[0001] 本发明涉及牧草栽培技术领域，具体涉及褪黑素与钙离子协同在提高紫花苜蓿耐盐性中的应用。

[0002] 土壤盐碱化是耕地退化和农作物减产的重要非生物因素之一，特别是干旱半干旱地区分布更为广泛。盐碱胁迫首先会引起植物水分吸收减少产生渗透胁迫，再产生离子毒害影响植物光合作用，严重时导致植物的生长受到抑制甚至死亡。因此，如何提高作物的耐盐碱能力以有效利用盐碱地非常关键。

[0003] 紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上栽培最广泛的优质豆科牧草，具有营养丰富、适应性强、产草量高、适口性好等特点，还可通过根瘤固氮改良土壤，因而被广泛用于畜牧业和生态修复领域，但宁夏地区盐碱胁迫影响了苜蓿的产量和品质。因此，寻找快速提高苜蓿耐盐性的方法措施，加速培育苜蓿耐盐新品种对苜蓿种业自立自强和畜牧业发展具有重要的意义。

[0004] 褪黑素是一种生命必需的小分子吲哚胺类物质，在调控植物生长发育及抗逆性方面发挥着重要作用。研究发现，褪黑素主要通过提高抗氧化酶活性、非酶抗氧化物质、酚类物质和渗透调节物质的含量以抑制活性氧的产生，减轻脂质过氧化，从而缓解盐胁迫对植2+
物造成的损害。钙离子(Ca )作为真核生物细胞信号传导的第二信使，在调控植物盐胁迫响
2+
应中具有举足轻重的作用。有研究发现Ca 作为重要的次级信号在褪黑素调控的多种生理
2+
响应中发挥着重要作用，但有关褪黑素与Ca 相互作用调控苜蓿耐盐性方面的研究还未见报道。

[0026] 下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

[0027] 实施例1：褪黑素与钙离子最佳处理组合浓度筛选

[0028] 为了选择最佳的褪黑素和CaCl2组合浓度，本试验以紫花苜蓿‘中苜1号’为材料，将其种子消毒后进行发芽，发芽5天后移栽至蛭石中继续生长，培养至一个月时进行分组处理。

[0029] 本试验所用褪黑素浓度分别为25、50、100μmol/L，CaCl2溶液浓度分别为5、10、15 2+ 2+
mmol/L，对褪黑素和Ca 采用正交试验(表1)，对幼苗进行褪黑素和Ca 预处理7 d后，用含
200 mmol/L NaCl的霍格兰营养液浇灌处理3周。本试验采用3个重复的随机完全区组设计，并以正常生长的(CK)和盐胁迫喷蒸馏水的处理(S)为对照。

[0030] 表1褪黑素和Ca2+最佳处理组合浓度正交设计表

[0031]

[0032] 处理结束后，测定苜蓿叶片的茎尖耐性指数(STI)、相对电导率、MDA含量和Na+含量，筛选出最佳的褪黑素和CaCl2组合浓度。结果如图1所示，在盐胁迫下，苜蓿植株的STI明+显降低，相对电导率、MDA和Na含量明显升高，但在盐胁迫下施加褪黑素和CaCl2后，STI有所+
升高，而相对电导率、MDA和Na含量均有所下降，表明褪黑素和CaCl2可缓解盐胁迫对苜蓿的损伤，其中以100μmol/L褪黑素和10 mmol/L CaCl2同时施用的缓解效果最佳。

[0033] 实施例2：褪黑素与钙离子协同在提高紫花苜蓿耐盐性中的应用

[0034] 以紫花苜蓿‘中苜1号’为材料，将其种子消毒后进行发芽，发芽5天后移栽至蛭石中继续生长，待苜蓿幼苗生长至一个月时分为以下5组进行处理：

[0035] (1)对照(CK)；

[0036] (2)盐胁迫(S，200mmol/L NaCl)；

[0037] (3)盐胁迫+褪黑素(S+Mel，200mmol/L NaCl+100μmol/L褪黑素)；

[0038] (4)盐胁迫+CaCl2(S+CaCl2，200mmol/L NaCl+10mmol/LCaCl2)；

[0039] (5)盐胁迫+褪黑素+CaCl2(S+Mel+CaCl2，200mmol/L NaCl+100μmol/L褪黑素+10mmol/L CaCl2)；

[0040] 其中，每种处理3个重复，对照(CK)组用正常营养液培养植株，盐胁迫(S)组叶面喷2+
施蒸馏水，其他处理组对幼苗叶面喷施褪黑素和Ca 预处理7 d后，用含200 mmol/L NaCl的霍格兰营养液浇灌处理3周。处理结束后采取植株样品并测定相关指标。

[0041] 1、褪黑素与Ca2+协同作用对盐胁迫下紫花苜蓿生长的影响

[0042] 观察处理之后的植株表型并拍照，同时测定不同处理下的苜蓿的株高、鲜重、干重和叶面积指标。结果如图2所示，盐胁迫显著抑制了紫花苜蓿的生长，而施加褪黑素和CaCl2促进了盐胁迫下苜蓿的生长，其中二者同时施用效果最佳。相应地，生长指标测定表明(图3)，在盐胁迫下施加褪黑素和CaCl2均提高了苜蓿的株高、叶面积和地上生物量，并且二者共同施用时效果最好，表明褪黑素和CaCl2对调控苜蓿耐盐性具有协同作用。

[0043] 2、褪黑素与Ca2+协同作用对盐胁迫下紫花苜蓿相对电导率和ROS积累的影响[0044] 利用电导率仪测定不同处理组苜蓿叶片的电导率，并计算相对电导率值；利用NBT‑染色法检测苜蓿叶片中超氧阴离子(O2)的含量。结果表明，盐胁迫显著提高了苜蓿叶片的相对电导率和ROS积累(图4)，而施加褪黑素、CaCl2、褪黑素和CaCl2处理后相对电导率明显下降，苜蓿叶片的着色程度明显变浅，其中褪黑素和CaCl2同时添加时相对电导率最低，叶
2+
片着色最浅，表明褪黑素和Ca 能够通过协同作用缓解盐胁迫对苜蓿的损伤。

[0045] 3、褪黑素与Ca2+协同作用对盐胁迫下紫花苜蓿抗氧化系统的影响[0046] 为进一步明确褪黑素和Ca2+协同作用对盐胁迫下紫花苜蓿抗氧化系统的影响，通过比色法测定了不同处理组植株的SOD、POD、CAT和APX活性(图5)。结果表明，相比对照植株，在盐胁迫条件下SOD、POD、CAT和APX活性均显著下降，而施加褪黑素、CaCl2、褪黑素和CaCl2处理后，各种酶活性均比单独盐胁迫处理时更高，表明褪黑素和CaCl2可通过提高苜蓿抗氧化酶活性进而提高耐盐性，并且褪黑素和CaCl2同时施加时抗氧化酶活性最高，说明二者通过协同作用调控抗氧化酶活性来抵御盐胁迫。

[0047] 4、褪黑素与Ca2+协同作用对盐胁迫下紫花苜蓿离子含量的影响

[0048] 为进一步探究褪黑素和Ca2+协同作用对盐胁迫下紫花苜蓿离子变化的影响，利用+ + +火焰光度计测定苜蓿植株中的Na 和K含量。结果如图6所示，在盐胁迫条件下，苜蓿Na 含量+ +
显著增加，而K 含量显著减少，而施加褪黑素、CaCl2、褪黑素和CaCl2处理后，植株Na含量出+ + +
现降低，而K含量有所升高，对应地，K/Na值也显著升高，特别是在盐胁迫下同时施加褪黑+ + +
素和CaCl2时Na含量最低，表明二者可以通过协同作用调节苜蓿Na和K 平衡，进而提高植株耐盐性。

[0049] 5、褪黑素与Ca2+协同作用对盐胁迫下紫花苜蓿叶片胞内Ca2+浓度的影响[0050] 以紫花苜蓿叶片原生质体为试验材料，利用Ca2+荧光探针Cal‑520(AM)在激光共聚2+ 2+
焦显微镜下测定了叶片胞质中Ca 积累量。结果如图7，盐胁迫处理刺激了Ca 向细胞内流动，使细胞内钙离子含量增加；而在盐胁迫条件下分别添加褪黑素和CaCl2后发现，外源施
2+
加CaCl2能显著提高细胞内Ca 含量，而褪黑素对其影响不大，进一步同时施加褪黑素和
2+ 2+
CaCl2发现，细胞内Ca 含量急剧增加，说明二者通过协同作用提高了细胞内Ca 的积累，进而调控苜蓿盐胁迫。

[0051] 6、褪黑素与Ca2+协同作用对盐胁迫下紫花苜蓿内源褪黑素含量的影响[0052] 为了明确褪黑素与Ca2+协同作用对紫花苜蓿内源褪黑素的影响，本实施例利用ELISA方法测定苜蓿内源褪黑素含量。结果如图8，在盐胁迫条件下施加外源褪黑素和CaCl2之后，内源褪黑素含量显著升高。与此同时，当褪黑素和CaCl2同时施加时，内源褪黑素含量大幅度增加，明显高于其他处理，表明二者协同缓解盐胁迫的效果更显著。

[0053] 以上结果表明，外源褪黑素和Ca2+能够通过协同作用提高紫花苜蓿的耐盐性，这为2+
褪黑素和Ca 在苜蓿耐盐生产中的应用奠定了基础，也为盐碱地苜蓿的种植和生产提供了实践指导。

[0054] 于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。