[0001] 本披露涉及用于检测样品中至少一个靶核酸序列的方法，该方法包括将RNA聚合酶序列添加至靶核酸并检测由转录活性、例如由RNA聚合酶释放的质子。

[0002] 定量实时聚合酶链式反应(qPCR)已成为扩增少量DNA或RNA生物标志物的标准。qPCR和核酸检测的大多数实施方案需要荧光标记的序列特异性探针或嵌入染料。PCR产物的指数式产生引起伴随的荧光的指数式增加。在多重PCR环境中，通过包括多对引物和不同的荧光标记的序列特异性探针(其可同时(例如使用光学滤波器)或按顺序进行检测)，可以在qPCR反应中扩增同一样品内的多于一个靶生物标志物序列。然而，由于荧光染料之间不可避免的光谱重叠，以及水基溶液中可负担得起的染料的光谱段有限，高度多重化PCR方法的可能性受到阻碍。通常，在qPCR中，使用不同标记的探针进行多重靶向的能力限于在单个qPCR反应中分析五个靶序列。

[0003] 目前，生化分析领域正在努力实现微型化，便携式紧凑型系统的开发备受关注，这些系统通常使用微流体技术来集成先前需要整个实验室才能完成的操作。此类微流体装置通常旨在处理微量的液体和分析物，提高多重化能力并允许以极小的占地面积、快速的周转时间和低成本的方法实现生物分子技术的高通量。

[0004] 用基于场效应晶体管(FET)的无标记生物感测方法监测比如核酸杂交等生物事件已经引起了相当大的关注，这尤其是因为场效应晶体管具有微型化的潜力、易于集成到标准CMOS技术中并且所需的电子器件的成本低以及具有多重化能力。由于基于FET的方法依赖于电输出信号而不是光输出信号(电化学检测)，所以它们不受荧光团和庞大设备的选择所施加的限制的影响。

[0005] 离子敏场效应晶体管(ISFET)有时简称为pH传感器，测量溶液中的离子浓度。其作为扩增反应读数的适用性已得到广泛探索。

[0006] WO 2003/073088披露了基于互补金属氧化物半导体(CMOS)的扩增装置，其具有与反应化学集成的热驱动。ISFET用于监测焦磷酸水解反应中释放的质子，该焦磷酸水解反应与寡核苷酸链末端的单个核苷酸插入相关联。在此，在基于“边合成边测序”的DNA测序技术中使用pH敏感型ISFET来检测单个核苷酸插入。

[0007] WO 2008/107014也依赖于质子是PCR产物这一事实。因此，也可以通过使用pH敏感型ISFET来监测扩增进行时每个核苷酸插入释放的质子来实现qPCR。通过检测pH的变化来监测扩增。通过在小体积和低缓冲容量的情况下进行扩增以确保所释放的质子在克服样品的缓冲容量时导致pH的快速变化，实现检测中所需的灵敏度。提到了使用固定在ISFET上的DNA探针捕获靶DNA并将靶DNA与不想要的和干扰的产物分离。

[0008] 不费吹灰之力，按比例缩小ISFET设计以制造阵列已经导致更多的传感器封装在微型化芯片上。就核酸应用而言，已经描述了用于监测生物事件的大型FET阵列，特别是在核酸测序应用的背景下。

[0009] WO 2010/138182描述了涉及FET阵列的方法和设备，这些FET阵列包括用于监测比如核酸边合成边测序反应等化学和/或生物反应的大型FET阵列。其中提供的一些方法涉及改善来自核酸测序反应期间释放的氢离子的信号(以及信噪比)。

[0010] WO 2010/047804涉及包括大规模化学场效应晶体管阵列的设备和芯片，这些大规模化学场效应晶体管阵列包括能够从样品流体中截留化学或生物样品以供分析的样品截留区域的阵列。这些设备和芯片在大规模基于pH的DNA测序以及其他生物科学和生物医学应用中得到应用。

[0011] 除了在核酸测序方法中的应用之外，还在结合了环介导等温扩增(LAMP)和PCR的CMOS芯片平台的背景下描述了ISFET用于监测核酸扩增的实用性。

[0012] 因此，Toumazou等人(2013,Nat Methods[自然方法]10:641‑646)使用标准CMOS工艺流程来创建集成电路，该集成电路使用嵌入式加热器、10个温度传感器和40个ISFET传感器来扩增并同时检测芯片上的DNA。在低缓冲条件下对LAMP和PCR的条件进行优化，同时保持扩增效率和特异性。通过同时询问两种已知的生物标志物，证明了多重化的能力。

[0013] Duarte‑Guevara等人(2014,Anal Chem[分析化学]86:8359‑8367)研究了LAMP反应的背景下用代工厂制造的可单独寻址的双栅ISFET增强的生物感测分辨率。

[0014] 进一步，在临床环境中测试了Toumazou和Duarte‑Guevara(同上)描述的ISFET芯片架构的适用性(Duarte‑Guevara等人(2016),RSC Adv[英国皇家化学会研究进展]6:103872‑103887)，其中将双栅ISFET阵列平台用于靶向食源性细菌病原体的LAMP反应的芯片上电检测。

[0015] 尽管所列出的文献将ISFET方法描述为可行的生物感测技术，该生物感测技术是自动化友好的并且提供了许多优点，但是所披露的方法仍然存在限制它们在实践中使用的缺点。

[0016] 一个这样的缺点是，PCR中的电化学检测需要相对长的时间才能使扩增反应生成足够量的质子，从而获得可测量的信号，尤其是在靶核酸的低浓度下。在这点上，Tomazou等人(同上)提到，40个循环的芯片上pH测量PCR需要35分钟来完成，这并不能改善传统的基于光学的PCR机器的周转时间。在某些环境中，例如床旁诊断，不仅需要便携式紧凑型系统，而且需要在不损失灵敏度的情况下尽可能快地获得测试结果，以便对患者管理和结果进行快速干预。此外，由于ISFET的温度敏感性，使用经受热循环(比如在PCR中)的ISFET的检测可能具有挑战性，这一点需要始终加以考虑和补偿。

[0017] 此外，以ISFET作为检测方法的当前PCR方法通常涉及靶向特定分析物的非常特异性的测定，通过以下进行：创建多个微流体室，在其中每个微流体室中注射不同的引物，这增加了高度多重化环境中的占地面积；或将引物直接结合在芯片上来启动反应，这使得这些芯片在需要在测定中包括新靶标的情形中不可用。在这种情况下，每当需要添加新靶标时，必须生产新的芯片以包括用于新靶标的探针，从生产的观点来看导致花费更多的努力。这对于患者筛选是特别相关的，在患者筛选中，需要一体化的诊断方法(在一个芯片中筛选多种分析物)。

[0018] 仍然需要替代性的核酸分析技术。