[0001] 本申请涉及清洁洗涤用品领域，具体涉及一种抗菌消炎天然植物皂及其制备方法。

[0002] 肥皂是一种传统的清洁日化用品，原料来自于动植物脂肪、脂肪酸与碱生成的盐。一般的肥皂生产商会因为节约生产成本使用低廉易得的动物油脂进行制皂，而植物性油脂轻薄且富含多种维生素及微量元素，能够对皮肤起到滋养作用，具有去污能力强、对人体刺激少的优点。随着生活水平的提高和整体素质的日益提高，人们也逐渐意识到天然植物原料有着其他原料不可比拟的优势(健康，安全，易得)，在肥皂的选择上也不例外，对纯天然的追求使得人们倾向于使用纯天然的肥皂，以消除添加剂的安全隐患，追求更佳的使用效果。

[0003] 手工皂最早始于日本、美国等国家，并逐渐在东南亚地区流行，一般手工皂可以在制皂过程中进行颜色、形态、功效的即时修改，达到量身定做效果的同时享受艺术创造的乐趣，并且能够使成皂更加温和滋润，故在新皂的研制过程中往往使用手工制皂的方法。

[0004] 作为云南腾冲具有悠久利用历史的香叶树，自20世纪50‑60年代在腾冲当地用于生产肥皂，群众普遍反映香叶树油肥皂安全、性能好，但缺乏相关实验数据进行支撑。随着洗手液、洗衣粉的普遍使用，导致香叶树制皂的传统民间知识难以推广并逐渐流失。

[0021] 为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

[0022] 下面，通过具体实施案例对本发明的技术方案进行详细说明。

[0023] 实施例：原料油脂成分和抗菌活性筛选

[0024] 1、香叶树果实不同部位油脂脂肪酸组成

[0025] 基于现有技术已知的香叶树果实不同部位油脂脂肪酸组成(表1)。

[0026] 表1香叶树果实不同部位油脂脂肪酸组成(罗凡,费学谦,车运舒等.香叶树挥发油、油脂等主要成分分析[J].林业科学研究,2015,28(02):284‑288.)

[0027]

[0028]

[0029] 2.抗菌活性

[0030] 2.1试验材料

[0031] 实验器材：超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)、恒温培养箱(日本SANYO公司)、压力蒸汽灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司)、普通冰箱(青岛海尔电器有限公司)、超低温冰箱(日本ANYO公司)、电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)、分析天平(德国Sartorius公司)、TECAN GENIOS多功能酶标仪(奥地利Tecan Group Ltd公司)、96孔板(美国CORNING公司)。SLS(货号：L4509)、胎牛血清(FBS，货号：F8687)、磷酸盐缓冲盐水(PBS，目录编号：BSS‑1006)、培养基(DMEM，货号为D0819)、EDTA胰蛋白酶(货号59428C)和青霉素链霉素溶液(PSS编号：TMS‑AB2)。以上实验用品均从Sigma‑Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)获得。电子分析天平(AL204，瑞士梅特勒‑托莱多有限公司)、超声波清洗机(KQ‑5200E，中国曙峰企业有限公司)、旋转蒸发器(瑞士布奇公司布奇R‑210)、真空隔膜泵(LVS301zp，德国Ilmvac有限公司)、超纯水系统(milli‑r012plus，美国Millipore Co.，Ltd.)、Flex PCR仪器(美国赛默科技有限公司Quant StudioTM 6)、显微镜(徕卡DM4B，德国徕卡仪器有限公司)，实验中使用恒温培养箱(WH‑05，德国维根斯有限公司)、离心机(康宁，美国西格玛‑奥尔德里奇有限公司)、细胞计数仪(K2，美国Nexcelom有限公司)、多功能酶标仪(Envision，美国Perkinlemer有限公司)、超微量紫外分光光度计(Gen5，美国BioTek公司)，Quercetin槲皮素(货号：SQ8030)、Griess试剂(货号：G9440)获得于北京索莱宝科技有限公司，L‑NLI(I8021‑10MG)购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

[0032] 测试菌株：金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)，蜡状芽孢杆菌(CMCC 63302)和大肠杆菌(ATCC 8739)购自BNCC。MRSA(JCSC 2172)，MRSA(JCSC 4469)，MRSA(JCSC 4744)由T.Ito和K.Hiramatsu友情提供。

[0033] 受试细胞株：小鼠单核巨噬细胞Raw 264.7(中国医学科学院基础医学研究所)[0034] 2.2抗菌活性筛选

[0035] 采用刃天青(resazurin)显色法(Franzblau,Scott G.,et al."Rapid,low‑technology MIC determination with clinical Mycobacterium tuberculosis isolates by using the microplate Alamar Blue assay."Journal of clinical microbiology 36.2(1998):362‑366.)，刃天青是一种无毒的氧化还原染料，因其安全、经济等特点已被广泛用于真菌及细菌的药敏实验。在细胞质中，刃天青可在多种还原酶的作用下由蓝色态被还原为粉色，刃天青的减少与细菌数量的增加存在直接关系)来测定化合物的最低抑菌浓度(MIC)。MIC值被认为是保持蓝色(表示无生长)的最低浓度或从蓝色变成略微紫色的第一稀释梯度(相当于显著的生长抑制)。本实验将使用96孔板稀释梯度法，同时测定多种化合物的MIC。将用25％甘油保藏的菌种接种于MHB培养液(Mueller‑Hinton肉汤，广东环凯微生物科技有限公司)，然后置于37℃的恒温培养箱中培养12h。将培养好的细6
胞菌悬液用MHB培养液稀释至OD 600值为0.07左右，即可得到1.25×10CFU/mL的菌液。将
5mL OD 600值为0.07的待测菌悬液与7.5mL100μg/mL的刃天青(sigma)溶液混匀，在96孔板第一排加入180μL的刃天青混匀物，其他排加入100μL。在96孔板第一排加入20μL已溶解于二甲基亚砜的待测化合物，将第一排溶液混合均匀后，取100μL该溶液移至第二排并混合均匀。其他排进一步复制相同的操作，依次进行2倍梯度稀释。最后将96孔板置于37℃恒温培养箱中培养8‑12h。基于溶液的颜色变化确定MIC值。

[0036] 过夜培养至指数增长期的所需菌种用MHB培养液稀释至OD 600值为0.07左右，即[0037] 1.25×106CFU/mL待测菌液。取5mL待测菌液，与7.5mL100μg/mL的刃天青溶液混匀采用倍半稀释法后将96孔板置于37℃恒温培养箱8h左右，取出观察实验结果并记录MIC值。

[0038] 2.3抗炎活性筛选

[0039] 通过Griess反应测定NO含量(Sun,Jie,et al."Measurement of nitric oxide production in biological systems by using Griess reaction assay."Sensors 3.8(2003):276‑284.)，检测不同原料油脂对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞产生NO的抑制作用。实验分为空白对照组(只有细胞)、模型组(加LPS组)、实验组(加入原料油脂)、阳性对照组
5
(加入L‑NIL)。RAW264.7细胞以5.0×10/mL密度接种于96孔板中，培养24h。空白对照组无处理；LPS模型组细胞加入500ng/mL LPS刺激24h。各给药组分别给以100μM受试化合物预孵
30min，进行梯度稀释，然后加入500ng/mL LPS治愈培养箱中刺激24h。取50μL细胞上清液，依次加入等体积Griess试剂A、Griess试剂B，轻轻振荡数次，待各孔反应液完全混匀后，于
540nm波长检测各孔OD值，根据公式计算NO抑制率。

[0040] 试验结果

[0041] 2.1抗菌活性

[0042] 表2原料油脂对不同菌株的MIC值(mg/mL)

[0043]

[0044] 注：G+表示革兰氏阳性菌，G‑表示革兰氏阴性菌

[0045] 由表2可知：作为本发明的原料油脂，白臭油与黑臭油对于各种细菌均具有抑制生长的效果，其中黑臭油的MIC值较低，表明其具有良好的抗菌效果，能够通过抑制细菌生长为肌肤提供全面的保护。此外，可通过改变皮肤表面的微生态环境，减少有害菌种的滋生，从而降低痤疮等皮肤问题的发生率，这样调节皮肤菌群的作用，有助于维持皮肤的健康状态。

[0046] 2.2抗炎活性

[0047] 表3原料油脂对RAW264.7炎症细胞产生NO的抑制率

[0048] IC50白臭油 1.2±0.23mg/mL
黑臭油 0.60±0.11mg/mL
L‑NIL 7.5μmol

[0049] 由表3可知：作为本发明的原料油脂，白臭油与黑臭油对RAW264.7炎症细胞产生NO抑制率的IC50值低，表明其具有良好的抗炎效果。首先，有助于减轻皮肤炎症，缓解敏感和不适感；其次，对皮肤非常温和，有助于保持皮肤的天然水分平衡，相比于含有刺激性化学成分的肥皂，使用具有抗炎效果植物油脂制作的肥皂更加柔和，减少了对皮肤的刺激，适合各种肤质，尤其适合皮肤易过敏人群。

[0050] 原料制备实施例1：白臭油的制备

[0051] a.采摘风干：在每年的9‑10月采摘成熟香叶树果实，去除果皮后，种子放置于阴凉通风处进行1‑2周自然风干；b.加热烘干：风干的种子采取缓慢升温的方式烘干处理，在烘箱中加热到40℃烘干1h，然后温度提高到60℃加热1h，再逐步升高到80℃加热5h，再缓慢降低到室温；c.粉碎：通过加热烘干的种子含水率控制在6％‑8％，然后使用粉碎机对烘干后的种子进行粉碎处理；d.包饼：将粉碎后的香叶树种渣用稻草包裹起来，用脚踩实，包成饼状；e.撞榨：将多个油饼整齐摆放入木榨机的榨槽，插入木塞、木楔、进桩，在室温20±5℃下，来回牵引撞桩向木桩撞击，利用强大的外力撞击大木楔再逐渐挤进木塞之间，靠其产生的巨大力量去推动、挤压木塞和油饼起到物理压榨油饼的效果；f.收集保存：物理压榨时油脂从油饼中不断流出，收集得到白臭油，颜色为黄白色，常温下呈膏状或固态，储存于阴凉干燥处。

[0052] 原料制备实施例2：黑臭油的制备

[0053] a.采摘风干：在每年的9‑10月采摘成熟香叶树果实，放置于阴凉通风处进行1‑2周自然风干；b.加热烘干：风干的果实采取缓慢升温的方式烘干处理，在烘箱中加热到40℃烘干1h，然后温度提高到60℃加热1h，再逐步升高到80℃加热5h，再缓慢降低到室温；c.粉碎：通过加热烘干的果实使用粉碎机对其进行粉碎处理；d.包饼：将粉碎后的香叶树果渣用稻草包裹起来，用脚踩实，包成饼状；e.撞榨：将多个油饼整齐摆放入木榨机的榨槽，插入木塞、木楔、进桩，在室温20±5℃下，来回牵引撞桩向木桩撞击，利用强大的外力撞击大木楔再逐渐挤进木塞之间，靠其产生的巨大力量去推动、挤压木塞和油饼起到物理压榨油饼的效果；f.收集保存：物理压榨时油脂从油饼中不断流出，收集得到黑臭油，颜色为黑色，常温下呈粘稠状，储存于阴凉干燥处。

[0054] 实施例1

[0055] 1、原料的准备

[0056] 按重量份数计准备下述原料：白臭油50.5份、黑臭油50.5份，氢氧化钠10.4份，去离子水14.6份。

[0057] 其中，白臭油和黑臭油的制备方法如前述原料制备实施例1和2。

[0058] 2、抗菌消炎天然植物皂的制备方法：

[0059] 按配方将白臭油与黑臭油混合置于水浴槽中加热溶解并充分混合；使用去离子水水配制氢氧化钠溶液并趁热加入液态混合油脂中；于水浴槽85℃下使用搅拌器进行搅拌均匀；15min后将皂液倒入模具中进行冷却；固定成型后脱模自然冷却风干制得抗菌消炎天然植物皂。

[0060] 实施例2

[0061] 1、原料的准备

[0062] 按重量份数计准备下述原料：白臭油51份、黑臭油51份，氢氧化钠11份，去离子水15.4份。

[0063] 其中，白臭油和黑臭油的制备方法如前述原料制备实施例1和2。

[0064] 2、抗菌消炎天然植物皂制备方法：

[0065] 按配方将白臭油与黑臭油混合置于水浴槽中加热溶解并充分混合；使用去离子水水配制氢氧化钠溶液并趁热加入液态混合油脂中；于水浴槽85℃下使用搅拌器进行搅拌均匀；5min后将皂液倒入模具中进行冷却；固定成型后脱模自然冷却风干制得抗菌消炎天然植物皂。

[0066] 实施例3

[0067] 1、原料的准备

[0068] 按重量份数计准备下述原料：白臭油52.5份、黑臭油52.5份，氢氧化钠12份，去离子水16.8份。

[0069] 其中，白臭油和黑臭油的制备方法如前述原料制备实施例1和2。

[0070] 2、抗菌消炎天然植物皂制备方法：

[0071] 按配方将白臭油与黑臭油混合置于水浴槽中加热溶解并充分混合；使用去离子水水配制氢氧化钠溶液并趁热加入液态混合油脂中；于水浴槽85℃下使用搅拌器进行搅拌均匀；10min后将皂液倒入模具中进行冷却；固定成型后脱模自然冷却风干制得抗菌消炎天然植物皂。

[0072] 实施例4

[0073] 以实施例3制备得到的抗菌消炎天然植物皂为例，进行理化性质测定：

[0074] 测定方法：参考QB/T2486‑2008进行。

[0075] 测定结果见表4。

[0076] 表4抗菌消炎天然植物皂的理化性质测定结果

[0077]测试项目(％) 实施例3
干钠皂含量 66
乙醇不溶物含量 1.4
游离苛性碱含量 0.03
总游离碱含量 0.18
氯化物含量 0.1
总五氧化二磷含量 未检出
总有效物含量 93
水分和挥发物含量 2
净含量 107.80

[0078] 由表4可知，本发明抗菌消炎天然植物皂理化性质符合国家相关标准，具有良好的理化性质。

[0079] 实施例5

[0080] 对实施例1‑3制备得到的抗菌消炎天然植物皂进行杀菌性能测定：

[0081] 试验材料：

[0082] 实施例1‑3制得植物皂；LB营养琼脂(北京奥博星生物技术有限公司，BR，货号：02‑137)；LB肉汤(北京奥博星生物技术有限公司，BR，货号：02‑136)；Dey/Engley中和肉汤基础(Solarbio，BR，货号：LA1400)

[0083] 试验方法：

[0084] 参考QB/T2738‑2012设计实验步骤：a.取50μL金黄色葡萄球菌(大肠杆菌)菌液加入到5mL LB肉汤培养基中置于恒温振荡摇床中200r/min，37℃，12h培养；b.通过紫外分光5 6
光度计用PBS液将菌悬液稀释至浓度为5*10‑4.5*10cfu/mL；c.样品皂以消毒硬水配成1:5的溶液；d.吸取皂液5.0mL于灭菌试管中，30℃静置5min；e.吸取菌悬液0.1mL于5.0mL皂液中，迅速混匀，并立即计时20s；f.作用至20s后，取混合液0.5mL，加入到含4.5mL中和剂的无菌试管中，充分混匀；g.中和10min后，吸取1mL于培养皿中，用牛肉膏蛋白胨培养基做倾注法接种。恒温培养箱中35±2℃培养48h后，做活菌菌落计数；h.以PBS液代替皂液，同时进行上述步骤作空白对照。

[0085] 评价标准：

[0086] 杀菌率＝(对照样品平均菌落数‑试验样品平均菌落数)/对照样品平均菌落数[0087] 杀菌率≥90％则该产品具有杀菌作用

[0088] 试验结果见表5。

[0089] 表5抗菌消炎天然植物皂杀菌性能测定结果(X±S)

[0090]金黄色葡萄球菌(％) 大肠杆菌(％)
实施例1 97.54±0.32 97.26±0.16
实施例2 99.34±0.23 98.95±0.17
实施例3 99.97±0.12 99.06±0.26

[0091] 其中以实施例3的效果最佳，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌杀菌效果均是最高的，均达到99％以上。

[0092] 实施例6

[0093] 对实施例1‑3制备得到的抗菌消炎天然植物皂进行抑菌性能测定：

[0094] 试验材料：

[0095] 实施例1‑3制得植物皂；LB营养琼脂(北京奥博星生物技术有限公司，BR，货号：02‑137)；LB肉汤(北京奥博星生物技术有限公司，BR，货号：02‑136)；Dey/Engley中和肉汤基础(Solarbio，BR，货号：LA1400)

[0096] 试验方法：

[0097] 以PBS液代替实施例5试验方法中中和剂进行抑菌检测

[0098] 评价标准：

[0099] 抑菌率＝(对照样品平均菌落数‑试验样品平均菌落数)/对照样品平均菌落数[0100] 抑菌率≥90％则该产品具有较强抑菌作用

[0101] 50％≤抑菌率＜90％则该产品具有抑菌作用

[0102] 试验结果见表6。

[0103] 表6抗菌消炎天然植物皂抑菌性能测定结果(X±S)

[0104]金黄色葡萄球菌(％) 大肠杆菌(％)
实施例1 96.37±0.42 95.48±0.35
实施例2 95.62±0.37 96.93±0.11
实施例3 98.02±0.14 99.68±0.33

[0105] 由表5、6可知，本发明抗菌消炎天然植物皂符合国家相关标准，具有良好的杀菌抑菌效果。其中以实施例3的效果最佳，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌姝抑菌效果均是最高的。

[0106] 实施例7

[0107] 对实施例1‑3制备得到的抗菌消炎天然植物皂进行急性皮肤刺激性测定。

[0108] 试验材料：

[0109] 实施例1‑3制得植物皂；8周龄SPF级KM小鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)；医用无菌敷贴(60*70mm)(可孚医疗公司)；灌胃针头(GEGW‑RM1，中科生命生物科技有限公司)

[0110] 试验方法：

[0111] 参考GB 7919‑1987设计实验步骤：a.试验前24h将小鼠背部脊柱及两侧毛剪掉，不可损伤表皮，去离子水溶解皂粒(5：1)配制成溶液；b.取受试物0.1mL滴在3cm*3cm大小的无菌敷贴上敷贴于去毛皮肤，以去离子水作为对照组(每组5个平行)，敷用24h后，拆除敷贴，并用温水除去残留受试物；c.于除去受试物后的1、24、48h分别观察涂抹部位皮肤反应并进行皮肤反应积分和刺激强度评价：

[0112] 评价标准如表7所示。

[0113] 表7皮肤刺激反应评分

[0114]

[0115] 表8皮肤刺激强度评价

[0116]

[0117]

[0118] 试验结果见表9。

[0119] 表9抗菌消炎天然植物皂急性皮肤刺激性测定结果

[0120]皮肤刺激性评分 刺激性评价
实施例1 0 无刺激性
实施例2 0 无刺激性
实施例3 0 无刺激性

[0121] 由表9可知，本发明抗菌消炎天然植物皂符合国家相关标准，无刺激性，具有对人体皮肤温和不刺激的特点。