技术领域
[0001] 本发明属于病毒检测技术领域，具体是指一种伊尼尼病毒速恒温检测试剂盒及应用。
相关背景技术
[0002] 伊尼尼病毒(Inini virus)是一种正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)的病毒，基因组为单股负链RNA。伊尼尼病毒最初于1964年，在巴西亚马逊雨林伊尼河畔的一只吸血蝙蝠中分离出来。伊尼病毒主要通过蚊虫叮咬传播，尤其是伊蚊和按蚊，可感染鸟类、哺乳动物和人类，是一种人畜共患传染病的病原体。伊尼尼病毒感染主要发生在热带和亚热带地区，人感染后会出现发烧、头痛、肌肉酸痛和结膜炎等症状，少数情况下感染会导致重症，包括脑炎、脑膜炎甚至死亡。传统荧光探针PCR技术存在的耗时长、仪器设备要求高、无法实现野外、床旁检测等缺陷。
[0003] 因此，有必要开发一种灵敏度高、耗时短、特异性强、检测准确性高、重复性好的伊尼尼病毒的检测引物或产品。
具体实施方式
[0041] 下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
[0042] 在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
[0043] 除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
[0044] 实施例1双通道恒温检测试剂盒的开发
[0045] 1、本实施例中采用重组酶聚合酶扩增技术，选取伊尼尼病毒高拷贝数的核衣壳蛋白N基因序列作为检测靶基因，利用MEGA11软件设计出了多个引物和探针试验组，交由公司合成，然后在核酸扩增检测分析仪上，对这些不同引物和探针试验组分别进行恒温扩增测试，再对它们产生的扩增曲线规则度、起峰时间、扩增效率、达到平台期所需时间和特异性等数据进行分析比较，筛选出扩增曲线最规则、起峰时间最早、扩增效率最高、特异性最好的一组引物对和探针，序列信息如表1中SEQ ID NO.1‑3所示。其中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2是引物对，SEQ ID NO.3是探针。探针SEQ ID NO.3所示核苷酸序列中，自5’端起第31位碱基dT标记有发光基团FAM，dT后连接脱碱基位点dSpacer，第32位碱基dT标记有淬灭基团BHQ1，3’末端标记有封闭基团C3Spacer。
[0046] M13噬菌体内部阳性质控特异性探针如表1中SEQ ID NO.4所示，探针SEQ ID NO.4自5’端起第30位碱基dT标记有发光基团HEX，dT后连接脱碱基位点dSpacer，第31位碱基dT标记有淬灭基团BHQ1，3’末端标记有封闭基团C3 Spacer。引物序列与伊尼尼病毒相同，而探针是M13噬菌体特异的，这样能保证M13噬菌体内部阳性对照可以随着反应进行而产生扩增曲线，同时不会因为反应体系中引物序列过多而干扰伊尼尼病毒的正常检测。
[0047] 表1
[0048]
[0049] 试剂盒内还包括以下组份：
[0050] 酶混合物：包含逆转录酶、重组酶、链置换DNA聚合酶、UNG酶和单链结合蛋白的混合物；
[0051] 2×反应缓冲液：
[0052] 包含dNTP和dUTP等的反应缓冲液；
[0053] 醋酸镁：280mM的醋酸镁溶液；
[0054] 阳性对照品：含伊尼尼病毒阳性标准品的T克隆质粒溶液，即含伊尼尼病毒扩增序5 4
列(Taxonomy ID:159146)的T克隆质粒溶液，标准品的浓度依次为1×10拷贝/mL、1×10拷
3 2 1
贝/mL、1×10拷贝/mL、1×10拷贝/mL和1×10拷贝/mL；
[0055] M13噬菌体内部阳性质控品：含M13噬菌体序列的T克隆质粒溶液，如图1所示，构建步骤为：体外合成序列如SEQ ID NO.5所示的M13噬菌体内部阳性质控DNA片段插入到T载体中得到本申请的含有M13阳性内对照DNA的质粒，又称M13噬菌体内部阳性质控品；
[0056] 阴性对照品：超纯无菌水。
[0057] 2、伊尼尼病毒的双通道恒温检测方法
[0058] (1)病毒核酸的提取
[0059] 在采集样本中加入10μl M13噬菌体内部阳性质控品，然后用商品化的病毒RNA提取试剂盒进行提取，最后得到RNA溶液。
[0060] (2)重组酶聚合扩增体系
[0061] 取5μl RNA作为模板，按下表2，在检测管中配置反应体系，再向检测管盖上加入2.5μl醋酸镁溶液，盖上管盖，上下颠倒混匀5次，然后低速瞬时离心，将管盖液体甩下来。
[0062] 表2双通道恒温扩增的反应体系
[0063]
[0064] (3)恒温扩增检测程序为：42℃5分钟；42℃20秒(收集荧光信号)，45个循环。
[0065] (4)得到实时荧光扩增结果，对扩增曲线进行分析判断，判断原则为：
[0066] 当FAM荧光通道有扩增曲线，HEX荧光通道有或无扩增曲线时，判断样品为伊尼尼病毒核酸阳性；
[0067] 当FAM荧光通道无扩增曲线，且HEX荧光通道有扩增曲线时，判断样品为伊尼尼病毒核酸阴性；
[0068] 当FAM荧光通道无扩增曲线，且HEX通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需重新提取标本RNA和重新扩增检测。
[0069] 3、实验结果
[0070] 伊尼尼病毒标准品扩增曲线如图1所示，标准品是含伊尼尼病毒扩增序列的T克隆5 4 3 2
质粒溶液，标准品的浓度依次为1×10 拷贝/mL、1×10拷贝/mL、1×10拷贝/mL、1×10 拷
1 2
贝/mL和1×10拷贝/mL，此外还有阴性对照，由图可见标准品的扩增曲线规则，且在1×10
5
～1×10拷贝/mL范围内呈良好线性关系。同时，加到标准品和阴性对照中的M13噬菌体内部阳性质控品的扩增曲线正常，如图2所示，说明本次实验的提取和扩增过程正常。
[0071] 实施例2伊尼尼病毒的双通道恒温检测试剂盒的性能测定
[0072] 1、准确性验证
[0073] 病毒核酸检测的金标准是基因组测序，由于缺乏阳性样本，我们将病毒阳性标准品质粒加入到临床血液样本中，获得5份血液模拟阳性样本，然后取5份阴性血液样本，用测序法与本试剂盒方法进行检测比较，分析本试剂盒的准确性，结果如下表3所示。
[0074] 表3准确度检测结果
[0075]
[0076]
[0077] 由表3可知：5份测序阳性标本全部被检出，5份测序阴性样本均为未检出，阳性符合率和阴性符合率均为100％,表明该试剂盒的准确性为100％(10/10)。
[0078] 2、特异性验证
[0079] 试剂盒的特异性是通过检测其他病原体来评估，本实施例选择了80种血液、呼吸道、人畜共患及其他常见病原体阳性标本或质粒模拟阳性标本，涵盖病毒、细菌、真菌和寄生虫，结果如下表4。
[0080] 表4本发明的特异性分析
[0081]
[0082]
[0083] 由表4可知，此发明对80种病原体无扩增，表明本发明提供的伊尼尼病毒双通道恒温扩增检测方法的特异性为100％。
[0084] 3、灵敏度检测
[0085] 灵敏度也即最低检测限，是指将阳性标本经过梯度稀释后，在最低稀释梯度的同一个标本上中测到靶核酸的可能性在统计学上概率>95％。用于灵敏度评估的样本在每个需评估的浓度水平检测次数应不少于20次，以至少19次出现阳性扩增信号为合格。在此，我们将伊尼尼病毒的阳性标准品质粒按一定拷贝数倍比稀释后，每一个稀释度平均分为20个样本，用此发明的方法进行检测，出现19次及以上阳性的该拷贝数即为最低检测限，结果见表5。
[0086] 表5本发明的灵敏度分析
[0087]
[0088]
[0089] 由表5可知，在10拷贝/ml浓度时，检出率为95％，低于此浓度时，检出率不足95％。由此可见，表明本发明提供的伊尼尼病毒双通道恒温检测试剂盒的灵敏度为10拷贝/mL。
[0090] 实施例3临床检测
[0091] 将伊尼尼病毒阳性质粒质控品分别加入到全血、血清、血浆、尿液、脑脊液、肺泡灌洗液和咽拭子中，模拟阳性临床样本，用本发明试剂盒进行检测，结果如图4所示，可知：伊尼尼病毒阳性的全血、血清、血浆、尿液、脑脊液、肺泡灌洗液和咽拭子均有规则扩增曲线，病毒阳性对照和病毒阴性对照正常。由此证明本方法可适用于伊尼尼病毒感染疑似患者的全血、血清、血浆、尿液、脑脊液、肺泡灌洗液和咽拭子的检测。
[0092] 实施例4本发明试剂盒与传统荧光探针PCR检测试剂盒的性能参数比较比较[0093] 查询到网上有两款伊尼尼病毒的荧光探针PCR检测试剂，采购后我们将这两款荧光探针PCR试剂盒与本发明试剂盒进行了综合比较，比较结果如下表6所示。
[0094] 表6本发明与传统荧光探针PCR检测试剂盒的灵敏度比较
[0095]
[0096]
[0097] 由表6可知：
[0098] 在灵敏度方面，本发明试剂盒灵敏度为10拷贝/ml，荧光探针PCR试剂盒A的灵敏度为2000拷贝/ml，荧光探针PCR试剂盒B的灵敏度均为1000拷贝/mL；
[0099] 在检测耗时方面，本发明试剂盒耗时25分钟，荧光探针PCR试剂盒A和荧光探针PCR试剂盒B检测的耗时均约为2.5小时；本发明试剂盒加入了UNG酶，有防污染性能，而荧光探针PCR试剂盒A和荧光探针PCR试剂盒B没有防污染措施；本发明试剂盒有内部阳性质控措施，能监控从RNA提取到恒温扩增整个实验过程，防止假阴性情况发生，而荧光探针PCR试剂盒A和荧光探针PCR试剂盒B均没有内部阳性质控；
[0100] 本发明试剂盒可检测全血、血清、血浆、尿液、脑脊液、肺泡灌洗液和咽拭子，而荧光探针PCR试剂盒A和荧光探针PCR试剂盒B只可检测血清和血浆。
[0101] 由此可见，本发明试剂盒的灵敏度明显高于荧光探针PCR检测试剂盒A和B，检测耗时远少于荧光探针PCR检测试剂盒A和B，检测标本种类多于荧光探针PCR检测试剂盒A和B，且具备这两款荧光探针PCR检测试剂盒所没有的防污染和防假阴性优点。
[0102] 最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0103] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0104] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
