[0001] 本发明属于农药研发领域，具体涉及共生真菌ET39的次生代谢产物作为植物免疫诱抗剂的应用。

[0002] 农作物病害是导致粮食减产的重要原因之一，具有种类多、影响大、爆发性强等特点。此外，病害发生的区域差异性和时间差异性也导致病害的有效防控更加困难。植物免疫诱抗剂是通过激活植物自身的免疫，增强植物对病原菌的抗性，实现病害防防。植物免疫诱抗剂具有环境友好性、系统性、广谱性等优点成为新农药开发的重点领域。

[0003] 昆虫共生菌可产生丰富多样的次生代谢物质，是产生生物活性物质的重要来源。本发明发现了中华剑角蝗(Acrida cinerea)肠道内的共生真菌(Efibula sp.)ET39的次生代谢产物具有优异的植物免疫诱抗活性。

[0052] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

[0053] 实施例1：Efibula sp.ET39的获得途径、分离方法和条件

[0054] 获得途径：Efibula sp.ET39来自于健康中华剑角蝗体内，中华剑角蝗样品由发明人于2018年7月采自江苏省紫金山。

[0055] 分离方法和条件：对健康的中华剑角蝗为期两天的饥饿处理后处死，后续步骤全程在超净工作台内进行。首先，将昆虫放于无菌培养皿中，用75％的酒精浸没虫体进行2分钟的消毒，之后用无菌水冲洗3次，使用无菌剪刀将昆虫消化道解剖出来放至无菌的研钵中进行充分研磨，之后将研磨所得液体用无菌水进行梯度稀释，分别稀释10倍、100倍和1000倍，用移液枪吸取各浓度稀释液200μL均匀涂布在PDA平板上，将培养皿密封处理放入25℃黑暗培养箱中倒置培养，等待菌落长满平板后将带有菌丝的培养基块置于新PDA平板上，继续进行培养，重复多次后纯化得到单一菌株，保存到PDA斜面培养基上置于4℃冰箱保存。

[0056] 实施例2：Efibula sp.ET39的特征描述性

[0057] 培养特性：ET39在PDA平板上培养，25℃、黑暗条件生长5d，直径大于8cm。

[0058] 形态学分析：将菌株ET39所在保种管从4℃冰箱取出在PDA培养基上进行活化，之后用打孔器在菌落外周三分之二处打孔，将菌饼再次接入新的PDA平板上进行活化，将活化好的菌株置于25℃培养箱培养8d左右，菌落呈乳白色，边缘圆滑规则，为担子菌。

[0059] 测序鉴定：采用试剂盒(天根生化科技)提取目标菌株ET39的DNA，通过扩增其ITS1‑ITS4序列得到PCR扩增产物，送至通用生物系统有限公司测序。所得到的序列通过美国国家生物技术信息中心NCBI网站，进行BLAST检索，通过相似性比对和分析，进行菌株分子生物学鉴定。扩增序列及比对结果如下：

[0060] 扩增序列：

[0061] GGAACGGGCTGTCTACCTGATTTGAGGCCAGATTGTCAAAGTGATTGTCTCGTGAGAGACGATTAGAAGCATGAACTATAAACGATACTTCAACACCGCAGCGCAGATAATTATCACACTGAAGGCGATCCGTAAAAGATTCACGCTAATGCATTTGAGAGGAGTCAGCTGACTAGAGCCGACACAGCCTCCAAGTCCAATCCCCACAAGACTCCATTAAGAAATCTAAGGGGTTGAGAATTTCACGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTGTACATTTGTGTTATACACAGTAAACATTCTAAAACTGAAGCGTTTGTGATAAACATAAGAACTA AGACTTTCGCCATTAGTTCTTACTTGTGGTGCACAGGGGTTGAGAGAGTGGATGAGCCAGGCGTGCACATGCCTCTGTTACAAGGCCAGCTACAACCCGTTCAAAACTCGATAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACTTTTTTTTTACTTCCCA，如SEQ ID NO:1所示。

[0062] 表1菌株ET39的测序比对结果

[0063]

[0064] 因此，将该真菌菌种命名为Efibula sp.ET39，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40665，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2023年6月15日。

[0065] 实施例3：化合物Efi‑A、Efi‑B和Efi‑C的制备

[0066] (1)Efibula sp.ET39的发酵

[0067] 通过PDA平板活化菌株ET39，在超净工作台内用无菌的接种铲将菌落外圈培养基切割成适当大小的菌块接入灭菌处理过的PDB培养基(400mL/1000mL)中，在25±1℃、120rpm的黑暗条件下培养5d作为种子液。将种子液分别倒入灭过菌的PDB培养基中，与上述同样培养条件发酵14d。

[0068] (2)Efibula sp.ET39次生代谢物的提取

[0069] 待发酵结束，用纱布对发酵液进行过滤得到发酵滤液，用乙酸乙酯以1:1的体积比对发酵滤液进行萃取，共萃取五次，将有机相收集起来通过旋转蒸发仪浓缩最终得到菌株ET39的乙酸乙酯粗提物。

[0070] 对粗提物的理化性质进行初步鉴定发现，该粗提物为黑色膏状物，溶于乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇。粗提物溶于有机溶剂后呈黑色溶液，在较高浓度时呈粘稠状液体。

[0071] (3)菌液提取物次生代谢产物的分离

[0072] 得到的粗提物先通过正向硅胶柱层析(200‑300目)进行初步的分离。首先将粗浸膏与硅胶按1:1.2的比例进行混合并充分搅拌混匀，置于通风橱自然风干。以硅胶量：粗提物量约为20:1的比例将硅胶装柱，之后将干燥的混合样品缓慢倒入层析柱，以二氯甲烷和甲醇为流动相进行梯度洗脱，比例分别为100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32、100:50、0:100。通过TLC薄层色谱法进行相似组分的合并，合并后的各组分再通过硅胶柱层析、葡聚糖凝胶柱层析(SephadexLH‑20)和高效液相色谱(HPLC)进行进一步的分离纯化后得到Efi‑A、Efi‑B和Efi‑C。

[0073]

[0074] 化合物Efi‑A、Efi‑B、Efi‑C的表征数据如下：

[0075] 化合物Efi‑A，3‑(2‑(methoxycarbonyl)pyridin‑4‑yl)propanoic acid.White 1
powder.mp,117.8‑118.0℃.H NMR(500MHz,DMSO‑d6)δ11.15(s,1H),8.61(d,J＝5.0Hz,
1H),7.98(s,1H),7.57(dd,J＝5.0,2.0Hz,1H),3.89(s,3H),2.94(t,J＝7.5Hz,2H),2.64
13
(t,J＝7.5Hz,2H). C NMR(125MHz,DMSO‑d6)δ173.64,165.60,151.77,149.87,147.66,+
127.51,125.10,52.62,33.82,29.57.HR‑ESI‑MS Calcd for 210.0761(C10H12NO4,[M+H]),found 210.0763.

[0076] 化合物Efi‑B，methyl 4‑(3‑methoxy‑3‑oxopropyl)picolinate.Colorless 1
oil.mp,131.2‑131.6℃.H NMR(500MHz,Chloroform‑d)δ8.63(d,J＝4.5Hz,1H),7.99(d,J＝2.0Hz,1H),7.33(d,J＝3.0Hz,1H),3.99(s,3H),3.66(s,3H),3.02(t,J＝7.5Hz,2H),
13
2.69(t,J＝7.5Hz,2H). C NMR(125MHz,Chloroform‑d)δ172.50,165.83,151.16,149.96,
148.03,127.17,125.27,53.10,52.03,34.07,30.10.HR‑ESI‑MS Calcd for 224.0928+
(C11H14NO4,[M+H]),found 224.0921.

[0077] 化合物Efi‑C，4‑(2‑carboxyethyl)picolinic acid.White powder.mp,105.3‑1
105.5℃.H NMR(500MHz,DMSO‑d6)δ8.61(d,J＝5.0Hz,1H),7.98(s,1H),7.57(dd,J＝5.0,
13
2.0Hz,1H),3.89(s,3H),2.94(t,J＝7.5Hz,2H),2.64(t,J＝7.5Hz,2H). C NMR(125MHz,Chloroform‑d)δ173.48,164.48,156.15,147.14,145.66,128.25,125.85,33.64,+
29.94.HR‑ESI‑MS Calcd for196.0605(C10H10NO4,[M+H]),found 196.0609.

[0078] 实施例4：Efi‑A结构分析鉴定

[0079] 化合物Efi‑A呈现为白色固体，HR‑ESI‑MS显示准分子离子峰为210.0771[M+H]+1
(计算值为C10H12NO4，210.0766)，推测其分子式为C10H11NO4，不饱和度为6。根据该化合物的H 
13
NMR、C NMR和DEPT 135数据可知，该化合物有10个碳，其中有2个羰基碳(δC165.6，173.6)，
1
1个连氧的甲基碳(δC52.6)，2个亚甲基碳(δC29.6，33.8)，由H NMR低场区域的氢的化学位
1 1
移及质谱数据可推测结构中含有吡啶环。结合H‑HCOSY相关可以得到H7‑H8和H5‑H6两个片段；根据HMQC结果可得到化合物中的碳氢直接相关从而进行一一对应；根据HMBC相关可知：
H‑6分别与C‑4和C‑2相关，H‑3与C‑5、C‑7相关，由此确定吡啶环结构以及其中一个取代基连接在C4位置；由H‑7与C‑5、C‑9相关以及H‑8与C‑4相关确定C‑4位置连接的取代基为一个丙酸基团；通过H‑3与C‑10、H‑11与C‑10的HMBC相关可确定C‑2位置连接了一个甲酯基，由此确定了该化合物的结构，为新结构的化合物。

[0080] 表2Efi‑A的1H‑1H COSY and HMBC测试结果

[0081]

[0082]

[0083] 实施例5：Efi‑B结构分析鉴定

[0084] 化合物Efi‑B为无色油状，HR‑ESI‑MS显示其准分子离子峰为224.0918[M+H]+(计1
算值为C11H14NO4，224.0923)，推测其分子式为C11H13NO4，不饱和度为6。根据该化合物的 H 
13
NMR和 C NMR数据发现该化合物与化合物1十分相似，不同之处主要在于该化合物多出1个碳和2个氢，同样含有吡啶结构，有2个羰基碳(δC165.5，172.5)，2个亚甲基碳(δC29.4，
1
33.4)，但含有2个连氧的甲基碳(δC51.6，52.5)，在 H NMR数据中也可以看出，相比于化合物1，化合物2多出3个连氧甲基上的氢。同时结合核磁二维数据，根据1H1HCOSY相关可以得到H7‑H8和H5‑H6两个片段；根据HMQC所显示的化合物中的碳氢相关从而对碳氢进行归属；
根据HMBC相关可知：H‑3分别与C‑5和C‑7相关，H‑7与C‑5相关，H‑6与C‑2、C‑4相关，由此确定吡啶环结构以及C‑4位置上连接了其中一个取代基；通过H‑3与C‑11、H‑12与C11的HMBC相关可确定C‑2位置连接了一个甲酯基；再由H‑7与C‑9相关以及H‑10与C‑9相关确定C‑4位置连接的取代基为一个丙酸甲酯基团；而根据H3‑10与C‑9之间的HMBC相关，可以确定该化合物在C‑8上连接了一个甲酯基，区别于化合物1，其余数据与化合物1基本一致，由此确定了该化合物的结构，为Efi‑A的甲酯化合物，同样为新结构的化合物。

[0085] 表3Efi‑B的1H‑1H COSY and HMBC测试结果

[0086]

[0087] 实施例6：Efi‑A、Efi‑B和Efi‑C诱导烟草抗辣椒疫霉病

[0088] 将本氏烟(Nicotiana benthamiana)种子撒播于育苗基质(营养土：蛭石＝2：1)中，于光照：黑暗＝16h：8h、温度为25±1℃条件下培养7d后，单株移栽至含培养土(营养土：蛭石＝3：1)直径为6cm的方盒中，按上述条件继续培养4周后使用。

[0089] 辣椒疫霉病菌孢子诱导方法：将辣椒疫霉LT263在V8平板上、25±1℃黑暗培养3‑4天后，挑取菌落最外圈菌丝块并放入含有15mL V8液体培养基的培养皿中。25±1℃黑暗培养3天，弃去培养液并用灭菌后的自来水反复清洗菌丝体三遍后，25℃黑暗培养24h。将培养皿转移至4℃条件下放置30min，利用低温刺激其产孢。30min后放回25±1℃培养30min，将培养皿放置于显微镜下，观察菌丝以及是否产孢。成功产孢后，可使用血小板计数器进行计数并根据实验需要配制相应浓度的游动孢子液。

[0090] V8固体培养基，每升培养基中包括：100mL V8果蔬汁，1g CaCO3，琼脂20g，900ml水。

[0091] V8液体培养基，每升培养基中包括：100mL V8果蔬汁，1g CaCO3，900ml水。配制液体培养基时，将V8果蔬汁与碳酸钙混匀后，于8000rpm离心5min，弃沉淀，留取上清，加水定容至1L。

[0092] 按重量称取上述重量比例，用超纯水定容。分装至三角瓶中于121℃灭菌25min，制成所需培养基。

[0093] 分别配制好0.125mg/mL‑2.00mg/mL的Efi‑A、Efi‑B、Efi‑C溶液和MeJA溶液，向每株叶片喷洒1ml左右溶液，设三组重复。空白对照喷洒清水。24h后向植株喷施游动孢子液。喷施完毕后将植株放置于保湿环境下培养4d，待植株发病进行病情指数统计和拍照。

[0094] 结果如表4所示，Efi‑A、Efi‑B、Efi‑C药物处理后的防治效果明显优于阳性对照MeJA，其中在2mg/mL浓度下Efi‑C的防治效果达到了95.37％，植株几乎完全不发病，拥有较高的防治效率。而在0.5mg/mL浓度下，防治效率为81.94％，明显优于MeJA的防治效率。从图2可以看出，随着Efi‑A、Efi‑B、Efi‑C药物浓度的增加烟草植株无萎蔫，叶片无卷曲，几乎无病斑。

[0095] 表4Efi诱导烟草植株后防治辣椒疫霉病菌效果(％)

[0096]

[0097] 实施例7：Efi‑A、Efi‑C诱导水稻抗水稻稻瘟病

[0098] 将感病水稻种子CO39置于培养皿中37±1℃催芽2d后，均匀撒播于培养土(营养土：蛭石＝2：1)中，放置于光照：黑暗＝12h：12h、温度为28±1℃条件下培养14d后备用。

[0099] 水稻稻瘟病菌野生型Guy11孢子诱导方法：从PDA斜面保种管中提取菌丝于SDC固体培养基上黑暗培养4d后，挑取边缘菌丝转至新的SDC固体培养基平板上，置于28±1℃、黑暗培养7d，随后刮去气生菌丝后置于黑光灯下培养3d诱导产孢。用2.5ml无菌水冲洗SDC板上孢子，过单层滤布，收集到2.0mL离心管中。

[0100] SDC培养基，每升培养基中含100g稻杆，40g玉米粉，15g琼脂。

[0101] 按重量称取上述重量比例稻杆，熬煮汁液后，加入琼脂和葡萄糖，用水定容。分装至三角瓶中于121℃灭菌25min，制成所需培养基。

[0102] 利用血球计数板将孢子液浓度调到1×105个/ml，每个处理5ml孢子液，并加入0.2％的明胶，用喷雾器均匀喷洒种植14d的野生型水稻幼苗叶片(提前24h药物喷雾处理，方法同实施例6)。喷施完毕后，将水稻置于28±1℃，80±10％湿度下的暗箱中培养24h，然后在12h光照：12h黑暗交替条件下培养，每日需用喷壶补充水分2次，以保持适宜的湿度条件，7d后观察致病力结果并拍照。

[0103] 结果如图3所示，经清水处理后的水稻叶片病斑面积较大，叶片偏黄，经不同浓度的药物处理后的水稻叶片病斑面积较小，特别值得注意的是在0.50mg/mL的Efi‑A、Efi‑C处理后的水稻叶片，几乎无发病，防治效率达到80％以上，1.00mg/mL的Efi‑A、Efi‑C处理后的水稻叶片无发病，防治效率接近100％。表明Efi‑A、Efi‑C能够诱导水稻产生抗性抵御水稻稻瘟病的发生。

[0104] 表5Efi诱导水稻植株后防治水稻稻瘟病效果(％)

[0105]

[0106] 实施例8：Efi‑A、Efi‑C诱导水稻抗水稻白叶枯病菌

[0107] 将感病水稻种子CO39置于培养皿中37±1℃催芽2d后，均匀撒播于培养土(营养土：蛭石＝2：1)中，放置于光照：黑暗＝12h：12h、温度为28±1℃条件下培养14d后备用。

[0108] 水稻白叶枯细菌由南京农业大学天然产物与农药化学实验室保存，培养温度为28±1℃，相对湿度为50±10％，黑暗培养。

[0109] 摇菌方式：菌体于28℃温箱内培养2天长成亮黄色后，5000rpm离心10min，重悬用9
PBS溶液稀释，采用比浊法将浓度稀释至约9*10个/ml。

[0110] NA培养基成分：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉0.5g/L，牛肉膏3g/L，去离子水补止1L。

[0111] 具体实验方法如下：将配制好的1mg/mL Efi‑C提前24h喷洒于水稻植株表面，药液中含有1％ TW‑80。24h后用剪刀沾取摇培好的细菌菌液，在距喷药叶片叶尖2‑3cm处，剪去叶尖，每个处理三盆水稻独立重复，每盆水稻剪取8片叶。保湿处理7d后，记录发病情况，根据发病等级计算仿效。

[0112] 结果如图4所示，在喷施1mg/mL Efi‑C后，水稻叶片呈绿色，与阴性对照的健康水稻叶片相近，剪叶端几乎无病斑，优于MeJA处理的水稻叶片，MeJA处理后，剪叶端有部分白色病斑，叶片部分显示黄色，而清水处理后的叶片，几乎完全发病，剪叶端叶片呈白色，整个叶片呈黄色。经计算Efi‑C处理后防效为87.61％，优于MeJA的55.58％。因此，Efi‑C处理水稻叶片后可激活其免疫诱抗活性，防治水稻白叶枯的侵染。

[0113] 实施例9：Efi‑A、Efi‑C诱导水稻抗水稻条斑病菌

[0114] 水稻培养方法同实施例8。

[0115] 水稻条斑细菌由南京农业大学天然产物与农药化学实验室保存，培养温度为28±1℃，相对湿度为50±10％，黑暗培养。

[0116] 摇菌方式和NA培养基成分同实施例8。

[0117] 具体实验方法同实施例8。

[0118] 结果如图5所示，在在喷施1mg/mL Efi‑C后，水稻叶片呈绿色，与阴性对照的健康水稻叶片相近，剪叶端病斑面积较小，优于MeJA处理的水稻叶片，MeJA处理后，剪叶端叶片延伸至叶片中间呈干枯状态，而Efi‑A和Efi‑C仅有剪叶区少量干枯病斑，延伸区域较小。经计算Efi‑C处理后仿效为79.36％，优于MeJA的42.95％。因此，Efi‑C处理后可激活免疫，使植株抗水稻条斑病菌。

[0119] 综上所述，本发明所述的由大型真菌Efibula sp.ET39分离得到的天然次生代谢产物Efi‑A、Efi‑B和Efi‑C拥有较强的抗病，且对多种作物抵抗多种病原菌均具有优良的诱抗活性，使其可以作为一种新型植物免疫诱抗剂在农业生产中发挥重要的作用，具有进一步研究与开发的价值。

[0120] 上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所述领域技术人员应该明白，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。