[0002] 本发明涉及一系列多肽的制备及其应用，具体涉及式(II)所示序列的多肽。

[0003] 非酒精性脂肪肝(NAFLD)的全球发病率高达25％，其中非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的全球发病率约为3％‑8％。部分NASH病人将进一步进展为肝硬化及肝癌，是目前终末期肝病和肝移植的主要原因之一。NASH发病机制复杂，目前并没有FDA批准的药物用于治疗该疾病。多项临床前研究发现，葡萄糖依赖性促胰岛素样肽(GIP)/胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)双重激动剂可用于NASH治疗。礼来在研药物GLP‑1/GIP双重激动剂Tirzepatide临床研究结果显示其可改善NASH相关的转氨酶等相关标记物，展现了治疗NASH的潜力。

[0004] GLP‑1激动剂可以通过多途径协同作用治疗NASH。如：GLP‑1激动剂可降低循环中的肿瘤坏死因子(TNF)‑α、白细胞介素IL‑1β，IL‑6，CD163及hsCRP水平，达到抑制炎症的药效。GIP是由小肠的神经内分泌K细胞分泌的多肽，可在GLP‑1激动剂治疗基础上进一步缓解肝脏脂肪合成，因此GLP‑1/GIP双重激动剂对NASH治疗具有协同效应。

[0181] 下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。

[0182] 中间体A‑1

[0183]

[0184] 步骤1：挂树脂

[0185] 1.1称取4g氯代(邻氯苯基)二苯基甲烷树脂(替代度S＝1.00mmol/g)和1.54g A‑1_1，加入到反应柱中，再加入DCM(25mL)，随后加入3mL N,N‑二异丙基乙胺至反应柱氮气鼓气2小时，然后加入4mL MeOH至反应柱氮气继续鼓气30分钟，排废，直至没有液体流出，加入DMF(50mL)洗涤5次每次1分钟，排废，直至没有液体流出。

[0186] 1.2加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20分钟，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次每次1分钟，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0187] 步骤2：氨基酸的偶联

[0188] 2.1A‑1_1的偶联

[0189] 1.称取A‑1_1(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加20mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0190] 2.在25℃的环境中反应20分钟，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0191] 3.抽掉反应液，用DMF洗涤5次，每次1分钟，排废，直至没有液体流出。

[0192] 2.2A‑1_a的偶联

[0193] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20分钟，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0194] 2.称取A‑1_a(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(3.00eq)补加20mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0195] 3.在25℃的环境中反应0.5小时，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0196] 4.抽掉反应液，用DMF(50mL)洗涤5次，每次1分钟，排废，直至没有液体流出。

[0197] 2.3A‑1_b的偶联

[0198] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20分钟，排废，直至没有液体流出，加入DMF(50mL)

[0199] 洗涤5次每次1分钟，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0200] 2.称取A‑1_b(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加20mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0201] 3.在25℃的环境中反应0.5小时，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0202] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次，每次1分钟，排废，直至没有液体流出。

[0203] 步骤3：切割及粗肽干燥

[0204] 3.1按如下体积配置切割液

[0205]

[0206] 3.2将配好的60mL切割液倒入装有干燥后的肽树脂的反应器中，在反应器中鼓气20分钟，过滤，滤液加入烧瓶中，重复此操作两次，将两次收集的切割液旋干后得到A‑1。

[0207] 中间体A‑2

[0208]

[0209] 参考中间体A‑1的合成，得到中间体A‑2。

[0210] 中间体A‑3

[0211]

[0212] 参考中间体A‑1的合成，得到中间体A‑3。

[0213] 中间体A‑4

[0214]

[0215] 参考中间体A‑1的合成，得到中间体A‑4。

[0216] 实施例1

[0217]

[0218] 步骤1：称取1.34g 4‑(2’,4’‑二甲氧基苯基‑芴甲氧羰基‑氨甲基)‑苯氧基乙酰氨基‑甲基二苯甲胺树脂(替代度Sub＝0.3mmol/g)，加入到反应柱中，再加入DMF(50mL)至反应柱氮气鼓气体2小时，排废，直至没有液体流出，加入DMF(50mL)洗涤5次每次1分钟，排废，直至没有液体流出。

[0219] 步骤2：加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20分钟，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次每次1分钟，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0220] 步骤3：氨基酸的偶联

[0221] 3.1Fmoc‑Ser(tBu)‑OH的偶联

[0222] 1.称取Fmoc‑Ser(tBu)‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0223] 2.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0224] 3.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0225] 3.2Fmoc‑Pro‑OH的偶联

[0226] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0227] 2.称取Fmoc‑Pro‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0228] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0229] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0230] 3.3Fmoc‑Pro‑OH的偶联

[0231] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。四氯苯醌检测，树脂蓝色。

[0232] 2.称取Fmoc‑Pro‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0233] 3.在25℃的环境中反应0.5h，四氯苯醌检测，树脂无色透明。

[0234] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0235] 3.4Fmoc‑Pro‑OH的偶联

[0236] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。四氯苯醌检测，树脂蓝色。

[0237] 2.称取Fmoc‑Pro‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0238] 3.在25℃的环境中反应0.5h，四氯苯醌检测，树脂无色透明。

[0239] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0240] 3.5Fmoc‑Ala‑OH的偶联

[0241] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。四氯苯醌检测，树脂蓝色。

[0242] 2.称取Fmoc‑Ala‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0243] 3.在25℃的环境中反应0.5h，四氯苯醌检测，树脂无色透明。

[0244] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0245] 3.6Fmoc‑Gly‑OH的偶联

[0246] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0247] 2.称取Fmoc‑Gly‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0248] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0249] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0250] 3.7Fmoc‑Ser(tBu)‑OH的偶联

[0251] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0252] 2.称取Fmoc‑Ser(tBu)‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0253] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0254] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0255] 3.8Fmoc‑Ser(tBu)‑OH的偶联

[0256] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0257] 2.称取Fmoc‑Ser(tBu)‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0258] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0259] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0260] 3.9Fmoc‑Pro‑OH的偶联

[0261] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0262] 2.称取Fmoc‑Pro‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0263] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0264] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0265] 3.10Fmoc‑Gly‑OH的偶联

[0266] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。四氯苯醌检测，树脂蓝色。

[0267] 2.称取Fmoc‑Gly‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0268] 3.在25℃的环境中反应0.5h，四氯苯醌检测，树脂无色透明。

[0269] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0270] 3.11Fmoc‑Gly‑OH的偶联

[0271] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0272] 2.称取Fmoc‑Gly‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0273] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0274] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0275] 3.12Fmoc‑Ala‑OH的偶联

[0276] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0277] 2.称取Fmoc‑Ala‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0278] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0279] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0280] 3.13Fmoc‑Ile‑OH的偶联

[0281] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0282] 2.称取Fmoc‑Ile‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0283] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0284] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0285] 3.14Fmoc‑Leu‑OH的偶联

[0286] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0287] 2.称取Fmoc‑Leu‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0288] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0289] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0290] 3.15Fmoc‑Trp(Boc)‑OH的偶联

[0291] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0292] 2.称取Fmoc‑Trp(Boc)‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0293] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0294] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0295] 3.16Fmoc‑Lys(Dde)‑OH的偶联

[0296] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0297] 2.称取Fmoc‑Lys(Dde)‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0298] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0299] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0300] 3.17Fmoc‑Val‑OH的偶联

[0301] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0302] 2.称取Fmoc‑Val‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0303] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0304] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0305] 3.18Fmoc‑Phe‑OH的偶联

[0306] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0307] 2.称取Fmoc‑Phe‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0308] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0309] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0310] 3.19Fmoc‑Ala‑OH的偶联

[0311] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0312] 2.称取Fmoc‑Ala‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0313] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0314] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0315] 3.20Fmoc‑Lys(Alloc)‑OH的偶联

[0316] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0317] 2.称取Fmoc‑Lys(Alloc)‑OH(2.0eq)加入到上述树脂中，加入HOBT(2.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸和HOBT溶解后加入DIC(2.00eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0318] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0319] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0320] 3.21Fmoc‑Gln(Trt)‑OH的偶联

[0321] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0322] 2.称取Fmoc‑Gln(Trt)‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0323] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0324] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0325] 3.22Fmoc‑Ala‑OH的偶联

[0326] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0327] 2.称取Fmoc‑Ala‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0328] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0329] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0330] 3.23Fmoc‑Ile‑OH的偶联

[0331] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0332] 2.称取Fmoc‑Ile‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0333] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0334] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0335] 3.24Fmoc‑Lys(Boc)‑OH的偶联

[0336] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0337] 2.称取Fmoc‑Lys(Boc‑OH(2.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0338] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0339] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0340] 3.25Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH的偶联

[0341] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0342] 2.称取Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH(6.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(12.0eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(5.70eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0343] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0344] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0345] 3.26Fmoc‑Leu‑OH的偶联

[0346] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0347] 2.称取Fmoc‑Leu‑OH(6.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(12.0eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(5.70eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0348] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0349] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0350] 3.27Fmoc‑Aib‑OH的偶联

[0351] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0352] 2.称取Fmoc‑Aib‑OH(6.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(12.0eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(5.70eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0353] 3.在25℃的环境中反应2h，茚三酮检测，树脂蓝色。

[0354] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0355] 3.28Fmoc‑Ile‑OH的偶联

[0356] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0357] 2.称取Fmoc‑Ile‑OH(6.0eq)加入到上述树脂中，加入HOAT(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸和HOAT溶解后加入DIC(6.00eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0358] 3.在25℃的环境中反应1h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0359] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0360] 3.29Fmoc‑Ser(tBu)‑OH的偶联

[0361] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0362] 2.称取Fmoc‑Ser(tBu)‑OH(6.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(12.0eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(5.70eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0363] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0364] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0365] 3.30Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH的偶联

[0366] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0367] 2.称取Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH(6.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(12.0eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(5.70eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0368] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0369] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0370] 3.31Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH的偶联

[0371] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0372] 2.称取Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH(6.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(12.0eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(5.70eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0373] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0374] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0375] 3.32Fmoc‑Ser(tBu)‑OH的偶联

[0376] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0377] 2.称取Fmoc‑Ser(tBu)‑OH(6.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(12.0eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(5.70eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0378] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0379] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0380] 3.33Fmoc‑Thr(tBu)‑OH的偶联

[0381] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0382] 2.称取Fmoc‑Thr(tBu)‑OH(6.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(12.0eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(5.70eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0383] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0384] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0385] 3.34Fmoc‑Phe‑OH的偶联

[0386] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0387] 2.称取Fmoc‑Phe‑OH(6.0q)加入到上述树脂中，加入DIEA(12.0eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(5.70eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0388] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0389] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0390] 3.35Fmoc‑Thr(tBu)‑OH的偶联

[0391] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0392] 2.称取Fmoc‑Thr(tBu)‑OH(6.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(12.0eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(5.70eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0393] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0394] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0395] 3.36Fmoc‑Gly‑OH的偶联

[0396] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0397] 2.称取Fmoc‑Gly‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0398] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0399] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0400] 3.37Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH的偶联

[0401] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0402] 2.称取Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH(6.0eq)加入到上述树脂中，加入HOBT(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸和HOBT溶解后加入DIC(6.00eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0403] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0404] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0405] 3.38Fmoc‑Aib‑OH的偶联

[0406] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0407] 2.称取Fmoc‑Aib‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0408] 3.在25℃的环境中反应过夜，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0409] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0410] 3.39Boc‑Tyr(tBu)‑OH的偶联

[0411] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。四氯苯醌检测，树脂蓝色。

[0412] 2.称取Boc‑Tyr(tBu)‑OH(6.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(12.0eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(5.70eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0413] 3.在25℃的环境中反应0.5h，四氯苯醌检测，树脂无色透明。

[0414] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0415] 3.40脱Alloc

[0416] 1.加入PhSiH3(10.0eq)和DCM(10mL)至反应柱中，氮气鼓起后加入Pd(PPh3)4(0.1eq)，氮气鼓起20min，反应2次，排废，直至没有液体流出。

[0417] 2.用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0418] 3.41Fmoc‑Ida‑OH的偶联

[0419] 1.称取Fmoc‑Ida‑OH(4..0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(8.00eq)补加10mLDMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(3.80eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0420] 2.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0421] 3.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0422] 3.42中间体A‑1的偶联

[0423] 1.加入10％的DBU/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。四氯苯醌检测，树脂蓝色。

[0424] 2.称取中间体A‑1(1.50eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(3.00eq)补加10mLDMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(1.45eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0425] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0426] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0427] 3.43脱Dde

[0428] 1.加入3％的肼/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起15min，排废，加入DMF(50mL)洗涤5次每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0429] 3.44关酰胺环

[0430] 1.将DIEA(3.0eq)加入到上述树脂的DMF溶液中，后把用DMF溶解好的HATU(1.5eq)缓慢滴加至反应柱中，鼓氮气。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0431] 2.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0432] 3.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0433] 4.用MeOH(50mL)收缩树脂，每次3min，排废，直至没有液体流出，将树脂倒出干燥，备用。

[0434] 4.切割及粗肽干燥

[0435] 4.1按如下体积配置切割液

[0436]

[0437]

[0438] 4.2将干燥后的肽树脂加入到配好的切割液中，在摇床震荡2.5小时，过滤，滤液加入到10倍体积冰异丙醚中，离心，再用异丙醚洗涤5次。在真空干燥2小时得到粗肽，纯化得到多肽化合物WX‑001，多肽分子量经ESI‑MS进行确认，计算值为[M+4H]/4为1228.6，检测值为1228.7。

[0439] 实施例2

[0440]

[0441] 参考WX‑001的合成，得到多肽WX‑002。多肽分子量经ESI‑MS进行确认，计算值[M+4H]/4为1243.1，检测值为1242.8。

[0442] 实施例3

[0443]

[0444] 参考WX‑001的合成，得到多肽WX‑003。多肽分子量经ESI‑MS进行确认，计算值[M+4H]/4为1232.1，检测值为1232.2。

[0445] 实施例4

[0446]

[0447] 参考WX‑001的合成，得到多肽WX‑004。多肽分子量经ESI‑MS进行确认，计算值[M+4H]/4为1228.6，检测值为1228.2。

[0448] 实施例5

[0449]

[0450] 步骤1：称取1.34g 4‑(2’,4’‑二甲氧基苯基‑芴甲氧羰基‑氨甲基)‑苯氧基乙酰氨基‑甲基二苯甲胺树脂(替代度Sub＝0.3mmol/g)，加入到反应柱中，再加入DMF(50mL)至反应柱氮气鼓气体2小时，排废，直至没有液体流出，加入DMF(50mL)洗涤5次每次1分钟，排废，直至没有液体流出。

[0451] 步骤2：加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20分钟，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次每次1分钟，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0452] 步骤3：氨基酸的偶联

[0453] 3.1Fmoc‑Ser(tBu)‑OH的偶联

[0454] 1.称取Fmoc‑Ser(tBu)‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0455] 2.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0456] 3.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0457] 3.2Fmoc‑Pro‑OH的偶联

[0458] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0459] 2.称取Fmoc‑Pro‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0460] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0461] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0462] 5.重复3.2步骤，完成以下氨基酸的偶联

[0463]

[0464]

[0465] 3.40脱Alloc

[0466] 1.加入PhSiH3(10.0eq)和DCM(10mL)至反应柱中，氮气鼓起后加入Pd(PPh3)4(0.1eq)，氮气鼓起20min，反应2次，排废，直至没有液体流出。

[0467] 2.用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0468] 3.41Fmoc‑Ida‑OH的偶联

[0469] 1.称取Fmoc‑Ida‑OH(4..0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(8.00eq)补加10mLDMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(3.80eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0470] 2.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0471] 3.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0472] 3.42中间体A‑1的偶联

[0473] 1.加入10％的DBU/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。四氯苯醌检测，树脂蓝色。

[0474] 2.称取中间体A‑1(1.50eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(3.00eq)补加10mLDMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(1.45eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0475] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0476] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0477] 3.43脱Dde

[0478] 1.加入3％的肼/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起15min，排废，加入DMF(50mL)洗涤5次每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0479] 3.44关酰胺环

[0480] 1.将DIEA(3.0eq)加入到上述树脂的DMF溶液中，后把用DMF溶解好的HATU(1.5eq)缓慢滴加至反应柱中，鼓氮气。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0481] 2.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0482] 3.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0483] 4.用MeOH(50mL)收缩树脂，每次3min，排废，直至没有液体流出，将树脂倒出干燥，备用。

[0484] 4.切割及粗肽干燥

[0485] 4.1按如下体积配置切割液

[0486]

[0487] 4.2将干燥后的肽树脂加入到配好的切割液中，在摇床震荡2.5小时，过滤，滤液加入到10倍体积冰异丙醚中，离心，再用异丙醚洗涤5次。在真空干燥2小时得到粗肽，纯化得到多肽WX‑005。多肽分子量经ESI‑MS进行确认，计算值[M+4H]/4为1232.6，检测值为1232.5。

[0488] 实施例6

[0489]

[0490] 参考WX‑001的合成，得到多肽WX‑006。多肽分子量经ESI‑MS进行确认，计算值[M+4H]/4为1232.4，检测值为1232.4。

[0491] 实施例7

[0492]

[0493] 参考WX‑001的合成，得到多肽WX‑007。多肽分子量经ESI‑MS进行确认，计算值[M+4H]/4为1218.1，检测值为1218.3。

[0494] 实施例8

[0495]

[0496] 参考WX‑001的合成，得到多肽WX‑008。多肽分子量经ESI‑MS进行确认，计算值[M+4H]/4为1228.6，检测值为1228.6。

[0497] 实施例9

[0498]

[0499] 步骤1：称取1.34g 4‑(2’,4’‑二甲氧基苯基‑芴甲氧羰基‑氨甲基)‑苯氧基乙酰氨基‑甲基二苯甲胺树脂(替代度Sub＝0.3mmol/g)，加入到反应柱中，再加入DMF(50mL)至反应柱氮气鼓气体2小时，排废，直至没有液体流出，加入DMF(50mL)洗涤5次每次1分钟，排废，直至没有液体流出。

[0500] 步骤2：加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20分钟，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次每次1分钟，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0501] 步骤3：氨基酸的偶联

[0502] 3.1Fmoc‑Ser(tBu)‑OH的偶联

[0503] 1.称取Fmoc‑Ser(tBu)‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0504] 2.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0505] 3.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0506] 3.2Fmoc‑Pro‑OH的偶联

[0507] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0508] 2.称取Fmoc‑Pro‑OH(3.0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0509] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0510] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0511] 5.重复3.2步骤，完成以下氨基酸的偶联

[0512]

[0513]

[0514] 3.40脱Alloc

[0515] 1.加入PhSiH3(10.0eq)和DCM(10mL)至反应柱中，氮气鼓起后加入Pd(PPh3)4(0.1eq)，氮气鼓起20min，反应2次，排废，直至没有液体流出。

[0516] 2.用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0517] 3.41 Fmoc‑Ida‑OH的偶联

[0518] 1.称取Fmoc‑Ida‑OH(4..0eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(8.00eq)补加10mLDMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(3.80eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0519] 2.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0520] 3.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0521] 3.42中间体A‑1的偶联

[0522] 1.加入10％的DBU/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。四氯苯醌检测，树脂蓝色。

[0523] 2.称取中间体A‑1(1.50eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(3.00eq)补加10mLDMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(1.45eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0524] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0525] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0526] 3.43脱Dde

[0527] 1.加入3％的肼/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起15min，排废，加入DMF(50mL)洗涤5次每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0528] 3.44关酰胺环

[0529] 1.将DIEA(3.0eq)加入到上述树脂的DMF溶液中，后把用DMF溶解好的HATU(1.5eq)缓慢滴加至反应柱中，鼓氮气。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0530] 2.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0531] 3.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0532] 4.用MeOH(50mL)收缩树脂，每次3min，排废，直至没有液体流出，将树脂倒出干燥，备用。

[0533] 4.切割及粗肽干燥

[0534] 4.1按如下体积配置切割液

[0535]

[0536] 4.2将干燥后的肽树脂加入到配好的切割液中，在摇床震荡2.5小时，过滤，滤液加入到10倍体积冰异丙醚中，离心，再用异丙醚洗涤5次。在真空干燥2小时得到粗肽，纯化得到多肽WX‑009。多肽分子量经ESI‑MS进行确认，计算值[M+4H]/4为1247.1，检测值为1247.2。

[0537] 实施例10

[0538]

[0539] 步骤1：称取1.08g 4‑(2’,4’‑二甲氧基苯基‑芴甲氧羰基‑氨甲基)‑苯氧基乙酰氨基‑甲基二苯甲胺树脂(替代度Sub＝0.37mmol/g)，加入到反应柱中，再加入DMF(50mL)至反应柱氮气鼓气体2h，排废，直至没有液体流出，加入DMF(50mL)洗涤5次每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0540] 步骤2：加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0541] 步骤3：氨基酸的偶联

[0542] 3.1Fmoc‑Ser(tBu)‑OH的偶联

[0543] 1.称取Fmoc‑Ser(tBu)‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0544] 2.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0545] 3.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0546] 3.2Fmoc‑Pro‑OH的偶联

[0547] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0548] 2.称取Fmoc‑Pro‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0549] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0550] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0551] 3.3Fmoc‑Pro‑OH的偶联

[0552] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。四氯苯醌检测，树脂蓝色。

[0553] 2.称取Fmoc‑Pro‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0554] 3.在25℃的环境中反应0.5h，四氯苯醌检测，树脂无色透明。

[0555] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0556] 3.4Fmoc‑Pro‑OH的偶联

[0557] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。四氯苯醌检测，树脂蓝色。

[0558] 2.称取Fmoc‑Pro‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0559] 3.在25℃的环境中反应0.5h，四氯苯醌检测，树脂无色透明。

[0560] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0561] 3.5Fmoc‑Ala‑OH的偶联

[0562] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。四氯苯醌检测，树脂蓝色。

[0563] 2.称取Fmoc‑Ala‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0564] 3.在25℃的环境中反应0.5h，四氯苯醌检测，树脂无色透明。

[0565] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0566] 3.6Fmoc‑Gly‑OH的偶联

[0567] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0568] 2.称取Fmoc‑Gly‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0569] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0570] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0571] 3.7Fmoc‑Ser(tBu)‑OH的偶联

[0572] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0573] 2.称取Fmoc‑Ser(tBu)‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0574] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0575] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0576] 3.8Fmoc‑Ser(tBu)‑OH的偶联

[0577] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0578] 2.称取Fmoc‑Ser(tBu)‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0579] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0580] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0581] 3.9Fmoc‑Pro‑OH的偶联

[0582] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0583] 2.称取Fmoc‑Pro‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0584] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0585] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0586] 3.10Fmoc‑Gly‑Gly‑OH的偶联

[0587] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。四氯苯醌检测，树脂蓝色。

[0588] 2.称取Fmoc‑Gly‑Gly‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0589] 3.在25℃的环境中反应0.5h，四氯苯醌检测，树脂无色透明。

[0590] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0591] 3.11Fmoc‑Ala‑OH的偶联

[0592] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0593] 2.称取Fmoc‑Ala‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0594] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0595] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0596] 3.12Fmoc‑Ile‑OH的偶联

[0597] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0598] 2.称取Fmoc‑Ile‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0599] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0600] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0601] 3.13Fmoc‑Leu‑OH的偶联

[0602] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0603] 2.称取Fmoc‑Leu‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0604] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0605] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0606] 3.14Fmoc‑Trp(Boc)‑OH的偶联

[0607] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0608] 2.称取Fmoc‑Trp(Boc)‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0609] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0610] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0611] 3.15Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH的偶联

[0612] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0613] 2.称取Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0614] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0615] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0616] 3.16Fmoc‑Val‑OH的偶联

[0617] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0618] 2.称取Fmoc‑Val‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0619] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0620] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0621] 3.17Fmoc‑Phe‑OH的偶联

[0622] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0623] 2.称取Fmoc‑Phe‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0624] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0625] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0626] 3.18Fmoc‑Ala‑OH的偶联

[0627] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0628] 2.称取Fmoc‑Ala‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0629] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0630] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0631] 3.19Fmoc‑Lys(Alloc)‑OH的偶联

[0632] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0633] 2.称取Fmoc‑Lys(Alloc)‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0634] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0635] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(5 0mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0636] 3.20Fmoc‑Gln(Trt)‑OH的偶联

[0637] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次，每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0638] 2.称取Fmoc‑Gln(Trt)‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0639] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0640] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0641] 3.21Fmoc‑Ala‑OH的偶联

[0642] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0643] 2.称取Fmoc‑Ala‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HBTU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0644] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0645] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0646] 3.22Fmoc‑Lys(Dde)‑OH的偶联

[0647] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0648] 2.称取Fmoc‑Lys(Dde)‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0649] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0650] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0651] 3.23Fmoc‑Lys(Boc)‑OH的偶联

[0652] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0653] 2.称取Fmoc‑Lys(Boc‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0654] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0655] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0656] 3.24Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH的偶联

[0657] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0658] 2.称取Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0659] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0660] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0661] 3.25Fmoc‑Leu‑OH的偶联

[0662] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0663] 2.称取Fmoc‑Leu‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0664] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0665] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0666] 3.26Fmoc‑Aib‑OH的偶联

[0667] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0668] 2.称取Fmoc‑Aib‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0669] 3.在25℃的环境中反应2h，茚三酮检测，树脂蓝色。

[0670] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0671] 3.27Fmoc‑Ile‑OH的偶联

[0672] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0673] 2.称取Fmoc‑Ile‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0674] 3.在25℃的环境中反应1h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0675] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0676] 3.28Fmoc‑Ser(tBu)‑OH的偶联

[0677] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0678] 2.称取Fmoc‑Ser(tBu)‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0679] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0680] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0681] 3.29Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH的偶联

[0682] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0683] 2.称取Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0684] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0685] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0686] 3.30Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH的偶联

[0687] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0688] 2.称取Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0689] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0690] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0691] 3.31Fmoc‑Thr(tBu)‑SerPsi(Me,Me)Pro‑OH的偶联

[0692] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0693] 2.称取Fmoc‑Thr(tBu)‑SerPsi(Me,Me)Pro‑OH(2.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(4.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(1.90eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0694] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0695] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0696] 3.32Fmoc‑Phe‑OH的偶联

[0697] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0698] 2.称取Fmoc‑Phe‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0699] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0700] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0701] 3.33Fmoc‑Thr(tBu)‑OH的偶联

[0702] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0703] 2.称取Fmoc‑Thr(tBu)‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0704] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0705] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0706] 3.34Fmoc‑Gly‑OH的偶联

[0707] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0708] 2.称取Fmoc‑Gly‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0709] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0710] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0711] 3.35Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH的偶联

[0712] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0713] 2.称取Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0714] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0715] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0716] 3.36Fmoc‑Aib‑OH的偶联

[0717] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0718] 2.称取Fmoc‑Aib‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0719] 3.在25℃的环境中反应过夜，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0720] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0721] 3.37Boc‑Tyr(tBu)‑OH的偶联

[0722] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。四氯苯醌检测，树脂蓝色。

[0723] 2.称取Boc‑Tyr(tBu)‑OH(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mL DMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0724] 3.在25℃的环境中反应0.5h，四氯苯醌检测，树脂无色透明。

[0725] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0726] 3.38脱Alloc

[0727] 1.加入PhSiH3(10.0eq)和DCM(20mL)至反应柱中，氮气鼓起后加入Pd(PPh3)4(0.10eq)，氮气鼓起20min，反应2次，排废，直至没有液体流出。

[0728] 2.用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0729] 3.39Fmoc‑Glu‑OAll的偶联

[0730] 1.称取Fmoc‑Glu‑OAll(3.00eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(6.00eq)补加10mLDMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(2.85eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0731] 2.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0732] 3.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0733] 3.40中间体A‑1的偶联

[0734] 1.加入20％的哌啶/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起20min，排废，直至没有液体流出。加入DMF(50mL)洗涤5次,每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0735] 2.称取中间体A‑1(1.50eq)加入到上述树脂中，加入DIEA(3.0 0eq)补加10mLDMF至反应柱中，鼓氮气，待氨基酸溶解后加入HATU(1.45eq)。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0736] 3.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0737] 4.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0738] 3.41脱Alloc

[0739] 1.加入PhSiH3(10.0eq)和DCM(20mL)至反应柱中，氮气鼓起后加入Pd(PPh3)4(0.10eq)，氮气鼓起20min，反应二次，排废，直至没有液体流出。

[0740] 2.用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0741] 3.42脱Dde

[0742] 1.加入3％的hydrazine hydrate/DMF(50mL)至反应柱中，氮气鼓起15mim，排废，加入DMF(50

[0743] mL)洗涤5次每次1min，排废，直至没有液体流出。茚三酮检测，树脂蓝色。

[0744] 3.42关酰胺环

[0745] 1.将DIEA(3.00eq)加入到上述树脂的DMF溶液中，后把用DMF溶解好的HATU(1.50eq)缓慢滴加至反应柱中，鼓氮气。调节好氮气使树脂均匀鼓起。

[0746] 2.在25℃的环境中反应0.5h，茚三酮检测，树脂无色透明。

[0747] 3.抽掉反应液，用DMF洗涤5次(50mL每次)，每次1min，排废，直至没有液体流出。

[0748] 4.用MeOH(50mL)收缩树脂，每次3min，排废，直至没有液体流出，将树脂倒出干燥，备用。

[0749] 4.切割及粗肽干燥

[0750] 4.1按如下体积配置切割液

[0751]

[0752] 4.2将干燥后的肽树脂加入到配好的切割液中，在摇床震荡2.5h，过滤，滤液加入到10倍体积冰异丙醚中，离心，再用异丙醚洗涤5次。在真空干燥2h得到粗肽，纯化。多肽分子量经ESI‑MS进行确认，计算值为1236.1，实测值为1236.0。

[0753] 实施例11

[0754]

[0755] 参考WX‑010的合成，得到多肽WX‑011。多肽分子量经ESI‑MS进行确认，计算值[M+4H]/4为1236.1，检测值为1236.0。

[0756] 实施例12

[0757]

[0758] 参考WX‑001的合成，使用中间体A‑2，得到多肽WX‑012。多肽分子量经ESI‑MS进行确认，计算值[M+4H]/4为1225.6，检测值为1225.7。

[0759] 实施例13

[0760]

[0761] 参考WX‑001的合成，使用中间体A‑3，得到多肽WX‑013。多肽分子量经ESI‑MS进行确认，计算值[M+4H]/4为1264.9，检测值为1264.6。

[0762] 实施例14

[0763]

[0764] 参考WX‑001的合成，使用中间体A‑4，得到多肽WX‑014。多肽分子量经ESI‑MS进行确认，计算值[M+4H]/4为1257.9，检测值为1257.8。

[0765] 生物测试数据

[0766] 测试例1：体外GLP‑1R/GIPR激动活性测试

[0767] A：主要材料：

[0768] 1)细胞株

[0769] 该细胞株由上海药明康德构建。详情见下表1。

[0770] 表1细胞株信息

[0771] 靶点 宿主细胞 克隆GLP‑1R HEK293 N/A
GIPR CHO N/A

[0772] 2)试剂与耗材

[0773] 表2试剂及耗材信息

[0774] 名称 批次. 货号 厂家cAMP检测盒 29F 62AM4PEJ Cisbio
1M HEPES 2120919 15630‑106 Invitrogen
Hanks平衡盐溶液(HBSS) 2185775 14025 Invitrogen
人血清白蛋白(HSA) SLCF7301 A1653‑10G 西格玛
酪蛋白 SLCC9458 C4765‑10mL 西格玛
3‑异丁基‑1‑甲基黄嘌呤(IBMX) STBF6061V I5879‑5G 西格玛
ECHO qualified 384孔板 0006433672 PP‑0200 Labcyte
OptiPlate‑384 8210‑19481 6007299 珀金埃尔默

[0775] 3)仪器

[0776] 表3仪器信息

[0777]名称 型号 厂家
EnVision envision2014 珀金埃尔默
TM
Vi‑cell counter Vi‑CELL XR Cell Viability Analyzer 贝克曼
Bravo Bravo V11 安捷伦
ECHO ECHO 555 Labcyte
TM
Centrifuge Allegra 25R Centrifuge 贝克曼

[0778] B.方法

[0779] 1)实验材料

[0780] 实验缓冲液

[0781] 表4缓冲液信息

[0782]

[0783] 检测试剂制备

[0784] 表5检测试剂信息

[0785]试剂 储存浓度 体积 终浓度
细胞裂解液 1x 9.5mL ≈1x
D2‑cAMP溶液 40x 250μL 1x
cAMP‑抗体溶液 40x 250μL 1x

[0786] 2)实验方法

[0787] a)制备化合物板：

[0788] 待测化合物做10个点4倍稀释，起始浓度为30μM，Bravo完成稀释

[0789] b)转移化合物：

[0790] 1)使用Echo转移100nL化合物至OptiPlate‑384plate。

[0791] 2)将OptiPlate‑384plate在1000rpm离心5秒。

[0792] c)细胞悬液的制备

[0793] 1)将一支GLP‑1R/GIPR细胞冻存管迅速置于37℃温水中解冻。

[0794] 2)将细胞悬液转移至Transfer15 mL离心管中，用10mL HBSS轻柔冲洗。

[0795] 3)将离心管在1000rpm室温离心1分钟。

[0796] 4)弃去上清。

[0797] 5)轻柔打散底部细胞并再用10mL HBSS轻柔冲洗，离心沉降细胞，最后用实验缓冲液重悬细胞。

[0798] 6)利用Vi‑cell测量细胞密度与活度。

[0799] 7)用实验缓冲液将GLP‑1R/GIPR细胞浓度稀释至2.0*105/mL。

[0800] 8)在OptiPlate‑384plate中转入100nL稀释好的细胞悬液。

[0801] 9)室温孵育30分钟。

[0802] d)加入检测试剂：

[0803] 1)在OptiPlate‑384plate空孔中加入10μL 800nM梯度稀释好的cAMP标准品。

[0804] 2)加入10μL cAMP检测试剂。

[0805] 3)用TopSeal‑A film覆盖OptiPlate‑384plate，室温孵育60分钟。

[0806] 揭去TopSeal‑A,在EnVision读数。

[0807] C实验结果

[0808] 实验结果如表6所示。

[0809] 表6体外GLP‑1R/GIPR激动活性测试结果

[0810]

[0811]

[0812] 结论：本发明化合物对GLP‑1R/GIPR具有很强的激动活性。

[0813] 测试例2：化合物大鼠药代动力学评价

[0814] A.实验目的

[0815] 测试化合物在SD大鼠体内药代动力学

[0816] B.实验操作

[0817] 以标准方案测试化合物皮下注射后的啮齿类动物药代特征，实验中候选化合物配成澄清溶液，给予大鼠单次皮下注射(SC,0.048mpk)。注射溶媒为柠檬酸盐缓冲液(20mM,pH＝7)。收集全血，制备得到血浆，以LC‑MS/MS方法分析药物浓度，并用Phoenix WinNonlin软件计算药代参数。

[0818] C.实验结果

[0819] 实验结果如表7所示。

[0820] 表7大鼠药代动力学测试结果

[0821]

[0822] 结论：本发明化合物具有优异的大鼠药代动力学性质。

[0823] 测试例3：化合物小鼠药代动力学评价

[0824] A.实验目的

[0825] 测试化合物在C57BL/6小鼠体内药代动力学

[0826] B.实验操作

[0827] 以标准方案测试化合物皮下注射给药后的啮齿类动物药代特征，实验中候选化合物配成澄清溶液，皮下注射给药(SC,0.048mpk)。皮下注射溶媒为柠檬酸盐缓冲液(20mM,pH＝7)。收集全血，制备得到血浆，以LC‑MS/MS方法分析药物浓度，并用Phoenix WinNonlin软件计算药代参数。

[0828] C.实验结果

[0829] 实验结果如表8所示。

[0830] 表8小鼠药代动力学测试结果

[0831]

[0832] 结论：本发明化合物具有优异的小鼠药代动力学性质。

[0833] 测试例4：化合物食蟹猴药代动力学评价

[0834] A.实验目的

[0835] 测试化合物在食蟹猴体内药代动力学

[0836] B.实验操作

[0837] 以标准方案测试化合物静脉注射及皮下注射给药后的哺乳类动物药代特征，实验中候选化合物配成澄清溶液，给予食蟹猴单次皮下注射给药(SC,0.02mpk)。皮下注射溶媒为柠檬酸盐缓冲液(20mM,pH＝7)。收集全血，制备得到血浆，以LC‑MS/MS方法分析药物浓度，并用Phoenix WinNonlin软件计算药代参数。

[0838] C.实验结果

[0839] 实验结果如表9所示。

[0840] 表9食蟹猴药代动力学测试结果

[0841]

[0842] 结论：本发明化合物具有优异的猴药代动力学性质。

[0843] 测试例5：血浆稳定性测试(PLS)

[0844] A.实验目的

[0845] 研究受试化合物在正常小鼠血浆中的稳定性。

[0846] B.实验操作

[0847] 1.实验前，将凝结的冷冻血浆置于37℃的水浴锅中解冻。血浆4000rpm离心5min，如有血块，清除血块，将pH值调到7.4±0.1。

[0848] 2.测试化合物溶液的制备：用DMSO稀释制得100μM的溶液。

[0849] 3.98μL的空白对照血浆加入2μL的测试化合物溶液(100μM)，使得两者混合溶液的最终浓度达到2μM,将其置于37℃水浴条件下培养。

[0850] 4.在每个时间点(0、10、30、60和120min)分别加入100μL H3PO4溶液和800μL终止溶液(200ng/mL甲糖宁和200ng/mL拉贝洛尔100％的甲醇溶液)来沉淀蛋白并充分混合。

[0851] 5.样品在转速4000rpm下离心20min，从每孔取100μL上清液进行LC‑MS/MS分析。

[0852] C.实验结果

[0853] 实验结果如表10所示。

[0854] 表10PLS测试结果

[0855] 化合物编号 WX005 WX009PLS(H/M)T1/2(min) >289.1/>289.1 >289.1/>238.9

[0856] 结论：本发明化合物具有优异的血浆稳定性。

[0857] 测试例6：血浆蛋白结合度测试(PPB)

[0858] A.实验目的

[0859] 研究受试化合物与人/小鼠血浆白蛋白的结合度。

[0860] B.实验操作

[0861] 1.基质准备：实验当天，将血浆在冷水中解冻，并以3220rpm的速度离心5min，以去除所有血块。测量得到的血浆的pH值，并根据需要使用1％的磷酸或1N的氢氧化钠将其pH调整到7.4±0.1。

[0862] 2.测试化合物的稀释步骤：测试化合物溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，以制备浓度分别为10mM和2mM的原液。用98μL DMSO稀释2μL原液(2mM)，制得40μM的工作溶液。用240μL DMSO稀释10μL原液，制得400μM对照化合物的工作溶液。将化合物的工作溶液(5μL)与空白基质(995μL)按1:200的比例混合均匀以制备负载基质。

[0863] 3.分析步骤

[0864] 3.1将等量的30μL负载基质(n＝2)转移至样品采集板，制备待测时间0(T0)样品用于残留测定。样品立即与相应的空白缓冲液进行匹配，最终体积为60μL，每孔中血浆与缓冲液的体积比为1:1。然后，测试化合物的T0样品分别加入60μL的4％H3PO4的H2O和480μL含有内标物的终止液。然后将它们与其他样品一起储存在2‑8℃下等待进一步处理。

[0865] 3.2将剩余的血浆样品放在37±1℃的二氧化碳培养箱预培养30min。准备无蛋白样品(F样品)，负载基质的样品(230μL)都被转移到聚碳酸酯管(n＝2)中，并在37℃和155000×g(35000rpm)条件下超速离心4h。

[0866] 3.3为了制备T样品(测试样品)，额外一份含基质样品转移到单独的96孔板(样品培育板)上，并在37℃下培育4h。

[0867] 3.4离心结束后，从上清液第二层(上层以下)取30μL的无蛋白样品和30μL的T样品转移到新的样品收集板中。每个样品与相应的空白缓冲液或基质混合，最终体积为60μL，基质:缓冲液体积比1:1。在所有样品加入60μL 4％的H3PO4水溶液和480μL的终止溶液(含内标)。混合物在转速4000rpm下离心20min，取各样品上清液100μL进行LC‑MS/MS分析。

[0868] C.实验结果

[0869] 实验结果如表11所示。

[0870] 表11 PPB测试结果

[0871]化合物编号 WX005 WX009
PPB％unbound(H/M) NA/NA NA/NA

[0872] 注：NA表示血浆蛋白结合度过高，在正常血浆蛋白浓度下未检出游离药物。

[0873] 结论：本发明化合物具有极高的血浆蛋白结合度。

[0874] 测试例7：STZ‑NASH小鼠模型体内药效验证

[0875] A.实验目的

[0876] 验证受试物在C57BL/6小鼠经STZ‑HFD饲料诱导的NASH模型中的药效。

[0877] B.实验操作

[0878] 建模方法：新生鼠在出生48小时内皮下注射STZ(200ug/只)，母乳喂养4周后挑选空腹血糖值>12mmol/L的动物连续6周HFD喂养，最终建立NASH模型。另挑选8只动物不进行STZ注射和HFD喂养(正常对照组)。

[0879] 给药方案：HFD喂养一周后开始给药，设定首次给药当天为Day1，之后每隔两天进行皮下注射，连续给药5周。

[0880] 实验终点检测：病理HE和SR染色。

[0881] C.实验结果

[0882] 实验结果如表12所示。

[0883] 表12 STZ‑NASH模型终点动物病理指标

[0884]  模型溶媒对照组 WX005 WX009
脂肪变性评分 2 1.5 1.0
炎症评分 1.2 1.0 1.4
气球样变评分 0.7 0.1 0
NAS评分 3.9 2.6 2.4
纤维化(％) 1.0 0.8 1.1

[0885] 结论：本发明化合物在STZ‑NASH小鼠模型中可显著改善NAS评分。