[0001] 本发明涉及分子生物学和生物工程领域，具体涉及一种苔黑酚葡萄糖苷的生产方法，还涉及高产苔黑酚葡萄糖苷的解脂耶氏酵母工程菌株及其构建。

[0002] 苔黑酚葡萄糖苷(Orcinol  glucoside，结构如下所示)主要从石蒜科(Amaryllidaceae)仙茅属(Curculigo)植物仙茅(Curculigo orchioides Gaertn.)的根茎中提取获得，具有抗抑郁、抗焦虑、抗氧化、抗骨质疏松及免疫调节等多种药理学活性。

[0003]

[0004] 研究发现苔黑酚葡萄糖苷处理后，能够来改善慢性应激大鼠抑郁行为。以苔黑酚葡萄糖苷为成分开发的“奥生乐赛特”被认为具有治疗前景的天然抗抑郁药物，已应用于临床研究(传统中药筛选出抗抑郁症1类新药国家药监局颁发奥生乐赛特临床试验批件[J].科技传播，20110508)。

[0005] 但仙茅植株的生长周期长、对环境要求严格且产量低。近年来，随着生物技术的不断进步，合成生物学的快速发展有效的解决了植物提取法面临的困难。微生物合成法不仅具有操作简便、自然资源破坏少的优点，并且能克服化学合成法存在的环境污染问题。但是，目前尚无在微生物中实现苔黑酚葡萄糖苷从头合成的相关报道，因此本领域迫切需要开发一种生物法合成，在微生物中实现有效获得大量高纯度的苔黑酚葡萄糖苷，满足科学试验及市场应用需求。

[0084] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

[0085] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0086] 下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0087] 本发明中所涉及的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)出发菌株为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)W29ΔKU70，该菌株为W29野生型菌株在其KU70位点整合了Cas9蛋白的编码基因。W29ΔKU70菌株为记载于“Wang,Y  N,Liu  X  N,Chen B H et al.Metabolic engineering of Yarrowia lipolytica for scutellarin production,2022,7,958‑964)”一文中的第2.1节“All metabolically modified Y.lipolytica strains were from the strain W29 carrying Cas9 on the KU70locus”，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验，不得他用。

[0088] 为了构建整合菌株，通过CRISPR/Cas9系统构建了用于基因敲入的单个gRNA载体和同源供体质粒。

[0089] gRNA原始敲除质粒载体为pCfB6627，购于Addgene(https://www.addgene.org/)，货号#106159，以原始gRNA质粒pCfB6627靶向不同整合位点(KU80、IntC‑2、IntC‑3、IntD‑1)构建G1‑G4敲除载体。四个载体的具体构建方法参见实施例1步骤一。

[0090] 同源供体质粒即整合载体以pMD‑19T为骨架，构建而成带有不同的整合位点的整合载体p1‑KU80、p2‑IntC‑2、p3‑IntC‑3、p4‑IntD‑1，整合位点序列参照文献(Holkenbrink C,Dam M I,Kildegaard K R,et al.EasyCloneYALI:CRISPR/Cas9‑based synthetic toolbox for engineering of the yeast Yarrowia lipolytica[J].Biotechnology Journal,2018,13(9):1700543.)。四个载体的具体构建方法参见实施例1步骤二。

[0091] 本发明中为了提高来源于仙茅(Curculigo orchioides Gaertn)的苔黑酚合酶基因CorcORS1的表达量，对其进行解脂耶氏酵母密码子偏好性优化，优化后的CorcORS1的核苷酸序列通过化学合成的方法(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)如SEQ ID No.1所示(编码SEQ ID No.5所示氨基酸序列)。优化后的来源于兴安杜鹃(Rhododendron dauricum)的苔黑酚合酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示(编码SEQ ID No.6所示氨基酸序列)；优化后的来源于马缨杜鹃(rhododendron delavayi)的苔黑酚合酶的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示(编码SEQ ID No.7所示氨基酸序列)。

[0092] 本发明中，为了提高来源于仙茅(Curculigo orchioides Gaertn)的苔黑酚糖基转移酶基因CorcUGT31的表达量，对其进行解脂耶氏酵母密码子偏好性优化，优化后的基因CorcUGT31的核苷酸序列通过化学合成的方法(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)如SEQ ID No.4所示(编码SEQ ID No.8所示氨基酸序列)。

[0093] 下述实施例中所涉及到的引物序列如表1所示。所有引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

[0094] 表1、本发明引物序列

[0095]

[0096]

[0097]

[0098] 本发明涉及的培养基及配制

[0099] 1.YNB培养基：20g/L葡萄糖、1.7g/L YNB、5g/L硫酸铵，溶剂为去离子水；配制：将各成分溶于去离子水，搅拌溶解，灭菌，即得。

[0100] 2.YPD培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，溶剂为去离子水；配制：将各成分溶于去离子水，搅拌溶解，灭菌，即得。

[0101] 3.补料分批发酵MM培养基：初始培养基400mL含有硫酸铵(5g/L)、磷酸二氢钾(3g/L)、硫酸镁(0.5g/L)、葡萄糖(40g/L)，2mL微量金属溶液、2mL维生素溶液。

[0102] 微量金属溶液(1L)：4.5g二水氯化钙,4.5g七水硫酸锌,3g七水硫酸铁,1g硼酸,1g四水氯化锰,0.4g钼酸钠二水,0.3g六水合氯化钴,0.1g五水硫酸铜,0.1g碘化钾,15g乙二胺四乙酸。将除乙二胺四乙酸外的所有成分溶解在900mL超纯水(pH＝6)中制备微量金属溶液。然后将溶液轻轻加热，加入乙二胺四乙酸。最后将pH调至4，溶液体积调至1L，高压蒸压(121℃，20min)。该溶液保存在4℃。

[0103] 维生素溶液(1L)：50mg生物素，200mg对氨基苯丙酸，1g烟酸，1g泛酸钙，1g维生素B6，1g维生素B1，25g肌醇。生物素在20mL 0.1M NaOH中溶解，加入900mL水。用盐酸将pH调至6.5，然后加入其余的维生素。在加入间肌醇前后，将pH值重新调整为6.5。最终体积调整为
1L，经无菌过滤后4℃保存。

[0104] 4.MM补料培养基(1L)：葡萄糖(600g/L)、硫酸铵(25g/L)、磷酸二氢钾(15g/L)、硫酸镁(2.5g/L)、10mL维生素溶液、10mL微量金属盐溶液。

[0105] 除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0106] 实施例1、整合质粒载体构建

[0107] 一、G1‑KU80、G2‑IntC‑2、G3‑IntC‑3、G4‑IntD‑1敲除载体的构建[0108] 以gRNA载体pCfB6627为模板，用引物pgRNA‑ZHONG‑5F/G1‑3R以及引物pgRNA‑ZHONG‑3R/G1‑5F扩增得到G1‑KU80上下游片段，用引物pgRNA‑ZHONG‑5F/G2‑3R以及引物pgRNA‑ZHONG‑3R/G2‑5F扩增得到G2‑IntC‑2上下游片段，用引物pgRNA‑ZHONG‑5F/G3‑3R以及引物pgRNA‑ZHONG‑3R/G3‑5F扩增得到G3‑IntC‑3上下游片段，用引物pgRNA‑ZHONG‑5F/G4‑3R以及引物pgRNA‑ZHONG‑3R/G4‑5F扩增得到G4‑IntD‑1上下游片段。对于G1‑KU80敲除载体的构建，将G1‑KU80上下游片段通过Gibson assembly的方法组装得到G1‑KU80敲除载体，同理可以得到其他敲除载体(G2‑IntC‑2、G3‑IntC‑3和G4‑IntD‑1)。

[0109] 上述PCR反应中所用PCR酶为南京诺唯赞生物科技股份有限公司的2×Phanta Max Master Mix聚合酶。上述PCR扩增体系如下：Phanta Max Master Mix聚合酶25μL；上游引物(10μM)2μL；下游引物(10μM)2μL；模板2μL；ddH2O 19μL。

[0110] 使用US INC.公司的无缝克隆试剂盒进行Gibson组装，体系如下：Super‑Fusion Cloning Mix(2×)5μL；线性化载体片段50‑200ng；插入DNA片段50‑200ng；
ddH2O补足至10μL。

[0111] 将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒。

[0112] 二、同源供体质粒p1‑KU80、p2‑IntC‑2、p3‑IntC‑3、p4‑IntD‑1的构建[0113] 首先用引物p‑T1‑F/R将载体pMD‑19T线性化得到载体骨架片段，然后以解脂耶氏酵母W29ΔKU70基因组为模板，用引物p1‑KU80‑UP‑F/R以及引物p1‑KU80‑DN‑F/R分别扩增得到KU80整合位点的上下游同源臂，用引物p2‑IntC‑2‑UP‑F/R以及引物p2‑IntC‑2‑DN‑F/R分别扩增得到整合位点IntC‑2的上下游同源臂，用引物p3‑IntC‑3‑UP‑F/R以及引物p3‑IntC‑3‑DN‑F/R分别扩增得到整合位点IntC‑3的上下游同源臂，用引物p4‑IntD‑1‑UP‑F/R以及引物p4‑IntD‑1‑DN‑F/R分别扩增得到整合位点IntD‑1的上下游同源臂，用引物p1‑tPEX20‑F/R扩增得到带有同源臂的终止子tPEX20片段，用引物p1‑tlip2‑F/R扩增得到带有同源臂的终止子tLIP2片段。

[0114] 对于p1‑KU80载体的构建，将线性化的pMD‑19T载体片段，以及KU80位点上下游同源臂片段，带有同源臂的终止子tPEX20片段和终止子tLIP2片段通过Gibson assembly的方法组装得到P1‑KU80载体。同理可以得到其他整合载体(p2‑IntC‑2、p3‑IntC‑3、p4‑IntD‑1)。各载体经测序验证正确。

[0115] 三、重组整合质粒载体p1‑ORS1、p1‑ORS2、p1‑ORS3的构建

[0116] (1)以解脂耶氏酵母W29ΔKU70基因组为模板，以引物对pGPD‑F/pGPD‑R和pTEFIN‑F/pTEFIN‑R，分别扩增获得解脂耶氏酵母内源强启动子GPD和TEFIN，再通过引物pGPD‑F/p2‑tpex20‑pGPD扩增得到融合双向启动子片段。

[0117] (2)用引物对p‑T1‑tPEX20‑F/p‑T1‑tLIP2‑F对p1‑KU80载体进行PCR扩增得到线性化p1‑KU80载体骨架。

[0118] (3)以SEQ ID No.1所示DNA片段为模板，用引物对CorcORS1‑F/R扩增获得基因CorcORS1；

[0119] (4)将上述获得的线性化p1‑KU80骨架片段，双向启动子片段，CorcORS1基因片段，利用Gibson组装方法组装获得重组载体。CorcORS1基因在启动子TEFIN和终止子tLIP2的控制下表达，转入大肠杆菌DMT感受态，利用氨苄标签，在含有100mg/ml氨苄的LB平板上筛选阳性克隆，经过菌落PCR，序列比对等，最终获得重组质粒载体p1‑ORS1。p1‑ORS1质粒谱图如图1所示。

[0120] (5)以SEQ ID No.2所示DNA片段为模板，用引物对RdauORS1‑F/R扩增获得基因RdauORS1；同理将上述获得的线性化p1‑KU80骨架片段，双向启动子片段，RdauORS1基因片段，利用Gibson组装方法组装可获得重组质粒载体p1‑ORS2。

[0121] (6)以SEQ ID No.3所示DNA片段为模板，用引物对RdelORS1‑F/R扩增获得基因RdelORS1；同理以将上述获得的线性化p1‑KU80骨架片段，双向启动子片段，基因片段，利用Gibson组装方法组装可获得重组质粒载体p1‑ORS3。

[0122] 四、重组整合质粒载体p1‑ORS1‑UGT31、p2‑ORS1‑UGT31、p3‑ORS1‑UGT31的构建[0123] (1)以解脂耶氏酵母W29ΔKU70基因组为模板，以引物对pGPD‑F/pGPD‑R和pTEFIN‑F/pTEFIN‑R，分别扩增获得解脂耶氏酵母内源强启动子GPD和TEFIN，再通过引物pGPD‑F/pTEFIN‑R扩增得到双基因通用的融合双向启动子片段。

[0124] (2)用引物对p‑T1‑tPEX20‑F/p‑T1‑tLIP2‑F对p1‑KU80载体进行PCR扩增得到线性化p1‑KU80载体骨架。

[0125] (3)以SEQ ID No.1所示DNA片段为模板，用引物对CorcORS1‑F/R扩增获得基因CorcORS1；以SEQ ID No.4所示DNA片段为模板，用引物对CorcUGT31‑F/R用于扩增基因CorcUGT31。

[0126] (4)将上述获得的线性化p1‑KU80骨架片段，双向启动子片段，CorcORS1基因片段，CorcUGT31基因片段，利用Gibson组装方法组装获得重组载体。CorcORS1在启动子TEFIN和和终止tLIP2的控制下表达，CorcUGT31在启动子PGD和终止tPEX20的控制下表达，转入大肠杆菌DMT感受态，利用氨苄标签，在含有100mg/ml氨苄的LB平板上筛选阳性克隆，经过菌落PCR，序列比对等，最终获得重组质粒载体p1‑ORS1‑UGT31。p1‑ORS1‑UGT31质粒谱图如图2所示。

[0127] (5)用引物对p‑T1‑tPEX20‑F/p‑T1‑tLIP2‑F对p1‑IntC‑2载体进行PCR扩增得到线性化p1‑IntC‑2载体骨架。然后将线性化p2‑IntC‑2骨架片段和上述获得的双向启动子片段，CorcORS1基因片段，CorcUGT31基因片段通过Gibson组装方法组装获得重组载体，最终经测序验证正确后获得重组质粒载体p2‑ORS1‑UGT31。p2‑ORS1‑UGT32质粒谱图如图3示。

[0128] (6)用引物对p‑T1‑tPEX20‑F/p‑T1‑tLIP2‑F对p3‑IntC‑3载体进行PCR扩增得到线性化p3‑IntC‑3载体骨架。然后将线性化p3‑IntC‑3骨架片段和上述获得的双向启动子片段，CorcORS1基因片段，CorcUGT31基因片段通过Gibson组装方法组装获得重组载体，最终经测序验证正确后获得重组质粒载体p3‑ORS1‑UGT31。p3‑ORS1‑UGT31质粒谱图如图4所示。

[0129] (7)用引物对p‑T1‑tPEX20‑F/p‑T1‑tLIP2‑F对p4‑IntD‑1载体进行PCR扩增得到线性化p4‑IntD‑1载体骨架。然后将线性化p4‑IntD‑1骨架片段和上述获得的双向启动子片段，CorcORS1基因片段，CorcUGT31基因片段通过Gibson组装方法组装获得重组载体，最终经测序验证正确后获得重组质粒载体p4‑ORS1‑UGT31。p4‑ORS1‑UGT31质粒谱图如图5所示。

[0130] 实施例2、用于生产苔黑酚/苔黑酚葡萄糖苷的重组解脂耶氏酵母的构建[0131] 一、用于生产苔黑酚的重组解脂耶氏酵母的构建

[0132] (1)以p1‑ORS1重组质粒为模板，用引物YL‑P1‑F/YL‑P1‑R进行PCR扩增，获得线性化目的基因片段T1‑ORS1(包含CorcORS1基因)，利用常规醋酸锂转化方法将T1‑ORS1片段及其对应的敲除质粒G1‑KU80转化入解脂耶氏酵母W29ΔKU70的基因组中的KU80位点上。

[0133] (2)在含有潮霉素B(400mg/L)和诺斯尔菌素(250mg/L)的YPD平板上筛选阳性转化子。酵母转化后涂布到YPD平板上，30℃的培养箱生长1‑2天后，将单个克隆挑放入装有2.5mL YNB培养基的深孔板中，30℃，220rpm条件下培养24h。经过菌落PCR，序列验证正确，获得的重组工程菌株命名为YL‑S1。

[0134] 同理以p1‑ORS2重组质粒为模板，用引物YL‑P1‑F/YL‑P1‑R进行PCR扩增，获得线性化目的基因片段T1‑ORS2(包含RdauORS1基因)，利用常规醋酸锂转化方法将T1‑ORS2片段及其对应的敲除质粒G1‑KU80转化入解脂耶氏酵母W29ΔKU70的基因组中的KU80位点上。经过菌落PCR，序列验证正确，可获得重组工程菌株YL‑S2。

[0135] 以p1‑ORS3重组质粒为模板，用引物YL‑P1‑F/YL‑P1‑R进行PCR扩增，获得线性化目的基因片段T1‑ORS3(包含RdelORS1基因)，利用常规醋酸锂转化方法将T1‑ORS3片段及其对应的敲除质粒G1‑KU80转化入解脂耶氏酵母W29ΔKU70的基因组中的KU80位点上。经过菌落PCR，序列验证正确，可获得重组工程菌株YL‑S3。

[0136] 二、用于生产苔黑酚葡萄糖苷的重组解脂耶氏酵母的构建

[0137] (1)以p1‑ORS1‑UGT31重组质粒为模板，用引物YL‑P1‑F/YL‑P1‑R进行PCR扩增，获得线性化目的基因片段T1‑ORS1‑UGT31(包含CorcORS1基因和CorcUGT31的基因)，利用常规醋酸锂转化方法将T1‑ORS1‑UGT31片段及其对应的敲除质粒G1‑KU80转化入解脂耶氏酵母W29ΔKU70的基因组中的KU80位点上。

[0138] (2)在含有潮霉素B(400mg/L)和诺斯尔菌素(250mg/L)的YPD平板上筛选阳性转化子。酵母转化后涂布到YPD平板上，30℃的培养箱生长1‑2天后，将单个克隆挑放入装有2.5mL YNB培养基的深孔板中，30℃，220rpm条件下培养24h。经过菌落PCR，序列验证正确，获得的重组工程菌株命名为YL‑G1。

[0139] (3)将YL‑G1重新接种到含有潮霉素B的新YPD平板上，培养1天，以获得更成功的gRNA标记缺失。从培养皿中挑取单菌落接种到装有2.5mL YNB培养基的24孔板中以供后续菌株改造。

[0140] (4)为增加基因CorcORS1和基因CorcUGT31的拷贝数，以p2‑ORS1‑UGT31重组质粒载体为模板，用引物YL‑P2‑F/YL‑P2‑R进行PCR扩增，获得线性化目的基因片段T2‑ORS1‑UGT31(包含CorcORS1基因和CorcUGT31的基因)，将T2‑ORS1‑UGT31片段及其对应的敲除质粒G2‑IntC‑2通过醋酸锂法转化整合至菌株YL‑G1基因组上的IntC‑2位点，经过菌落PCR，序列验证正确，获得重组解脂耶氏酵母菌株YL‑G2。

[0141] (5)为进一步增加CorcORS1基因和CorcUGT31基因的拷贝数，以p3‑ORS1‑UGT31重组质粒载体为模板，用引物YL‑P3‑F/YL‑P3‑R进行PCR扩增，获得线性化目的基因片段T3‑ORS1‑UGT31(包含CorcORS1基因和CorcUGT31的基因)，将T3‑ORS1‑UGT31片段及其对应的敲除质粒G3‑IntC‑3通过醋酸锂法转化整合至菌株YL‑G2基因组上的IntC‑3位点，经过菌落PCR，序列验证正确，获得重组解脂耶氏酵母菌株YL‑G3。

[0142] (6)为更进一步地继续增加CorcORS1基因和CorcUGT31的基因拷贝数，以p4‑ORS1‑UGT31重组质粒载体为模板，用引物YL‑P4‑F/YL‑P4‑R进行PCR扩增，获得线性化目的基因片段T4‑ORS1‑UGT31(包含CorcORS1基因和CorcUGT31的基因)，将T4‑ORS1‑UGT31片段及其对应的敲除质粒G4‑IntD‑1通过醋酸锂法转化整合至菌株YL‑G3基因组上的IntD‑1位点，经过菌落PCR，序列验证正确，获得重组解脂耶氏酵母菌株YL‑G4。

[0143] 实施例3、重组解脂耶氏酵母摇瓶发酵培养

[0144] 一、重组解脂耶氏酵母YL‑S1、YL‑S2和YL‑S3摇瓶发酵培养生产苔黑酚[0145] (1)将重组解脂耶氏酵母YL‑S1、YL‑S2和YL‑S3分别在含有2.5mL YNB培养基的24孔板YNB培养基中活化48h。

[0146] (2)按照1:30(体积比)的接种比例将步骤(1)所得种子液接种到灭菌后的含30mL YNB培养基的250mL摇瓶中。30℃，220rpm摇瓶发酵4天后，进行HPLC‑MS分析定量苔黑酚。

[0147] 二、重组解脂耶氏酵母YL‑G1、YL‑G2、YL‑G3和YL‑G4摇瓶发酵培养生产苔黑酚葡萄糖苷

[0148] (1)将重组解脂耶氏酵母YL‑G1、YL‑G2、YL‑G3和YL‑G4分别在YNB培养基种子活化48h。

[0149] (2)按照1:30(体积比)的接种比例将步骤(1)所得种子液接种到灭菌后的含30mL YNB培养基的250mL摇瓶中。30℃，220rpm摇瓶发酵4天后，进行HPLC‑MS分析定量苔黑酚葡萄糖苷。

[0150] 三、发酵产物的HPLC‑MS鉴定

[0151] HPLC分析：

[0152] 仪器：Agilent 1260；

[0153] 色谱柱：ZORBAX SB‑C18 column(4.6×250mm，5‑Micron，USA)；

[0154] 柱温：30℃；

[0155] 紫外检测器：检测波长275nm；

[0156] 流动相：A相为0.1％甲酸；B相为乙腈；

[0157] 起始浓度：A:93％，B:7％；

[0158] 梯度洗脱程序：浓度为B相百分比:0‑3min，7％；3‑20min，17％；20‑22min，90％；22‑25min，7％；25‑30min，7％；

[0159] LC‑MS分析：

[0160] 质谱仪：Bruker‑micrOTOF‑II；

[0161] ESI离子源，负离子模式；

[0162] 核质比(m/z)：50‑1000；

[0163] 氮气流速：6.0升/分钟；

[0164] 温度：180℃

[0165] 雾化器压力：1bar；

[0166] 探头电压：14.5KV。

[0167] 四、结果与分析

[0168] 经过HPLC检测结果显示，重组解脂耶氏酵母菌株YL‑S1在基因CorcORS1催化下，可以直接生成新产物(图6，峰1)，出峰时间为18.51min，与苔黑酚标品一致，质谱结果显示(图7)该新产物分子量为123[M‑H]‑，这与苔黑酚标品的分子量一致。说明CorcORS1基因发挥功能能够合成苔黑酚。

[0169] 经过HPLC检测结果显示，重组解脂耶氏酵母菌株YL‑G1在基因CorcORS1和基因CorcUGT31共同催化下，可以直接生成新产物(图8，峰2)，出峰时间为10.65min，与苔黑酚葡萄糖苷标品一致，质谱结果显示(图9)该新产物分子量为285[M‑H]‑，这与苔黑酚葡萄糖苷标品的分子量一致。说明CorcORS1基因和CorcUGT31基因共同发挥功能能够合成苔黑酚葡萄糖苷。

[0170] 本发明重组解脂耶氏酵母发酵生产苔黑酚/苔黑酚葡萄糖苷的反应路线如图10所示。重组解脂耶氏酵母YL‑S1、YL‑S2和YL‑S3摇瓶发酵培养生产苔黑酚结果如图11所示，其中重组菌株YL‑S1摇瓶发酵生产苔黑酚的产量最高，达到0.43g/L。重组解脂耶氏酵母YL‑G1、YL‑G2、YL‑G3和YL‑G4摇瓶发酵培养生产苔黑酚葡萄糖苷结果如图12所示，其中重组菌株YL‑G4摇瓶发酵生产苔黑酚葡萄糖苷的产量最高，达到2.26g/L。

[0171] 实施例4、重组解脂耶氏酵母YL‑G4在生物反应器中的补料分批发酵的应用[0172] 一、重组解脂耶氏酵母YL‑G4在生物反应器中的补料分批发酵生产苔黑酚葡萄糖苷

[0173] (1)从甘油保种管中取出重组解脂耶氏酵母YL‑G4菌液在YPD固体平板上划线，在30℃培养48h，从平板中挑取一个单菌落接种于4mL MM培养基，在30℃、220rpm培养48h，在对数生长期以1:30(体积比)的比例转接于含有新鲜的40mL MM培养基的250mL摇瓶中，在30℃，220rpm培养48h。

[0174] (2)将摇瓶内菌体5000rpm离心5min，双蒸水洗涤2次，以20mL双蒸水重悬菌体，将细胞悬浮液接种到1.3L迪必尔生物反应器中(最初含有400mL MM培养基)培养。发酵温度为30℃，自动接入浓度为4M的氢氧化钾，pH值保持在5.0，在补料分批阶段，通过搅拌(600‑
1200rpm)和气流(0.5SLPM‑1.5SLPM)的两级串联，DO保持在30％。待葡萄糖耗尽，接入MM补料培养基，控制葡萄糖含量在1g/L以下。

[0175] (3)补料培养基中含有600g/L D‑葡萄糖，其余成分是初始培养基的5倍。每12小时取样检测发酵罐中葡萄糖浓度，同时利用HPLC分析对苔黑酚葡萄糖苷进行定量，利用冷冻干燥机对菌体进行冻干称重进行生物量检测。发酵结果表明重组菌株YL‑G4在发酵108h时，菌体的生物量为51.67g/L，苔黑酚葡萄糖苷产量达到43.46g/L(图13)。

[0176] 以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。