[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种包含桂枝的中药组合物的薄层鉴别方法及其应用。

[0002] 薄层色谱法在中药材及其制剂的定性鉴别中得到广泛的应用，这主要是由于其具有分离分析双重功能，大大提高了鉴别工作的灵敏度和专属性，成为中药鉴别的重要方法。
薄层色谱法还可用于药品的杂质检查和含量测定。

[0003] 现有技术中未见包含桂枝的中药组合物中大黄、桃仁和/或桂枝的薄层鉴别方法的相关报道。

[0045] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，
都属于本发明保护的范围。

[0046] 除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等
价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。

[0047] 本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述
的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。

[0048] 说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。

[0049] 在本发明中，术语“包括”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

[0050] 正如背景技术部分所描述的，现有技术中未见包含桂枝的中药组合物中药材大黄、桃仁和/或桂枝的薄层鉴别方法的相关报道。为了解决上述问题，本发明提供了一种包含桂枝的中药组合物的薄层鉴别方法，该薄层鉴别方法包括如下步骤：(1)将包含桂枝的中药组合物进行前处理得到供试品溶液，将缺少大黄、桃仁或桂枝的中药组合物进行前处理
得到阴性样品溶液，将对照品进行前处理得到对照品溶液，将对照药材进行前处理得到对
照药材溶液；以及(2)对该供试品溶液、该阴性样品溶液、该对照品溶液和该对照药材溶液进行薄层色谱鉴别分析；

[0051] 其中，该薄层色谱鉴别分析的步骤中采用石油醚‑乙酸乙酯‑甲酸作为展开剂，该石油醚、该乙酸乙酯与该甲酸之间的体积之比为(75～105):(1～20):(0.1～5)。

[0052] 在本发明中，比值、浓度、次数、体积、时间、温度、距离、点样量、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～20”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～20”、“1～15”、“1～10”、“1～5”、“5～20”、“5～15”、“5～10”、“10～20”、“10～15”、“15～20”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

[0053] 本发明提供了一种包含桂枝的中药组合物的薄层鉴别方法，针对桃仁、桂枝、大黄的成分建立的提取制备工艺，能够从颗粒剂的诸多有效药物成分中分离提取待测定成分，在保证鉴定效果的基础上，取1份颗粒剂，制备成2个供试品，实现1块板检测出桃仁、桂枝、大黄，并在不同质控环境下验证了所建立的薄层鉴别方法的稳定性和重复性。本发明具有
简化质量检测、环保、提高检测效率的技术效果。

[0054] 在一种优选地实施方式中，该包含桂枝的中药组合物包含大黄、桃仁、桂枝、甘草和芒硝。

[0055] 在一种优选地实施方式中，该大黄、该桃仁、该桂枝、该甘草与该芒硝之间的质量之比为(50～60):(10～20):(20～35):(20～35):(20～35)。

[0056] 在一种优选地实施方式中，该大黄、该桃仁、该桂枝、该甘草与该芒硝之间的质量之比为约55.2:约13.5:约27.6:约27.6:约27.6。

[0057] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约55.2”包括55.2的±5％，或从52.44到57.96；“约13.5”包括13.5的±5％，或从12.825到14.175；“约27.6”包括27.6的±5％，或从26.22到28.98。

[0058] 在一种优选地实施方式中，该供试品溶液的制备方法包括：称取适量的包含桂枝的中药组合物制剂，研细，加水溶解，用第一溶剂进行提取，得到第一提取液，挥干该第一溶剂之后，得到第一残渣，在该第一残渣中加入第二溶剂进行溶解，得到该供试品溶液。

[0059] 在一种优选地实施方式中，该大黄对照药材溶液的制备方法包括：称取适量的大黄对照药材，加入第二溶剂进行浸渍，过滤，得到第一滤液，将适量的该第一滤液蒸干之后加水溶解，再加入第三溶剂进行回流，取出，冷却，用第一溶剂进行提取，得到第二提取液，合并第二提取液，蒸干，得到第二残渣，在该第二残渣中加入第二溶剂进行溶解，得到该大黄对照药材溶液。

[0060] 在一种优选地实施方式中，该桃仁对照药材溶液的制备方法包括：称取适量的桃仁对照药材，加水溶解，加热回流，过滤，得到第二滤液，将该第二滤液用第一溶剂进行提取得到第三提取液，合并第三提取液，蒸干，得到第三残渣，在该第三残渣中加入第二溶剂进行溶解，得到该桃仁对照药材溶液。

[0061] 在一种优选地实施方式中，该桂枝对照药材溶液的制备方法包括：称取适量的桂枝对照药材，加入第四溶剂进行浸渍之后过滤，得到该桂枝对照药材溶液。

[0062] 在一种优选地实施方式中，该对照品溶液的制备方法包括：称取适量的大黄酚、大黄素甲醚和大黄素对照品，添加体积百分比浓度为10％～100％的甲醇溶液例如100％的甲醇溶液配制成大黄酚、大黄素甲醚和大黄素浓度分别为0.01～1mg/ml的该对照品溶液。

[0063] 在一种优选地实施方式中，该阴性样品溶液的制备方法包括：分别称取适量的缺少大黄、桃仁或桂枝的中药组合物，之后的步骤与该供试品溶液的制备方法相同。

[0064] 在一种优选地实施方式中，该中药组合物制剂的制备方法包括：称取适量的大黄、桃仁、桂枝、甘草和芒硝，加水煎煮，合并煎煮液，滤过，浓缩，干燥，加入辅料混匀，得到该中药组合物制剂。

[0065] 在一种优选地实施方式中，该大黄、桃仁、桂枝、甘草和芒硝与该水之间的质量/体积之比为1:(5～15)，例如1:约10。

[0066] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约10”包括10的±5％，或从9.5到10.5。

[0067] 在一种优选地实施方式中，该煎煮的次数为2～5，例如2次。

[0068] 在一种优选地实施方式中，该辅料选自以下的一种或多种：淀粉、糊精、麦芽糊精和乳糖。

[0069] 在一种优选地实施方式中，该中药组合物制剂的剂型为颗粒。

[0070] 在一种优选地实施方式中，该第一溶剂为醚，例如乙醚。在一种优选地实施方式中，该第二溶剂为醇，例如甲醇。在一种优选地实施方式中，该第三溶剂为酸，例如盐酸。在一种优选地实施方式中，该第四溶剂为醇，例如乙醇。

[0071] 在一种优选地实施方式中，在该供试品溶液的制备方法中，该包含桂枝的中药组合物制剂与该水的质量/体积(g/ml)之比为0.001～1，例如约0.1。

[0072] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.1”包括0.1的±5％，或从0.095到0.105。

[0073] 在一种优选地实施方式中，在该供试品溶液的制备方法中，该包含桂枝的中药组合物制剂与该第一溶剂的质量/体积(g/ml)之比为0.001～1，例如约0.067。

[0074] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.067”包括0.067的±5％，或从0.06365到0.07035。

[0075] 在一种优选地实施方式中，在该供试品溶液的制备方法中，该用第一溶剂进行提取的次数为1～5次，例如3次。

[0076] 在一种优选地实施方式中，在该供试品溶液的制备方法中，该用第一溶剂进行提取的体积为20～40ml/次，例如约30ml/次。

[0077] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约30”包括30的±5％，或从28.5到31.5。

[0078] 在一种优选地实施方式中，在该供试品溶液的制备方法中，在该残渣中加入第二溶剂的体积为1～10ml，例如约2ml。

[0079] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约2”包括2的±5％，或从1.9到2.1。

[0080] 在一种优选地实施方式中，在该大黄对照药材溶液的制备方法中，该大黄对照药材与该第二溶剂的质量/体积(g/ml)之比为0.0001～1，例如约0.0067。

[0081] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.0067”包括0.0067的±5％，或从0.006365到0.007035。

[0082] 在一种优选地实施方式中，在该大黄对照药材溶液的制备方法中，该用第二溶剂进行浸渍的时间为30～90min，例如约60min。

[0083] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约60”包括60的±5％，或从57到63。

[0084] 在一种优选地实施方式中，在该大黄对照药材溶液的制备方法中，该适量的第一滤液的体积为5～20ml，例如约10ml。

[0085] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约10”包括10的±5％，或从9.5到10.5。

[0086] 在一种优选地实施方式中，在该大黄对照药材溶液的制备方法中，该大黄对照药材与该水的质量/体积(g/ml)之比为0.0001～1，例如约0.01。

[0087] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.01”包括0.01的±5％，或从0.0095到0.0105。

[0088] 在一种优选地实施方式中，在该大黄对照药材溶液的制备方法中，该大黄对照药材与该第三溶剂的质量/体积(g/ml)之比为0.01～1，例如约0.2。

[0089] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.2”包括0.2的±5％，或从0.19到0.21。

[0090] 在一种优选地实施方式中，在该大黄对照药材溶液的制备方法中，该加热回流的时间为10～90min，例如约30min或约60min。

[0091] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约30”包括30的±5％，或从28.5到31.5；“约60”包括60的±5％，或从57到63。

[0092] 在一种优选地实施方式中，在该大黄对照药材溶液的制备方法中，该大黄对照药材与该第一溶剂的质量/体积(g/ml)之比为0.0001～1，例如约0.01。

[0093] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.01”包括0.01的±5％，或从0.0095到0.0105。

[0094] 在一种优选地实施方式中，在该大黄对照药材溶液的制备方法中，该第一溶剂进行提取的次数为1～5次，例如2次。

[0095] 在一种优选地实施方式中，在该大黄对照药材溶液的制备方法中，该第一溶剂进行提取的体积为10～40ml/次，例如约20ml/次。

[0096] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约20”包括20的±5％，或从19到21。

[0097] 在一种优选地实施方式中，在该桃仁对照药材溶液的制备方法中，该桃仁对照药材与该水的质量/体积(g/ml)之比为0.0001～1，例如约0.033。

[0098] 在一种优选地实施方式中，在该桃仁对照药材溶液的制备方法中，该桃仁对照药材与该第一溶剂的质量/体积(g/ml)之比为0.0001～1，例如约0.033。

[0099] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.033”包括0.033的±5％，或从0.03135到0.03465。

[0100] 在一种优选地实施方式中，在该桂枝对照药材溶液的制备方法中，该桂枝对照药材与该第四溶剂的质量/体积(g/ml)之比为0.001～1，例如约0.1。

[0101] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.1”包括0.1的±5％，或从0.095到0.105。

[0102] 在一种优选地实施方式中，在该桂枝对照药材溶液的制备方法中，该用第四溶剂进行浸渍的时间为10～90min，例如约30min。

[0103] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约30”包括30的±5％，或从28.5到31.5。

[0104] 在一种优选地实施方式中，在该桂枝对照药材溶液的制备方法中，该第四溶剂进行浸渍时需要时时振摇。

[0105] 在一种优选地实施方式中，在该对照品溶液中的大黄酚浓度为约0.15mg/ml。

[0106] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.15”包括0.15的±5％，或从0.1425到0.1575。

[0107] 在一种优选地实施方式中，在该对照品溶液中的大黄素甲醚浓度为约0.2mg/ml。

[0108] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.2”包括0.2的±5％，或从0.19到0.21。

[0109] 在一种优选地实施方式中，在该对照品溶液中的大黄素浓度为约0.1mg/ml。

[0110] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.1”包括0.1的±5％，或从0.095到0.105。

[0111] 在一种优选地实施方式中，该石油醚、该乙酸乙酯与该甲酸之间的体积之比为(80～100):(5～15):(0.1～3)。在一种优选地实施方式中，该石油醚、该乙酸乙酯与该甲酸之间的体积之比为(85～95):(8～12):(0.1～1)。在一种优选地实施方式中，该石油醚、该乙酸乙酯与该甲酸之间的体积之比为约90:约10:约0.5。

[0112] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约90”包括90的±5％，或从85.5到94.5；“约10”包括10的±5％，或从9.5到10.5；“约0.5”包括0.5的±5％，或从0.475到0.525。

[0113] 在一种优选地实施方式中，该薄层色谱鉴别分析的步骤中的薄层板为硅胶G薄层板、硅胶GF254或高效硅胶G板。在一种优选地实施方式中，该硅胶G薄层板为德国默克硅胶G薄层板或烟台银龙硅胶G薄层板或青岛海洋硅胶G薄层板。

[0114] 在一种优选地实施方式中，该薄层色谱鉴别分析的步骤中的检视条件为：在紫外灯下检视，其中检视所采用的紫外线波长为365nm。

[0115] 在一种优选地实施方式中，在该检视之后，将展开完毕的薄层板取出，晾干，喷以香草醛硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。

[0116] 在一种优选地实施方式中，该香草醛硫酸乙醇溶液的浓度为1％～20％，例如约5％。

[0117] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约5％”包括5％的±5％，或从4.75％到5.25％。

[0118] 在一种优选地实施方式中，该加热的温度为90～120℃，例如约105℃。

[0119] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约105”包括105的±5％，或从99.75到110.25。

[0120] 在一种优选地实施方式中，该薄层色谱鉴别分析的步骤中的该薄层板在该展开剂下的平衡饱和时间为30～60min，例如约45min。

[0121] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约45”包括45的±5％，或从42.75到47.25。

[0122] 在一种优选地实施方式中，该薄层色谱鉴别分析的步骤中的温度为5～50℃，例如8～30℃。

[0123] 在一种优选地实施方式中，该薄层色谱鉴别分析的步骤中的相对湿度低于80％。

[0124] 在一种优选地实施方式中，该薄层色谱鉴别分析的步骤中的展距为例如5～12cm，例如7～10cm。在一种优选地实施方式中，该供试品溶液的点样量为1～10μl，例如3～9μl，例如约6μl。在一种优选地实施方式中，该对照品溶液的点样量为1～10μl，例如2～6μl，例如约3μl。在一种优选地实施方式中，该大黄对照药材溶液的点样量为1～10μl，例如2～6μl，例如约3μl。在一种优选地实施方式中，该桃仁对照药材溶液的点样量为1～10μl，例如2～6μl，例如6μl。在一种优选地实施方式中，该桂枝对照药材溶液的点样量为1～10μl，例如
2～6μl，例如约3μl。

[0125] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约6”包括6的±5％，或从5.7到6.3；“约3”包括3的±5％，或从2.85到3.15。

[0126] 在一种优选地实施方式中，该薄层鉴别的标准包括：查看薄层板在与大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品、大黄素对照品和/或大黄、桃仁或桂枝对照药材相应位置上，是否显示出相同颜色的特征斑点，以及阴性样品是否有干扰；如果该薄层板具有该特征斑点且该
阴性样品无干扰，则所检测的包含桂枝的中药组合物中含有大黄、桃仁和/或桂枝药材。

[0127] 根据本发明的另一个方面，提供了一种上述薄层鉴别方法在鉴别包含桂枝的中药组合物中的大黄、桃仁和/或桂枝药材中的用途。

[0128] 根据本发明的另一个方面，提供了一种用于鉴别包含桂枝的中药组合物中的药材大黄、桃仁和/或桂枝的试剂盒，其包括薄层板和展开剂，其中该展开剂为石油醚‑乙酸乙酯‑甲酸，该薄层板为硅胶G薄层板、硅胶GF254或高效硅胶G板。

[0129] 在一种优选地实施方式中，该石油醚、该乙酸乙酯与该甲酸之间的体积之比为(75～105):(1～20):(0.1～5)。在一种优选地实施方式中，该石油醚、该乙酸乙酯与该甲酸之间的体积之比为(80～100):(5～15):(0.1～3)。在一种优选地实施方式中，该石油醚、该乙酸乙酯与该甲酸之间的体积之比为(85～95):(8～12):(0.1～1)。在一种优选地实施方式
中，该石油醚、该乙酸乙酯与该甲酸之间的体积之比为约90:约10:约0.5。

[0130] 在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约90”包括90的±5％，或从85.5到94.5；“约10”包括10的±5％，或从9.5到10.5；“约0.5”包括0.5的±5％，或从0.475到0.525。

[0131] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。

[0132] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

[0133] 本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相
同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

[0134] 实施例

[0135] 1、实验试剂与材料

[0136] 1.1、包含桂枝的中药组合物样品来源

[0137] 本发明的十五批含桂枝的中药组合物制剂为自制。该中药组合物制剂的制备方法如下所示：称取大黄55.2g、桃仁13.5g、桂枝27.6g、甘草27.6g和芒硝27.6g，加10倍量的水煎煮，煎煮2次，合并煎煮液，滤过，浓缩，干燥，加入辅料(淀粉，糊精，麦芽糊精和/或乳糖等)混匀，得到该中药组合物制剂(例如颗粒剂)。

[0138] 1.2、试剂

[0139] 香兰素(天津市福晨化学试剂厂20171224)，其余所用乙醚、三氯甲烷、甲醇、正丁醇等试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

[0140] 1.3、薄层板

[0141] 预制桂胶G薄层板(HX73416553 1.05553.0001，20×20cm德国默克公司)；预制硅胶G薄层板(银龙，烟台市化学工业研究所20190307100×100mm)；预制硅胶G(海洋，青岛海
洋化工厂20180809，100×100mm)。

[0142] 1.4、药材与对照品

[0143] 掌叶大黄对照药材(中国食品药品检定研究院121249‑201304)；桃仁对照药材(中国食品药品检定研究院121560‑201302)；桂枝对照药材(中国食品药品检定研究院121191‑
201605)；甘草对照药材(中国食品药品检定研究院120904‑201620)；甘草苷对照品(中国食品药品检定研究院111610‑201607)；大黄素甲醚(中国食品药品检定研究院110758‑
201616)；大黄酚(中国食品药品检定研究院110796‑201621)；大黄素(中国食品药品检定研究院110795‑201710)。

[0144] 2、特征鉴别

[0145] 2.1、供试品制备方法与检视方法的选择

[0146] 2.1.1、供试品液制备

[0147] 供试品制备方法①：取本品0.5g，研细，加甲醇30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。

[0148] 供试品制备方法②：取本品1.0g，研细，加水20ml溶解，采用正丁醇提取3次，每次30ml，合并正丁醇液蒸干，残渣加入甲醇4ml使溶解，作为供试品溶液。

[0149] 供试品制备方法③：取本品2.0g，研细，加水20ml溶解，采用乙醚提取3次，每次30ml，合并乙醚液挥干，残渣加入甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

[0150] 2.1.2、对照品液制备

[0151] 2.1.2.1、大黄对照药材液：取大黄对照药材0.2g，加甲醇30ml，浸渍1小时，滤过，取续滤液10ml，蒸干，用水2Oml使溶解，加入盐酸1ml，加热回流30分钟，取出，冷却，用乙醚提取2次，每次20ml，合并乙醚提取液，蒸干，用甲醇2ml溶解残渣，作为大黄对照药材溶液。

[0152] 2.1.2.2、桃仁对照药材液：取桃仁对照药材1g，加水30ml，加热回流1小时，滤过，滤液用乙醚提取2次，每次30ml，合并乙醚液挥干，残渣加入甲醇2ml使溶解，作为桃仁对照药材溶液。

[0153] 2.1.2.3、桂枝对照药材液：取桂枝对照药材0.5g，加乙醇5ml，浸渍30分钟(时时振摇)，滤过，滤液即为桂枝对照药材溶液。

[0154] 2.1.2.4、混合对照品液：取大黄酚、大黄素甲醚、大黄素对照品加甲醇制成每1ml含0.15、0.2、0.1mg的溶液，作为对照品溶液。

[0155] 2.1.3、薄层条件

[0156] 照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液6μl，对照品溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯－甲酸(90∶10∶0.5)为展开剂，展开，取出晾干。

[0157] 2.1.4、检视方法

[0158] 检视方法a：置紫外光灯(365nm)下检视。结果如图1A所示。

[0159] 检视方法b：喷以10％硫酸乙醇液，105℃加热至斑点清晰，置紫外光灯(365nm)下检视。结果如图1B所示。

[0160] 检视方法c：喷以10％硫酸乙醇液，105℃加热至斑点清晰，检视。结果如图1C所示。

[0161] 检视方法d：喷以5％香草醛硫酸乙醇液，105℃加热至斑点清晰，检视。结果如图1D所示。

[0162] 从图1A和图1B可见，在365nm条件下，大黄与方法①、②、③所得供试品液在相应位置上有对应斑点，三种方法都可选；桂枝只与与方法③有对应斑点，所以选方法③，可鉴别大黄、桂枝。如图1C所示，喷硫酸后，紫外365nm下大黄、桂枝的斑点颜色可见，桃仁无对应斑点。如图1D所示，显示喷香草醛加热后，桃仁与方法②、③有一对应斑点。综上所述选择方法③的样品在紫外365nm条件下鉴别大黄和桂枝，再喷香草醛加热后鉴别桃仁。

[0163] 2.2、展开剂的选择

[0164] 展开剂①：石油醚(30～60℃)‑甲酸乙酯‑甲酸(15：5：1)

[0165] 展开剂②：氯仿‑乙酸乙酯‑甲酸‑水(15：40：22：10)(下层)

[0166] 展开剂③：石油醚(60～90℃)‑乙酸乙酯‑甲酸(90：10：0.5)

[0167] 按方法③制备三批供试品样品；按方法③制备缺味阴性供试品液；对照药材液同2.1项下。

[0168] 照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液6μl，对照品溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，分别用以上三种展开剂，展开，取出晾干。置紫外光灯(365nm)下检视，结果如图2A～2C所示；再喷以5％香草醛硫酸乙醇液，105℃加热至斑点清晰，检视，结果如图2D～2F所示。

[0169] 比较图2A、图2B和图2C可得，在紫外365nm处观察，大黄对照药材及对照品在三种展开剂条件下与供试品液在相应位置上有对应斑点，且阴性对照液相应位置上无干扰，以
展开剂③展开效果较好，分离清晰，Rf值适宜；桂枝只有展开剂③能使供试品与对照药材有相对应斑点，阴性样品无干扰斑点，所以选择展开剂③。

[0170] 比较图2D、图2E和图2F可见，喷香草醛后，桃仁在展开剂②、③条件下与供试品液在相应位置上有对应斑点，且阴性对照液相应位置上无干扰，但展开剂②Rf值太大不适合，展开剂③效果较好，分离清晰，Rf值适宜，所以选择展开剂③。

[0171] 综上选择展开剂③，即石油醚(60～90℃)‑乙酸乙酯‑甲酸(90：10：0.5)。

[0172] 展开剂④：石油醚(60～90℃)‑乙酸乙酯‑甲酸(90：10：0)

[0173] 展开剂⑤：石油醚(60～90℃)‑乙酸乙酯‑甲酸(85：10:0)

[0174] 展开剂⑥：石油醚(60～90℃)‑乙酸乙酯‑甲酸(90：10：1)

[0175] 比较展开剂③④⑤可见：在没有甲酸的条件下展开，紫外下观察供试品及大黄对照药材相应斑点拖尾，石油醚用量90好于85，紫外下观察斑点拖尾现象好转；甲酸用量0.5时，可完全消除拖尾现象，使斑点清晰，分离度变好。

[0176] 比较展开剂③⑥可见：甲酸用量为1时，对桂枝的鉴别有一定影响，紫外下观察桂枝对照药材的3个的斑点接近重合，因此甲酸用量以0.5为最佳。

[0177] 2.3、点样量的影响

[0178] 照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取不同量的供试品溶液、对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯－甲酸(90∶10∶0.5)为展开剂，展开，取出晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。再喷以5％香草醛硫酸乙醇液，105℃加热至斑点清晰进行检视。结果如图4所示。

[0179] 图4A和图4B表明供试品液点样量在3～9μl时，与对照品在相应位置上有对应斑点，以6μl较为合适；混合对照品点样量在2～6μl时，都有斑点，以3μl较为适宜；三种对照药材液点样量在2～6μl时，斑点都清晰，但在后期实验发现桃仁对照药材所呈现的斑点会随着药材保存时间延长(约十年)，颜色变淡，点样6μl时与样品斑点相近较为清晰，所以桃仁对照药材采用6μl，桂枝和大黄对照药材采用3μl时较为适宜。

[0180] 2.4、专属性

[0181] 按方法③制备十五批次供试品液；缺味阴性同方法③；对照品液同1.2项下；照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液和桃仁对照药材液
各6μl，其余对照品溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯－甲酸

[0182] (90∶10∶0.5)为展开剂，饱和45分钟，展开，取出晾干。置紫外光灯(365nm)下检视。再喷以5％香草醛硫酸乙醇液，105℃加热至斑点清晰进行检视。结果如图5所示。

[0183] 图5A和图5B表明：采用正文的展开条件，十五批次供试品色谱在与对照品和对照药材色谱的相应位置上，均有相同颜色的斑点，且分离度良好，同法制备的阴性样品无干扰斑点，专属性较好，故列入正文标准。

[0184] 2.5、平衡饱和时间的影响

[0185] 薄层板采用放入展开缸中立即展开(0min)和平衡饱和45min后再展开进行实验。

[0186] 照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液6μl，对照品溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯－甲酸(90∶10∶0.5)为展开剂，分别平衡饱和0min、45min，展开，取出晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。再喷以5％香草醛硫酸乙醇液，105℃加热至斑点清晰进行检视。结果如图6所示。

[0187] 比较图6A、图6B、图6C和图6D可见：平衡饱和时间对薄层展开有影响，薄层板直接展开后出现边缘效应，所以薄层板应平衡饱和45min以上再进行展开。

[0188] 2.6、温度的影响

[0189] 采用两种温度30℃(室温)、8℃(冰箱冷藏室)进行实验。

[0190] 照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液6μl，对照品溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯－甲酸(90∶10∶0.5)为展开剂，分别在30℃、8℃条件下，平衡饱和45min，展开，取出晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。再喷以5％香草醛硫酸乙醇液，105℃加热至斑点清晰进行检视。结果如图7所示。

[0191] 观察图7A、图7B、图7C和图7D可看出：温度对薄层展开没有明显影响，8℃时与30℃展开效果相近，只是展开时间会延长1倍。所以在30℃～8℃都可进行薄层层析。

[0192] 2.7、相对湿度的影响

[0193] 采用两种相对湿度46％、80％进行实验。其中80％的相对湿度是将26.2％硫酸溶液(相对湿度标准来源于HG/T2765.1～2765.6‑2005硅胶中吸附量测定方法)放入烧杯中，
置于展开缸中，通过密闭饱和1小时达到的。

[0194] 照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液6μl，对照品溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯－甲酸(90∶10∶0.5)为展开剂，分别在46％、80％相对湿度条件下，平衡饱和45min，展开，取出晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。再喷以5％香草醛硫酸乙醇液，105℃加热至斑点清晰进行检视。结果如图8所示。

[0195] 观察图8A、图8B、图8C和图8D可看出：环境的相对湿度对薄层展开没有明显影响。所以在相对湿度80％以下都可进行薄层层析。

[0196] 2.8、展距的影响

[0197] 将薄层板分别展开7cm、10cm、16cm，比较观察不同展距对层析的影响。

[0198] 照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液6μl，对照品溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯－甲酸(90∶10∶0.5)为展开剂，分别展开至不同距离，取出晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。再喷以5％香草醛硫酸乙醇液，105℃加热至斑点清晰进行检视。结果如图9所示。

[0199] 比较不同展距的展开效果可知，展距太长不仅没新增斑点，而且已有斑点易扩散变模糊，所以选择展距在7～10cmm展开效果较好。

[0200] 2.9、薄层板厂家的影响

[0201] 分别选取三家薄层预制板(德国默克、青岛海洋、烟台银龙)进行实验。

[0202] 照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液6μl，对照品溶液各3μl，分别点于不同厂家的同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯－甲酸(90∶10∶0.5)为展开剂，取出晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。再喷以5％香草醛硫酸乙醇液，105℃加热至斑点清晰进行检视。结果如图10所示。

[0203] 从不同厂家薄层板展开的效果看，供试品在与对照品和对照药材相应的位置显相同颜色的斑点。三种厂家的薄层板均可用于桃核承气汤中桃仁、大黄、桂枝的鉴别。青岛海洋化工厂生产的薄层板展开效果稍差，烟台银龙硅胶板和德国默克板的展开效果相对较
好。

[0204] 以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同
时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的
改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。