够降低炎症因子的水平(图20A‑B)。同时，通过H&E染色对结肠部位进行观察，DSS/AOM组的小鼠肠绒毛变短，隐窝不明显(图20C)。菌1、菌2和SAG的干预能够改变结肠受损的情况，恢复正常状态。通过检测炎症因子的水平和结肠损伤情况，菌1和菌2都能够与SAG起到抑制炎症发生，减轻炎症损伤。

[0255] 2.3SAG和肠道菌促进结肠肿瘤组织凋亡的发生

[0256] 为了探究菌1、菌2和SAG如何减少结肠部位肿瘤的数量，本发明对结肠肿瘤部位进行了TUNEL染色(图21A‑B)。结果，与DSS/AOM组对比，在菌1、菌2和SAG干预后，均能促进结肠肿瘤部位细胞凋亡的发生。同时，利用WB对结肠肿瘤部位的Bcl‑2和Bax的蛋白表达量进行检测，在菌1、菌2和SAG的干预下，Bcl‑2/Bax蛋白表达量增加(图21C‑D)。可见，菌1、菌2和SAG可能通过促进结肠肿瘤部位细胞凋亡的发生，减少结肠部位的肿瘤数量。

[0257] 2.4SAG和肠道菌激活AMPK‑mTOR从而诱导结肠肿瘤组织自噬的发生

[0258] 本发明通过WB对结肠部位蛋白的AMPK‑mTOR诱导自噬发生的相关蛋白进行检测。结果，在菌1、菌2和SAG的干预下激活AMPK磷酸化，并上调p‑AMPK的表达，通过AMPK‑mTOR抑制mTOR磷酸化表达，进而激活自噬。在自噬发生时，菌1、菌2和SAG上调了自噬标记蛋白LC3、ATG7、ATG3和Beclin‑1的表达水平，自噬底物p62及自噬特异性载体NCOA4水平逐渐下降。上述结果证明菌1、菌2和SAG可以诱导结肠肿瘤组织自噬的发生，并有可能通过NCOA4介导的
2+
铁蛋白自噬，对结肠肿瘤组织内游离Fe 的水平产生影响。因此，菌1、菌2和SAG可能通过促进结肠肿瘤部位自噬的发生，减少肿瘤的数量。

[0259] 2.5SAG和肠道菌诱导结肠肿瘤组织铁死亡的发生

[0260] 前期实验结果可以得出，菌1、菌2和SAG能够促进结肠肿瘤组织部位自噬的发生，2+
减少肿瘤的数量。同时，它们可能通过NCOA4介导的铁蛋白自噬，对结肠肿瘤组织内游离Fe的含量产生影响。因此，本发明对结肠肿瘤组织铁死亡进行检测。

[0261] 2.5.1SAG和肠道菌增加脂质过氧化的程度

[0262] 本发明对结肠肿瘤组织部位进行ROS染色，通过荧光显微镜观察并对比不同组小鼠结肠部位的荧光强度，经过菌1、菌2和SAG的干预下ROS荧光表现出明显增强(图22A、C)。值得注意的是，在经过菌1、菌2和SAG的干预下，结肠组织部位的MDA、GSH含量以及4‑HNE的表达量也得到了明显的增强(图22B、D‑F)。

[0263] ROS在细胞内可以转化为氧自由基，与细胞膜上的多聚不饱和脂肪酸及脂质蛋白等发生脂质过氧化反应导致DNA损伤，其脂质过氧化产物最终产物主要为丙二醛(MDA)，可引起蛋白质结构和功能的变化，具有一定的生物毒性。MDA的含量可以反映细胞脂质过氧化反应的程度。GSH可以协同GPx4将脂质氧化物转化为脂质醇，减少细胞内脂质氧化物的积累，影响铁死亡的发展过程。可见，GSH的降低会促进铁死亡的发生。4‑HNE是一种由脂肪酸过氧化而产生的有害代谢产物。当细胞发生氧化应激时，脂质过氧化反应会导致脂肪酸产生4‑HNE。因此，菌1、菌2和SAG的长期干预能够增加结肠肿瘤部位脂质过氧化程度。

[0264] 2.5.2SAG和肠道菌能够增加结肠肿瘤组织中Fe2+含量

[0265] 与DSS/AOM组对比，在菌1、菌2和SAG的干预下，能够显著增加小鼠结肠肿瘤组织中2+
Fe 的含量。菌1、菌2和SAG能够减少结肠肿瘤组织中肿瘤的数量，增加脂质过氧化程度以及
2+
Fe 的含量，符合铁死亡的特征。

[0266] 2.5.3SAG和肠道菌改变结肠肿瘤组织超微结构

[0267] 前期的研究证明菌1、菌2和SAG能够诱导结肠肿瘤组织部位铁死亡的发生。通过透射电镜对结肠肿瘤部位的超微结构进行观察，菌1、菌2和SAG的干预能够使细胞中线粒体收缩、线粒体膜破裂，嵴减少或者消失(图23)。这一结果也证明菌1、菌2和SAG能够诱导铁死亡的发生。

[0268] 2.5.4SAG和肠道菌促进结肠肿瘤组织铁代谢相关蛋白的表达

[0269] 本发明对不同组小鼠结肠肿瘤组织的GPx4和ASCL4蛋白进行免疫组化染色。GPx4是一种细胞内硒蛋白抗氧化酶，作为铁死亡重要的调节因子，具有清除脂质过氧化产物、预防氧化应激的能力。GPx4通过消除细胞内脂质过氧化来防止细胞铁死亡的发生。ASCL4是调节脂质成分的关键酶，可促进脂质过氧化的发生，同时ACSL4可促进不饱和脂肪酸的合成，进而促使细胞发生铁死亡。在菌1、菌2和SAG的干预下，结肠肿瘤组织部位GPx4的表达受到抑制，上调ASCL4的蛋白表达(图24A‑C)。可见，菌1、菌2和SAG能够调节GPx4和ASCL4蛋白引起铁死亡的发生。

[0270] 采用WB对结肠肿瘤组织中ASCL4和GPx4蛋白表达进行分析(图25A‑C)。在菌1、菌2和SAG的干预下，能够上调ACSL4的表达，抑制GPx4的蛋白表达，进而促进铁死亡的发生。这一结果与免疫组化分析结果相一致。SLC7A11能够将细胞外胱氨酸和细胞内谷氨酸进行交换，使细胞内有充足的半胱氨酸合成GSH，GSH可以协同GPx4把脂质氧化物转化为脂质醇，减少细胞内脂质氧化物的积累，影响铁死亡的发展过程。细胞的转运系统可以使细胞内的铁含量维持在平衡状态下，转铁蛋白及膜转铁蛋白受体可以把细胞外的铁转运到细胞内。细胞内的铁主要以铁蛋白的形式储存，铁蛋白分为重链铁蛋白(FTH)和轻链铁蛋白(FTL)两部分。在菌1、菌2和SAG的干预下，结肠肿瘤组织部位的SLC7A11的表达受到抑制，加速脂质氧化物的积累，促进铁死亡的发生。同时，在NCOA4介导的铁蛋白自噬发生时，使细胞内储存铁离子的FTL、FTH的表达降低，说明了菌1、菌2和SAG能够增加细胞内铁离子的含量从而促进铁死亡的发生(图25D‑F)。

[0271] 2.6SAG和肠道菌对肠道微生物的调节

[0272] 2.6.1SAG和肠道菌改变了小鼠肠道微生物的物种分类和丰度

[0273] 在菌1、菌2和肠道菌的干预下，可以改变小鼠肠道中微生物的种类，改变了肠道微生物的多样性。通过物种组成热图可以观察到它们对于肠道微生物的调节趋于一致性(图26)。可见，菌1、菌2和SAG对于肠道微生物的调节作用一致。

[0274] 在菌1、菌2和SAG的干预下，肠道微生物在门和属水平上优势种群的相对丰度产生了变化。在DSS/AOM干预后，降低了Bacteroidetes、Firmicutes的相对丰度。在菌1干预后，增加了Bacteroidetes及Firmicutes的相对丰度。在菌2和SAG的干预下，增加了Bacteroidetes和Firmicutes的相对丰度。可见在门水平上，菌1、菌2和SAG能够增加肠道微生物中有益菌的相对丰度。

[0275] 在属水平上，在DSS/AOM干预后，Lactobacillus和Bacteroides的相对丰度出现了降低。利用菌1、菌2和SAG的干预逆转了因DSS/AOM引起的降低趋势，Lactobacillus和Bacteroides的相对丰度均出现不同程度的增加(见图27)。

[0276] 因此，在菌1、菌2和SAG的干预下能够使肠道微生物门和属水平上有益菌增加，并且，菌1和菌2的调节趋势大致与SAG一致。

[0277] 2.6.2SAG和肠道菌对DSS/AOM联合诱导的结肠癌小鼠肠道微生物多样性的影响

[0278] 对各组肠道微生物的α多样性指数进行分析，并制作相应的稀释曲线。Simpson指数和Shannon指数用来评价微生物的多样性，其指数越大，多样性越高。Chao1指数越大，样本中含有的物种越多，而Goods‑Coverage指数则代表样本中微生物的真实情况。本研究结果表明，Control组小鼠肠道菌群的Simpson、Shannon和Chao1指数与DSS/AOM组小鼠相比发生了变化，表明DSS/AOM组小鼠肠道微生物的多样性和丰度已经被影响。在菌1、菌2和SAG干预后，各项指标发生了改变，表明菌1、菌2和SAG可以影响肠道微生物的多样性。同时，在菌1、菌2和SAG干预后，Goods‑Coverage指数的增加也能充分证明数据的可信度。

[0279] 为了进一步揭示样品间微生物多样性的差异，采用主坐标分析(PCoA)来比较样品间的差异。第一主坐标(PCoA1)和第二主坐标(PCoA2)分别为15.3％和9.8％(图28A)。通过PCoA分析可以观察到在DSS/AOM干预后，肠道微生物与Control组小鼠呈现出离散的趋势。在经过菌1、菌2和SAG干预后，与DSS/AOM组肠道微生物出现了离散，证明菌1、菌2和SAG能够调节因DSS/AOM引起的肠道微生物变化。同时，菌2和SAG能够使肠道微生物更接近于正常小鼠，表明它们具有调节肠道微生物至正常水平的能力。

[0280] 层次聚类可以直观地显示不同样品中微生物的差异程度(图28B)。本发明中，Control组与DSS/AOM组呈现出两种极端的趋势，表明DSS/AOM的干预能够改变正常小鼠的肠道微生物组成。给予菌1、菌2和SAG后与DSS/AOM组出现了分离，并逐渐接近于Control组，说明菌1、菌2和SAG有助于调节肠道微生物群的结构和组成并恢复肠道微生物的正常稳态。
通过组间差异分析(图28C)，发现经过DSS/AOM处理后的小鼠肠道微生物与Control组出现了差异。菌1、菌2和SAG对小鼠干预后，与DSS/AOM组出现了远离并接近Control组，且它们调节趋势是一致的。

[0281] 上述结果证明，菌1、菌2和SAG能够调节因DSS/AOM对肠道微生物引起的紊乱。同时，它们在长期的干预下，能够呈现出恢复肠道微生物至正常的稳态，且它们的调节作用呈现出一致性。

[0282] 2.6.3SAG和肠道菌对DSS/AOM联合诱导的结肠癌小鼠肠道微生物的物种差异分析[0283] 为了进一步分析菌1、菌2和SAG对肠道微生物的影响，本研究在门、属水平上对不同组之间的差异进行分析(图29A‑F)。结果，在菌1、菌2和SAG的干预下，能够使小鼠肠道微生物与DSS/AOM组产生较大差别，并与Control组小鼠的肠道微生物相近。同时，菌1、菌2和SAG对肠道微生物的调节作用处于一致的水平。

[0284] LEfSe分析在LDA＞2时进行组间差异分析，在DSS/AOM的作用下，肠道微生物的差异明显(图29G)。c_Verrucomicrobiae、p_Verrucomicrobia、o_Verrucomicrobiales、g_Akkermansia和f_Verrucomicrobiaceae在DSS/AOM组被富集，丰度最高。通过菌1、菌2和SAG的干预，使小鼠肠道微生物的差异性降低，并且降低了有害菌的相对丰度。

[0285] 通过上述研究，发现菌1、菌2和SAG对DSS/AOM联合诱导的结肠癌小鼠进行长期干预，能够减轻结肠部位的损伤以及促使肿瘤数量的减少，Limosilactobacillus reuteri strain HDB1243和Lactobacillus johnsonii strain 1696应该为拮抗结肠癌的关键肠道菌。SAG能够通过激活AMPK‑mTOR信号通路进一步调控NCOA4介导的铁蛋白自噬以及增加Limosilactobacillus reuteri strain HDB1243和Lactobacillus johnsonii strain 2+
1696相对丰度拮抗DSS/AOM联合诱导的结肠癌。同时，它们诱导AMPK的激活，促进细胞内Fe和脂质过氧化代谢产物的过度积累，导致铁死亡的发生。且Limosilactobacillus reuteri strain HDB1243和Lactobacillus johnsonii strain 1696能够对DSS/AOM诱导的结肠癌小鼠与SAG以相同的作用机制发挥拮抗作用，并且对于肠道微生物的调节趋势也与SAG一致。可见，SAG在拮抗结肠癌过程中主要是通过增加Limosilactobacillus reuteri strain HDB1243和Lactobacillus johnsonii strain 1696的相对丰度发挥对结肠癌的拮抗作用；
因此，可以在制备结肠癌的药物中应用。

[0286] 以上所述为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。