技术领域
[0001] 本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及心磷脂的新应用。
相关背景技术
[0002] 2型糖尿病是重大的健康危机之一，胰岛素抵抗是2型糖尿病发生发展的重要环节，胰岛素抵抗的患者如果不加以干预极易转变为2型糖尿病。因此，寻找到合适的策略来改善胰岛素抵抗从而抑制其向2型糖尿病转化具有重要意义。
[0003] 心磷脂（Cardiolipin，CL）是一种存在于细菌、酵母、植物和动物中的四酰基二磷脂酰甘油，是线粒体内膜的特征性脂质。在哺乳动物中，心磷脂是由心磷脂合酶（CRLS1）在线粒体内膜的基质侧通过磷脂酰甘油磷酸（PGP）和胞苷二磷酸二酯甘油（CDP‑DAG）合成。心磷脂的存在不仅使线粒体内膜保持良好的流动性，保证氧化呼吸的正常进行，还参与了多种线粒体代谢过程的调节，比如线粒体自噬、细胞凋亡、氧化应激等。机体内各个组织器官均可进行心磷脂的合成与代谢，但是在线粒体较为丰富的器官（肝脏、心脏、肌肉等）代谢较为活跃，同时也具有重要的生物学功能。
[0004] 目前，尚未见心磷脂能够改善胰岛素抵抗的报道。
具体实施方式
[0020] 为进一步阐述本申请为达成预定发明目的所采取的技术手段及结果，以下以较佳实施例，对依据本申请申请的具体实施方式、技术方案及特征，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
[0021] 实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
[0022] 以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
[0023] 本申请实施例中涉及的主要材料、仪器及试剂如下：心磷脂为来自于牛心脏的提取物，购自sigma公司（货号：C0563）；
二甲双胍购自北京索莱宝科技有限公司（货号：D9351）；
高脂饲料（货号：D12492，60%卡路里来自脂肪）购自美国Research diet公司；
胰岛素注射液购自江苏万邦生化医药集团有限责任公司；
葡萄糖检测试剂盒（货号：A154‑1‑1）均购自南京建成生物工程研究所；
胰岛素ELISA试剂盒、小鼠总甘油三脂Elisa试剂盒、小鼠总胆固醇Elisa试剂盒、小鼠谷丙转氨酶Elisa试剂盒、小鼠谷草转氨酶Elisa试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司；
1.5 mL离心管（美国Axygen公司）；
血糖仪（上海罗氏诊断产品有限公司）；
多应用旋涡混合器（Vortex Genie 2，美国Scientific Industries公司）；
冷冻高速离心机（德国Sigma公司）；
生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；
多功能酶标仪（美国BioTek公司）；
Q‑PCR仪（鲲鹏基因科技有限责任公司）；
玻片扫描仪（徕卡公司）；
心磷脂溶液的配制：称取心磷脂100 mg，加入20 mL乙醇，溶解为5 mg/mL的心磷脂储备液，分装保存于‑20℃冰箱，即用即取。灌胃前，将心磷脂储备液用无菌水稀释为0.5 mg/mL的心磷脂灌胃溶液，即用即配；
二甲双胍溶液的配制：称取盐酸二甲双胍80.0 mg，先使用少量超纯水溶解，然后加入超纯水至4 mL刻度线，配制成浓度为20.0 mg/mL的溶液，后加入10%的乙醇，现配现用；
对照组溶液配制：10%乙醇的超纯水溶液。
实施例1
[0024] 本实施例用于说明心磷脂能够降低高脂饮食诱导的体重增加：6周龄雄性C57BL/6J小鼠（实验动物许可证号：SCXK（京）2019‑0009），购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养条件：无特定病原体Specific Pathogen Free（SPF）级洁净度，室温（20°C‑22°C），湿度60 ± 5%，12小时明暗交替，自由饮食饮水。本实验中所有动物方案均经北京迈德康纳动物伦理委员会批准，并在实验动物保护协会规定的指导下进行动物实验操作。
[0025] 小鼠以基础饲料适应性喂养7天后称重，采用随机分组设计，按体重（克，g）将小鼠分为高脂饮食组（High‑fat Diet, HFD组）、高脂饮食+心磷脂组（High‑fat diet + CL, HFD+CL组）和高脂饮食+二甲双胍组（High‑fat diet + Met, HFD+Met.组），每组10只小鼠。三组小鼠均以高脂饲料喂养，共6周，喂养期间，HFD组每日灌胃10%的乙醇‑无菌水溶液，HFD+CL组按照5 mg/kg的剂量每日灌胃心磷脂溶液，HFD+Met.组按照200 mg/kg的剂量每日灌胃二甲双胍溶液。期间每周监测并记录各组小鼠体重。
[0026] 各组小鼠体重的记录结果如图1所示，由图1可以看出，HFD+CL组和HFD+Met.组小鼠的体重明显低于HFD组，表明心磷脂处理后能够显著延缓HFD诱导的体重增加，与二甲双胍具有相似的效果。实施例2
[0027] 本实施例用于说明心磷脂能够改善HFD诱导的糖耐量异常与胰岛素敏感性降低：各组小鼠按照实施例1的方法干预6周后，进行口服葡萄糖耐量试验（Oral Glucose Tolerance Test，OGTT），以考察心磷脂对HFD干预后小鼠的糖耐量的影响。给药后第6周，各组小鼠禁食不禁水12小时，称重、尾部滴血测量空腹血糖值（葡萄糖负荷之前），然后按照2.0 g/kg的剂量灌胃给予20%的葡萄糖溶液，于30、60、90和120 min（葡萄糖负荷之后）的时候，用血糖试纸和血糖仪检测实验小鼠尾尖血、检测血糖。
[0028] 各组小鼠灌胃葡萄糖之后的血糖监测结果如图2‑图4所示，其中，图2为各组小鼠血糖监测结果的OGTT曲线，图3为各组小鼠对应的OGTT曲线的曲线下面积统计结果，图4为各组小鼠餐后2小时的血糖值监测结果。OGTT的曲线显示，在90 min时HFD+CL组和HFD+Met.组小鼠的血糖值就与HFD组有明显差异（图2），曲线下面积统计也有显著差异（图3），同时，HFD+CL组和HFD+Met.组小鼠餐后2小时的血糖值显著低于HFD组（图4），这些结果表明心磷脂和阳性药二甲双胍均能够改善HFD诱导的糖耐量异常。
[0029] 此外，对各组小鼠进行胰岛素耐量试验（Insulin Tolerance Test，ITT），以考察心磷脂对HFD干预后小鼠的胰岛素敏感性的影响。灌胃后第6周，各组小鼠禁食不禁水6小时，称重、尾部滴血测量空腹血糖值（胰岛素注射前），然后腹腔注射胰岛素（0.5 U/kg），并于30、60、90和120 min（胰岛素注射后），用血糖试纸和血糖仪检测小鼠尾尖血、检测血糖值。
[0030] 各组小鼠注射胰岛素后的血糖监测结果如图5‑图6所示，其中，图5为各组小鼠血糖监测结果的ITT曲线，图6为各组小鼠对应的ITT曲线的曲线下面积统计结果。由图5‑6可以看出，HFD+CL组和HFD+Met.组小鼠ITT的曲线下面积明显低于HFD组，表明心磷脂和二甲双胍均能够改善HFD诱导的小鼠胰岛素抵抗。实施例3
[0031] 本实施例用于说明心磷脂能够改善胰岛素抵抗：各组小鼠按照实施例1的方法干预6周后，取HFD组小鼠和HFD+CL组小鼠，禁食不禁水12小时，然后眼眶静脉丛取血，收集的血液在室温下静置30‑60 min，再于4ºC、15000 g的条件下离心10 min，收集上清并分装至聚丙烯EP管中，于−80ºC保存，用于后续观察指标的检测。
[0032] 采用胰岛素试剂盒和葡萄糖试剂盒检测各组小鼠的血清胰岛素、葡萄糖浓度，根据稳态模型计算胰岛素抵抗指数（HOMA‑IR）：HOMA‑IR =血糖浓度（mmol/L）×胰岛素浓度（mIU/L）/22.5。
[0033] HOMA‑IR常被用来评估个体的胰岛素抵抗程度。两组小鼠的HOMA‑IR计算结果如图7所示，可以看出HFD组小鼠的HOMA‑IR值明显高于HFD+CL组小鼠，表明心磷脂能够有效改善HFD诱导的胰岛素抵抗。
实施例4
[0034] 本实施例用于说明心磷脂能够增加胰岛素敏感相关基因的表达：各组小鼠按照实施例1的方法干预6周后，取HFD组小鼠和HFD+CL组小鼠，禁食不禁水12小时，引颈处死后用镊子和剪刀剖开腹腔，小心取出肝脏，加入Trizol，放入组织震荡裂解仪中，用Trizol法提取RNA，后用Q‑PCR仪进行定量分析。
[0035] 两组小鼠的Q‑PCR定量结果如图8所示，可以看出，相较于HFD组，HFD+CL组小鼠的胰岛素敏感性相关基因Irs1和Ass1的表达量明显上升，证明心磷脂的加入可以增加小鼠的胰岛素敏感性。实施例5
[0036] 本实施例用于说明心磷脂能够减少小鼠的肝脏细胞损伤和脂滴的形成：各组小鼠按照实施例1的方法干预6周后，取HFD组小鼠和HFD+CL组小鼠，禁食不禁水12小时，引颈处死后用镊子和剪刀剖开腹腔，小心取出肝脏，放入4%的多聚甲醛中固定24小时，后进行脱水，HE染色的组织用石蜡包埋切片，油红染色的组织用OCT包埋进行冰冻切片。切片准备好后分别进行HE染色和油红染色。
[0037] 两组小鼠的HE染色和油红染色结果如图9所示。由HE染色可知，相较于HFD组，HFD+CL组小鼠的完整肝细胞的比例明显上升，这提示心磷脂能够改善因高脂饮食引起的肝功能的损害。由油红染色可知，相较于HFD组，HFD+CL组小鼠的肝脏中脂滴含量明显下降，这提示心磷脂能够有效缓解小鼠肝脏的脂肪化。实施例6
[0038] 本实施例用于说明心磷脂能够降低高脂饮食引起的总胆固醇和总甘油三酯含量：各组小鼠按照实施例1的方法干预6周后，取HFD组小鼠和HFD+CL组小鼠，根据试剂盒步骤检测两组小鼠的血清总胆固醇与总甘油三酯的浓度，结果如图10‑图11所示。
[0039] 图10为两组小鼠血清总胆固醇含量检测结果，图11为两组小鼠血清总甘油三酯检测结果。由图10‑11可知，相较于HFD组，心磷脂能够降低HFD诱导后小鼠的血清总胆固醇含量和甘油三酯含量，这表明心磷脂能改善高脂饮食引起的脂代谢紊乱。
[0040] 以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式；但本申请的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，根据本申请的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本申请的保护范围内。
