[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种具有广谱免疫保护作用的维氏气单胞菌外膜孔蛋白及应用。

[0002] 淡水鱼细菌性败血症，是我国养鱼史上迄今危害淡水鱼的种类最多、流行地域最广、流行季节最长、造成损失较大的一种急性传染病，是农业农村部公布的二类动物疫病，其主要危害草鱼、鲢鳙、鲤鱼、鲫鱼、鳊鲂、鳜鱼、鲈鱼、罗非鱼、斑点叉尾鮰、鳖和蛙等淡水养殖动物，发病高峰期通常为每年的6～9月，常常出现急性暴发，死亡率高。病鱼大多有出血性败血症症状，如鳍条基部出血、肛门红肿、体表有出血点以及腹部肿胀，部分病鱼腹腔有血样腹水等。

[0003] 气单胞菌(Aeromonas spp.)是淡水鱼细菌性败血症的主要病原，是一类革兰氏阴性条件致病菌，广泛存在于淡水、海水、污水、饮用水等水生环境中，能够引发人类外伤感染及食物中毒。近年来有研究表明淡水鱼细菌性败血症的病原种类中维氏气单胞菌占比最高，其次为嗜水气单胞菌，并且混合感染普遍存在。目前，细菌性疾病主要使用抗生素进行控制，然而广泛使用抗生素不仅使部分细菌具有耐药性，同时也危及生态环境以及人类健康。使用疫苗预防细菌性疾病逐渐受到重视，但全菌体疫苗受血清型的限制，因此，广谱的保护性抗原是细菌病疫苗研发的一个关键方向。

[0004] 外膜蛋白(Outer membrane proteins，Omps)是革兰阴性菌外膜中的主要结构，镶嵌在外膜层中的多种蛋白质，是潜在的候选抗原。外膜蛋白在感染宿主、物质运输、维持外膜结构、有关物质合成以及抗药性等方面起着重要作用。研究表明，细菌的外膜蛋白具有良好的抗原性，可激发机体的体液免疫和细胞免疫。细菌外膜蛋白在不同血清型细菌间具有一定的免疫交叉保护性，是一种潜在的广谱免疫保护性抗原。

[0005] 中国专利申请文件CN104961811A提供了一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白ompA，其可作为对鱼具有保护作用的疫苗，比较研究了嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白pompA在不同FIA作用下对斑点叉尾鮰的免疫效果。中国专利申请文件CN 115715800 A公开了一种嗜水气单胞菌的亚单位纳米疫苗，包含OMP P5蛋白、免疫佐剂、阳离子脂质、表面活性剂和疏水稳定剂。上述构建的重组蛋白疫苗均针对单一病原—嗜水气单胞菌攻毒，对试验鱼具有免疫保护效果。

[0028] 为了便于理解本发明，下面将下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0029] 实施例1维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌的总外膜蛋白提取及抗原性分析[0030] 用Sarkosyl方法制备维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌菌株的总外膜蛋白Omps。将各菌株摇床培养过夜离心得菌体；重悬于20ml Tris‑HCL中并超声破碎；离心取上清液；再将上清液高速离心得沉淀；沉淀重悬于0.5％月桂酰肌氨酸钠(SLS)4℃下孵育过夜；离心30分钟除去SLS，将Omps重悬于1.5ml的ddH2O中，进行SDS‑PAGE和Western‑blot分析。Western‑blot时，用维氏气单胞菌AVCA07 Omps兔抗血清(1:500)作为第一抗体，HRP标记的羊抗兔IgG单抗(1:2000)用作第二抗体。

[0031] SDS‑PAGE结果如图1所示，结果显示，6株维氏气单胞菌和3株嗜水气单胞菌菌株的总外膜蛋白Omps具有多样性，分子量大小主要分布在20‑50kDa(图1A)。Western‑blot结果显示，维氏气单胞菌AVCA07总外膜蛋白Omps兔抗血清能够特异性识别本菌株及其他菌株外膜蛋白约37kDa的Omps(图1B)。可见，分子量约37kDa的Omps含有维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌的广谱性外膜蛋白抗原。

[0032] 实施例2液相色谱串联质谱(LC‑MS/MS)分析目标蛋白

[0033] 取维氏气单胞菌菌株AVCA07的Omps进行SDS‑PAGE，并用考马斯亮蓝R‑250染色。将考染胶上分子量约37kDa的含有广谱性抗原的单一蛋白条带切下，放入EP管中，进行蛋白酶解、肽段抽提与纯化后，由广州辉腾生物技术有限公司(Guangzhou  Fitgene Biotechnology CO.,LTD)用液相色谱串联质谱(LC‑MS/MS)(Thermo Scientific)分析检测。质谱分析结果在Uniprot蛋白质数据库进行比对，鉴定出一种蛋白为Porin OmpA，登录号为A0A433LSH8。其蛋白得分、蛋白质量、匹配上的二级谱图数、得分高于阈值的二级谱图数、匹配上的肽段数、得分高于阈值的肽段数、蛋白覆盖度、蛋白等电点和蛋白丰度指数如表1。

[0034] 表1 Porin OmpA蛋白分析结果

[0035]

[0036] 实施例3外膜蛋白porin ompA全基因克隆和序列分析

[0037] 参考外膜蛋白Porin OmpA(序列号A0A433LSH8)的基因序列，设计引物，上游引物/ /porin‑F(SEQ ID NO.3)：5‑ATCGGATCCATGAAAAAA TCATTGATTACCTTG‑3 (下划线处为BamHⅠ/ /
酶切位点),下游引物porin‑R(SEQ ID NO.4)：5‑CTTGTCGACTTACTCCTGTACCTCGC TGACAC‑3(下划线处为SalⅠ酶切位点)。以AVCA07 DNA作为模板扩增外膜蛋白porin全基因，PCR程序为：94℃，5min；94℃30s，57℃30s，72℃45s，30cycles；72℃，10min。PCR回收产物与pMD19T载体连接、转化DH5α。使用含有氨苄的LB平板进行筛选，挑取阳性克隆送广州艾基生物科技有限公司测序，并进行序列分析。

[0038] 维氏气单胞菌AVCA07的porin ompA全基因开放阅读框为1035bp，全基因序列为SEQ ID NO.1，如图2所示。其编码344aa，分子量大小为37kDa，等电点pI 5.09，前20aa为信号肽。氨基酸全序列为SEQ ID NO.2，如图3所示。

[0039] 实施例4重组外膜蛋白rPorin OmpA的制备及其反应原性

[0040] 将pMD19T‑porin与pET32a分别用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，酶切产物回收后使用T4 DNA连接酶，16℃过夜连接得到重组质粒pET32a‑porin。pET32a‑porin经双酶切得到约6000bp和1100bp的特异性条带，测序结果表明成功构建了携带porin的重组表达质粒，如图
4所示。取10μl连接产物转化DH5α，使用含有氨苄的LB培养基筛选阳性克隆。将重组表达载体pET32a‑porin电转化入大肠杆菌BL21(DE3)，重组的BL21按1:1000接种于含氨苄的LB培养基，37℃摇床培养。当菌种OD600值为0.6‑0.8时，加入1mM IPTG诱导表达6h。从诱导的重组BL21中得到的重组蛋白包涵体经过变性、复性和镍柱纯化，BCA法测定蛋白浓度后‑20℃保存备用。

[0041] 另将获得的细菌(未诱导的和诱导的重组BL21)和纯化的重组蛋白进行SDS‑PAGE凝胶电泳和Western‑blot分析，结果如图5所示。SDS‑PAGE电泳显示重组表达的融合蛋白分子量约55kDa(其中含pET32a自带的标签蛋白分子量约20kDa)(图5A)。Western‑blot中用维氏气单胞菌AVCA07总外膜蛋白Omps兔抗血清(1:500)作为第一抗体，HRP标记的羊抗兔IgG单抗(1:2000)作为第二抗体。Western‑blot结果表明，维氏气单胞菌AVCA07 Omps兔抗血清作为第一抗体，能够特异性识别分子量约55kDa的重组蛋白条带(图5B)。可见，重组外膜蛋白rPorin OmpA具有良好的反应原性。

[0042] 实施例5鱼体免疫及抗体效价测定

[0043] 将纯化的rPorin OmpA与ISA 763A等体积混合后乳化制成rPorin‑ISA 763A疫苗，其中rPorin的终浓度为0.2mg/mL。将PBS与ISA 763A等体积混合后乳化制成PBS‑ISA 763A作为佐剂。

[0044] 试验鱼为草鱼，每尾体重25～30g，体长13～15cm。rPorin‑ISA 763A组腹腔注射100尾试验鱼，每尾注射200μl。佐剂对照组和PBS对照组分别腹腔注射试验鱼100尾，每尾
200μl。免疫后7d、14d、21d、28d、42d和56d，分别从免疫组和对照组中随机选取5尾鱼采血，制备血清，用于测定IgM抗体效价。

[0045] 血清抗体效价测定采用间接ELISA方法，用2μg/mL的Porin包被ELISA板，待测血清先稀释100倍后再进行二倍比梯度稀释，第一抗体为鼠抗草鱼IgM单抗(1:1000)，第二抗体为HRP标记的羊抗鼠IgG单抗(1:5000)。按常规操作流程洗涤，加入显色液显色和终止液终止后，测定OD450nm和OD630nm值。同时设阴性血清对照和PBS对照。结果表明，rPorin‑ISA 763A可以刺激草鱼产生体液免疫应答。免疫组7d未检测到抗体效价，14d抗体效价达到1：400，21d上升为1：6400，28d为1：3200，56d的效价为1：1600(图6)。

[0046] 实施例6鱼体免疫保护效果试验

[0047] 免疫28d后，将免疫组和对照组分别随机分成2组，每组30尾。分别用维氏气单胞菌7
菌株AVCA07及嗜水气单胞菌菌株Hn099攻毒，每尾注射0.2ml(分别含活菌数约6.0×10CFU
7
和3.0×10 CFU)。各组在水温29±1℃的室内玻璃缸中饲养，观察7d，每天记录各组的死鱼数，并计算免疫组的相对保护率。结果表明，维氏气单胞菌菌株AVCA07攻毒，PBS对照组的死亡率分别为100.0％，PBS‑ISA763A佐剂对照组死亡率为80.0％，rPorin‑ISA763A免疫组的死亡率为20.0％，免疫组相对保护率为80.0％(图7，表2)。嗜水气单胞菌Hn099攻毒，PBS对照组的死亡率为90.0％，PBS‑ISA763A佐剂对照组死亡率为66.7％，rPorin‑ISA763A免疫组的死亡率为10.0％，免疫组相对保护率为88.9％(图8，表2)。可见，腹腔注射rPorin‑ISA763A免疫草鱼能有效抵抗维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌感染。

[0048] 表2不同菌株攻毒后免疫组的相对保护率

[0049]

[0050]

[0051] 综上，本发明通过SDS‑PAGE、免疫印迹、液相色谱串联质谱(LC‑MS/MS)分析和鱼体免疫试验，从维氏气单胞菌AVCA07总外膜蛋白Omps中筛选出一种具有广谱免疫保护作用的外膜孔蛋白Porin OmpA，评价了重组蛋白的抗原性及其对草鱼的免疫效果。结果表明，重组蛋白具有良好的抗原性，与油佐剂按适当比例乳化后，免疫草鱼等淡水鱼，能提高草鱼等淡水鱼抵抗维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌2种细菌的能力，具有广谱免疫保护作用。该外膜孔蛋白及其基因核苷酸序列可作为淡水鱼细菌性败血症基因工程亚单位疫苗和核酸疫苗进一步研究开发。

[0052] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0053] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。