[0001] 本发明涉及化学生物传感以及生物检测领域，具体涉及一种光调控多重模拟酶双金属碳基杂化物的制备方法和应用。

[0002] 过氧化物酶，作为最有效的生物催化剂之一，具有高催化活性和底物特异性，在医学、工业、农业和生物领域发挥着至关重要的作用。然而，天然酶固有的缺陷，比如制备和提纯成本高、操作稳定性低、对环境的高敏感性以及回收和再利用的困难等，限制其进一步的应用。基于此现状，各种人工模拟酶得以快速探索和发展，过氧化物模拟酶，通常是具有类似于过氧化物酶活性的有机或无机分子，具有类似过氧化物酶的底物选择性和高催化活性。过氧化物模拟酶被广泛应用于生物医学、环境监测和食品安全等领域。与天然过氧化物酶相比，过氧化物模拟酶具有许多优点，例如热稳定性更好、底物适应性更广泛和更容易合成调控等。过氧化物模拟酶包括纳米材料、金属氧化物、贵金属和金属有机框架、卟啉、生物分子、金属配合物和聚合物等，也有许多小分子、离子被发现具有过氧化物模拟酶活性，这为过氧化物模拟酶的相关研究提供了新的、有前途的材料。

[0003] 氧化物模拟酶是一种类似于自然酶的催化剂，具有类似的催化作用。这些模拟酶可以通过合成有机或无机化合物来模拟自然酶的催化活性，从而在各种化学反应中起到催化作用。氧化物模拟酶通常具有较高的催化效率和特异性，可用于在生物医学、环境保护、工业生产等领域进行催化反应。这些模拟酶可以设计成特定的结构，以适应不同的反应条件和底物类型。近年来，氧化物模拟酶在催化领域中受到越来越多的关注，并被广泛应用于各种领域的催化反应中。

[0004] 脯氨酸（Pro）作为一种重要的氨基酸，在生物体内具有广泛的生理功能。它参与了多种生物过程，包括蛋白质合成、细胞增殖和分化、信号传导等。此外，脯氨酸还被广泛用于药物研发中，如作为抗肿瘤药物的靶点，或者作为抗菌、抗氧化剂等。无论是在微生物合成、生物转化、抗逆应答机制，还是在药物设计和环境科学等领域，脯氨酸都发挥着重要的作用。同时，脯氨酸的化学性质也引起了科研人员的广泛关注，如其构象分析、电子性质以及与其它分子的相互作用等。因此，开发一种简单、快捷、可靠的D‑脯氨酸检测方法是具有重要意义。

[0005] 丙氨酸是一种非常重要的氨基酸，属于非必需氨基酸之一。在生物体内，D‑丙氨酸的含量相对较少，而L‑丙氨酸则是生物体内较常见的形式，主要参与蛋白质合成等生物化学过程。D‑丙氨酸在科研领域有着广泛的研究应用，在药物合成和生物医学研究中有着重要的应用，可以用于合成特定类别的生物活性分子，如抗生素、抗病毒药物等。D‑丙氨酸作为一种神经递质，在神经系统的功能调控中扮演着重要角色。D‑丙氨酸在蛋白质合成和代谢中具有重要作用，特别是在蛋白质营养和健康饮食方面具有潜在的应用。D‑丙氨酸的检测在医学诊断、食品安全和生物化学研究等领域具有重要意义。生物传感技术在D‑丙氨酸检测中的应用也逐渐增多，通过构建特异性的生物传感器，可以实现对D‑丙氨酸的实时监测和快速检测。总的来说，D‑丙氨酸在各个领域的研究都在不断深入，为我们更好理解其生物学功能和应用价值提供了重要基础。

[0006] 抗氧化性小分子是指具有抗氧化作用的小分子化合物，能够帮助减少或阻止氧化应激及氧化损伤，从而保护生物体内的细胞和组织。抗氧化性小分子通过捕捉自由基、中和氧化剂或增强自身的抗氧化系统等方式来发挥其抗氧化作用。常见的抗氧化性小分子包括抗氧化剂（抗坏血酸、酒石酸和单宁酸）、生物硫醇（GSH、Cys 和 Hcy）和多巴胺等。这些小分子在保护细胞免受氧化损伤方面起着重要作用，有助于维持身体的健康状态。抗氧化性小分子在食品、药品和化妆品等领域都有广泛的应用。

[0007] 总抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，TAC）是一种用来评估生物体内或生物样本中抗氧化能力的指标。TAC测试可以测量一个样本在抗氧化物质的存在下对氧化剂的整体反应能力，从而反映出样本的抗氧化能力大小。通过评定样本对特定氧化剂的还原能力或对自由基的清除能力来间接评价样本的抗氧化能力。TAC的检测在科学研究和临床实践中具有很大的意义，可以帮助评估机体抗氧化能力，指导膳食调理、药物治疗等。

[0008] 通过我们的实验证明双金属碳基杂化物Yb‑Gd‑CDs、La‑Yb‑CDs和La‑Gd‑CDs均具有过氧化物模拟酶和氧化物模拟酶双重模拟酶的催化能力，在上述双金属碳基杂化物存在下，H2O2被催化分解产生羟基自由基，羟基自由基氧化TMB（3,3',5,5'‑四甲基联苯胺）生成氧化态TMB（Ox‑TMB），不同浓度的氧化态TMB呈现不同的颜色，由此表现其过氧化物模拟酶的性质。同时，在没有H2O2时，上述双金属碳基杂化物均可以与TMB作用可以直接将其氧化为Ox‑TMB而显色，表现其氧化物模拟酶的性质，并且上述双金属碳基杂化物的双重模拟酶均具有光敏性，其过氧化物模拟酶性质在光照及暗处均能较好地氧化TMB显色，且光照下显色稍强于暗处，其氧化物模拟酶在光照下氧化TMB显色明显强于暗处，暗处的TMB氧化显色较微弱。基于此，我们建立了一种光调控的双重模拟酶检测方法，既可利用暗处的过氧化物模拟酶性质对待测物进行定量检测，又可以利用光照下的氧化物模拟酶对待测物的含量进行定量检测，从而通过光调控减少两种模拟酶在检测待测样品时的相互干扰，实现对不同待测物的准确检测。

[0046] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明并不限于此。实施例1

[0047] 双金属碳基杂化物YbGd‑CDs的制备：称取40mg聚乙烯吡咯烷酮（PVP）至100mL平底烧瓶中，加入4.0mL乙二醇，在磁力搅拌器上以转速800rpm充分分散溶解10min，将1.0mL20mmol/LYbCl3水溶液滴加到上述浓度为10mg/mL的PVP乙二醇溶液中，磁力搅拌10min，再将1.0mL20mmol/LGdCl3水溶液滴加至上述溶液中磁力搅拌10min，滴加1.5µLHNO3和7.5µL乙酸微调溶液酸碱度，磁力搅拌10min，滴加200µL100mmol/L谷胱甘肽作为还原剂，将反应溶液体系在室温搅拌分散均匀后，置于油浴锅中120℃恒温搅拌反应9h，冷却后即得到光调控的多重模拟酶双金属碳基杂化物YbGd‑CDs。

[0048] 双金属碳基杂化物LaYb‑CDs的制备：称取40mg聚乙烯吡咯烷酮（PVP）至100mL平底烧瓶中，加入4.0mL乙二醇，在磁力搅拌器上以转速800rpm充分分散溶解10min，滴加1.0mL20mmol/LLaCl3水溶液到上述浓度为
10mg/mL的PVP乙二醇溶液中，磁力搅拌10min，滴加1.0mL20mmol/LYbCl3水溶液至上述溶液中，磁力搅拌10min，依次滴加1.5µLHNO3和7.5µL乙酸微调溶液酸碱度，磁力搅拌10min，滴加400µL100mmol/L谷胱甘肽作为还原剂，将反应溶液体系在室温搅拌分散均匀后，置于油浴锅中120℃恒温搅拌反应6h，冷却后即得到光调控的多重模拟酶双金属碳基杂化物LaYb‑CDs。

[0049] 双金属碳基杂化物LaGd‑CDs的制备：称取40mg聚乙烯吡咯烷酮（PVP）至100 mL平底烧瓶中，加入4.0 mL乙二醇，在磁力搅拌器上以转速800 rpm分散溶解10 min，滴加1.0 mL20 mmol/L的LaCl3水溶液到上述浓度为10mg/mL的PVP乙二醇溶液中，磁力搅拌10min，滴加1.0 mL20 mmol/L的GdCl3水溶液至上述溶液中，磁力搅拌10min，依次滴加1.5 µL HNO3和7.5 µL乙酸微调溶液酸碱度，磁力搅拌10min，滴加400 µL100 mmol/L的谷胱甘肽作为还原剂，将反应溶液体系在室温搅拌分散均匀后，置于油浴锅中120 ℃恒温搅拌反应9 h，冷却后即得到光调控的多重模拟酶双金属碳基杂化物LaGd‑CDs。

[0050] 采用多种表征方式对双金属碳基杂化物YbGd‑CDs、LaYb‑CDs和LaGd‑CDs进行了表征，参见图1，由YbGd‑CDs的透射电子显微镜（TEM）图可知，材料中颗粒分散比较均匀，平均粒径为3nm。参见图2可知，双金属碳基杂化物YbGd‑CDs在紫外灯下具有明显的蓝绿色荧光，最佳激发波长为380nm，对应的最佳发射波长为455nm。参见图3，由LaYb‑CDs的透射电子显微镜（TEM）图可知，材料中颗粒分散比较均匀，平均粒径为11nm。参见图4可知，双金属碳基杂化物LaYb‑CDs在紫外灯下具有明显的蓝绿色荧光，最佳激发波长为380nm，对应的最佳发射波长为453nm。参见图5a和b可知，H2O2单独与TMB作用不能使其氧化显色，当加入YbGd‑CDs后可催化H2O2产生羟基自由基，将TMB氧化为蓝色的Ox‑TMB，从而表现其过氧化物模拟酶性质。由图5c可知，在pH=4.0时YbGd‑CDs的过氧化物模拟酶催化活性最强。参见图6 a和b可知，YbGd‑CDs可以单独氧化TMB显色而表现氧化物模拟酶性质，图6c可知，在pH=4.0时双金属碳基杂化物Yb‑Gd‑CDs的氧化物模拟酶催化活性最强。由图7a和b可知，当加入LaYb‑CDs后可催化H2O2产生羟基自由基，将TMB氧化为蓝色的Ox‑TMB，从而表现其过氧化物模拟酶性质。由图7c可知，在pH=4.0时LaYb‑CDs的过氧化物模拟酶催化活性最强。由图8 a和b可知，LaYb‑CDs可以单独氧化TMB显色而表现氧化物模拟酶性质，图8c可知，在pH=4.0时双金属碳基杂化物LaYb‑CDs的氧化物模拟酶催化活性最强。参见图14可知，双金属碳基杂化物LaGd‑CDs在紫外灯下具有明显的蓝绿色荧光，最佳激发波长为380nm，对应的最佳发射波长为449nm。
实施例2

[0051] 双金属碳基杂化物YbGd‑CDs作为过氧化物模拟酶用于检测D‑脯氨酸（D‑Pro）分别向不同编号棕色离心管中加入100µL0.05mg/mL的D‑氨基酸氧化酶（DAAO），再依次加入100µL 原始浓度分别为0µmol/L 、50µmol/L 、100µmol/L 、200µmol/L 、300µmol/L 、400µmol/L 、500µmol/L 、1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L和10mmol/L的D‑脯氨酸（D‑Pro），旋涡混匀后，置于37℃水浴上温浴2.5h后，再分别加入100µL2.44mg/mLYbGd‑CDs溶液、100µL5mmol/LTMB和600µL 0.2mol/L乙酸‑乙酸钠缓冲液（pH=4.0），旋涡混匀后，再次置于37℃水浴上温浴反应2.5h。反应结束后，观察溶液颜色变化，用96微孔板经酶标仪测定波长652nm处的吸光度值，扫描500nm至800nm波长范围内的紫外可见吸收光谱。检测结果如图9a所示，随着D‑脯氨酸浓度的增加，双金属碳基杂化物YbGd‑CDs催化H2O2生成的羟基自由基氧化TMB的显色程度和紫外可见吸收强度均逐渐增加。如图9b，通过绘制生成的Ox‑TMB吸光度值与D‑脯氨酸浓度的线性标准曲线，依据线性方程即可计算出未知样品中D‑脯氨酸的含量，线性标准曲线对D‑脯氨酸的最低检出限LOD=0.0125µmol/L 。

[0052] 血清样品中D‑脯氨酸检测：分别向不同编号棕色离心管中加入100µL0.05mg/mL的D‑氨基酸氧化酶（DAAO），再依次加入100µL稀释100倍样品编号为Serum‑1至Serum‑7的7个血清样品 ，旋涡混匀后，置于37℃水浴上温浴2.5h后，分别加入100µL 2.44mg/mLYbGd‑CDs溶液、100µL 20mmol/LTMB和600µL 0.2mol/L乙酸‑乙酸钠缓冲液（pH=4.0），旋涡混匀后，再次置于37℃水浴上温浴反应2.5h。反应结束后，观察溶液颜色变化，用96微孔板经酶标仪测定波长652nm处的吸光度值。如图9c所示，通过D‑Pro的标准曲线计算得到稀释100倍后的7个血清样品中D‑Pro的浓度，换算后得到原始血清中D‑Pro的浓度。
实施例3

[0053] 双金属碳基杂化物YbGd‑CDs作为过氧化物模拟酶用于检测D‑丙氨酸（D‑Ala）分别向不同编号棕色离心管中加入100µL0.05mg/mL的DAAO ，再依次加入100µL 原始浓度分别为0µmol/L 、100µmol/L 、200µmol/L 、300µmol/L 、500µmol/L 、1mmol/L、
2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、8mmol/L和10mmol/L的D‑丙氨酸（D‑Ala），旋涡混匀后，置于37℃水浴上温浴3h后，分别加入60µL2.44mg/mLYb‑Gd‑CDs溶液、100µL5mmol/LTMB和640µL 0.2mol/L乙酸‑乙酸钠缓冲液（pH=4.0），旋涡混匀后，再次置于37℃水浴上温浴反应3h。反应结束后，观察溶液颜色变化，用96微孔板经酶标仪测定波长652nm处的吸光度值，扫描500nm至800nm波长范围内的紫外可见吸收光谱。

[0054] 检测结果如图10a所示，随着D丙氨酸浓度的增加，双金属碳基杂化物YbGd‑CDs催化H2O2生成羟基自由基氧化TMB的显色程度和紫外可见吸收强度均逐渐增加。如图10b，通过绘制生成的Ox‑TMB吸光度值与D‑丙氨酸浓度的线性标准曲线，依据线性方程即可计算出未知样品中D丙氨酸的含量，线性标准曲线对D‑脯氨酸的最低检出限LOD=0.0734µmol/L 。实施例4

[0055] 双金属碳基杂化物YbGd‑CDs作为氧化物模拟酶用于检测抗氧化性小分子分别往不同编号的离心管中均加入50 µL2.44mg/mLYb‑Gd‑CDs溶液、770µLNaOAc 缓冲液（0.2mol/L，pH=4.0）、80µL 5mmol/L TMB，在紫外灯照射下反应40min，依次向离心管中加入100 µL不同浓度的抗氧化性小分子（谷胱甘肽、半胱氨酸和抗坏血酸），漩涡混匀后，反应20min，观察溶液颜色变化，用96微孔板经酶标仪测定反应溶液在波长652nm处的吸光度值，扫描500nm至800nm波长范围内的紫外可见吸收光谱。绘制反应体系中存在和不存在抗氧化性小分子的情况下Ox‑TMB吸光度的的相对变化∆A与分析物浓度的线性标准曲线，依据线性方程即可计算出抗氧化性小分子的含量。检测结果如图11a‑c所示，随着谷胱甘肽、半胱氨酸和抗坏血酸三种抗氧化性小分子浓度的增加，氧化态TMB（Ox‑TMB）逐渐被还原而褪色，表现为紫外可见吸收强度逐渐减小的趋势。由图11d‑f可知，检测谷胱甘肽（GSH）的标准曲线最低检出限LOD=3.208µmol/L，半胱氨酸（Cys）的标准曲线最低检出限LOD=3.531µmol/L，抗坏血酸（AA）的标准曲线最低检出限LOD=2.976µmol/L。
实施例5

[0056] 双金属碳基杂化物YbGd‑CDs作为氧化物模拟酶用于检测细胞裂解液总抗氧化能力（TAC）依次往离心管中加入40µL2.44mg/mLYb‑Gd‑CDs溶液、780µL0.2mol/LHAc‑NaOAc 缓冲液（pH=4.0）、80µL 5mmol/L TMB，漩涡混匀，紫外灯照射反应40min后，标准曲线组中依次加入100µL 不同浓度的谷胱甘肽溶液（原始浓度分别为20µmol/L 、40µmol/L、60µmol/L、
80µmol/L、100µmol/L、120µmol/L、140µmol/L、160µmol/L），细胞裂解液样品组中分别加入
100µL HeLa、 HCT116、L929和LA549等4种细胞裂解液，漩涡混匀，室温反应60min后，用96孔微孔板经酶标仪测定波长652nm处的吸光度值。如图12a所示，通过绘制Ox‑TMB的吸光度变化值与谷胱甘肽浓度的线性标准曲线，依据线性方程即可计算出未知样品中谷胱甘肽的含量，线性标准曲线对谷胱甘肽的最低检出限LOD=1.587µmol/L 。

[0057] 将反应体系中存在和不存在细胞裂解液时Ox‑TMB吸光度的变化值∆A代入检测抗氧化模型分子谷胱甘肽的标准曲线12a中求得相同细胞浓度下4种细胞裂解液的谷胱甘肽当量浓度，用对应的谷胱甘肽当量浓度来评价4种细胞裂解液的总抗氧化能力（结果如图12b）。
实施例6

[0058] 双金属碳基杂化物LaYb‑CDs作为氧化物模拟酶用于检测水果和果汁总抗氧化能力（TAC）分别在离心管中均加入50 µL 2.37mg/mLLa‑Yb‑CDs溶液、770µL0.2mol/LHAc‑
NaOAc 缓冲液（pH=4.0）、80µL 5mmol/L TMB，漩涡混匀，紫外灯照射反应50min后，标准曲线组分别加入100µL不同浓度的抗坏血酸（AA）溶液（原始浓度分别为20µmol/L 、40µmol/L、60µmol/L、80µmol/L、100µmol/L、120µmol/L、140µmol/L、160µmol/L、200µmol/L），样品组分别加入处理好的100µL和稀释30倍的沃柑、猕猴桃、柚子和橙汁溶液，室温反应60min后，用96孔微孔板经酶标仪测定波长652nm处的吸光度值。

[0059] 如图13a所示，通过绘制Ox‑TMB的吸光度变化值与抗坏血酸浓度的线性标准曲线，依据线性方程即可计算出未知样品中抗坏血酸含量，线性标准曲线对抗坏血酸的最低检出限LOD=1.162µmol/L 。

[0060] 将反应体系中存在和不存在水果和果汁溶液时Ox‑TMB吸光度的变化值代入吸光度变化值与抗坏血酸浓度的标准曲线（图13a）中求得相同稀释倍数下4种水果果汁溶液的抗坏血酸当量浓度，用对应的抗坏血酸当量浓度来评价4种水果果汁的总抗氧化能力（结果如图13b）。实施例7

[0061] 双金属碳基杂化物LaGd‑CDs作为过氧化物模拟酶用于血清葡萄糖检测分别在棕色离心管里加入加入100 µL 1 mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液，标准曲线组
中依次加入100 µL不同浓度的葡萄糖溶液（浓度为0 µmol/L至1 mmol/L），样品组分别加入
100 µL稀释8倍的4个血清样品溶液，混匀后，37 ℃水浴温育60 min后，再分别加入50 µL 
6.24 mmol/L LaGd‑CDs溶液、50 µL10 mmol/LTMB溶液、700 µLNaOAc 缓冲液(0.2 mol/L，pH=4.0)，混匀后，再次置于37 ℃水浴温育60 min。用96孔微孔板经酶标仪测定波长652nm处的吸光度值。

[0062] 如图15a所示，通过绘制Ox‑TMB的吸光度变化值与葡萄糖浓度的线性标准曲线，依据线性方程即可计算出未知样品中葡萄糖含量，线性标准曲线对葡萄糖的最低检出限LOD=9.424 µmol/L 。

[0063] 将血清样品的Ox‑TMB吸光度值代入上诉检测葡萄糖的标准曲线(图15a)中求得稀释后的血清样品中葡萄糖的浓度，乘以对应的稀释倍数即可得到原始血清样品中葡萄糖的含量（结果如图15b）。