[0001] 本发明涉及纳米制剂治疗牙周炎相关技术领域，具体是基于纳米硫化铜的新型纳米粒子的制备及应用。

[0002] 牙周炎是全球范围内最常见的慢性炎症性疾病之一，其特点是牙周组织(包括牙龈、牙周带、牙槽骨和牙骨质)的细菌感染和进行性破坏。细菌作为牙周炎发生和发展中的始动因素，会形成龈下菌斑生物膜。这些龈下菌斑生物膜在牙周组织中引发过度的促炎免疫反应，导致牙槽骨的破坏。目前，针对菌斑清除和牙槽骨再生的牙周炎临床治疗策略主要包括牙周基础治疗，以及再生性牙周手术。牙周基础治疗疗效往往受患者患牙本身解剖条件、操作者技术水平、牙周袋深度等的影响，导致细菌无法完全清除，如刮治器械范围之外的、位于深牙周袋内的细菌和入侵到牙龈中的细菌。虽然抗生素可以作为辅助治疗来增强细菌清除，但会导致细菌耐药性，破坏口腔微生物群落的平衡，甚至在全身用药时引发全身副作用。此外，再生性牙周手术后，骨再生的结果不稳定且难以预测，常常没有足够的血管生成，骨再生效果不佳。因此，临床上需要一种能有效清除细菌，特别是刮治器械范围之外的细菌，同时促进血管生成以增强骨再生的治疗方法，以提高牙周炎治疗效果。

[0003] 纳米粒子因为其高比表面积和高电荷密度而具有优异的抗菌性能，能够深入牙周袋和牙龈组织内，进行有效的细菌清除。作为纳米粒子，硫化铜(CuS)纳米颗粒具有良好的抗菌性能。它可以释放铜离子，通过Fenton反应产生活性氧(ROS)，导致细菌死亡。此外，CuS纳米颗粒还作为血管内皮生长因子(VEGF)的催化剂，抑制骨吸收，促进血管生成和骨组织形成。因此，CuS纳米颗粒在牙周炎治疗中受到广泛关注。然而，高浓度CuS纳米颗粒具有潜在毒性，人们便通过表面修饰和引入生物分子等方法来提高其生物相容性。介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)由于其优异的稳定性、良好的生物相容性、高比表面积和表面易修饰而可以作为纳米材料载体，用于搭载CuS纳米颗粒以提高其生物相容性。此外，从MSN中释放的硅离子能够促进成骨分化和促进骨再生。本研究中引入的生物分子是磺化壳聚糖(SCS)，它是一种在壳聚糖C‑2和C‑6位置磺化而成的多糖。由于其与肝素的结构相似，SCS在促进骨组织形成中引起了人们极大的兴趣。SCS可以促进VEGF介导的血管生成，并与BMP‑2有协同作用，增强BMP‑2的骨再生能力。总之，可以基于以上材料特性提出一种以CuS纳米颗粒为基础的纳米粒子用于牙周炎治疗，以达到有效清除细菌并促进牙槽骨再生的目的。

[0043] 下面将结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

[0044] 本发明基于纳米硫化铜的新型纳米粒子的制备及应用，CuS@MSN‑SCS的制备：包括：

[0045] 磺化壳聚糖(SCS)的合成：SCS的合成首先在冰浴中将5mL氯磺酸滴加到50mL N,N‑二甲基甲酰胺中，并搅拌15分钟,随后，在氮气保护下，将上述混合物滴入含有50mL甲酰胺、5
2mL甲酸和1g壳聚糖(CS，分子量2×10)的溶液中，50℃下搅拌2h,接下来，向混合溶液中加入300毫升无水乙醇以醇沉,沉淀物通过抽滤收集，随后用乙醇洗涤三次。所得的沉淀物在超纯水中溶解，再用1M NaOH和1M HCl将溶液pH值调节至中性。随后，将溶液离心(500rpm，
15min)以去沉淀，并通过旋转蒸发浓缩上清液，双蒸水透析3天，冻干，保存于4℃备用；

[0046] CuS@MSN纳米粒子的制备：将0.2mmol二水合氯化铜和0.136mmol二水合柠檬酸三钠溶解在200mL超纯水中，室温下搅拌形成浅蓝色溶液，在蓝色溶液中加入0.2mmol九水合硫化钠，并在室温下搅拌5min，然后将所得产物在90℃下加热，以800rpm搅拌15分钟，从而形成柠檬酸盐修饰的CuS纳米颗粒，呈深绿色溶液；将0.7g十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)加入到65mL CuS溶液中，然后在40℃下以500rpm搅拌4.5小时，随后，反应液中加入了3mL乙醇、100μL 30mg/mL氢氧化钠溶液和100μL原硅酸四乙酯(30μL/min泵入)，然后在40℃下500rpm搅拌1.5小时，最后，在130mLCuS溶液合成的反应物中加入约700mL无水乙醇，在50℃下以1000rpm回流1天，重复三次，以达到用乙醇充分洗去CTAB的目的，从而得到CuS@MSN；

[0047] CuS@MSN‑SCS纳米粒子的制备：首先，采用(3‑氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)对CuS@MSN纳米颗粒进行表面氨基修饰，将130mL CuS溶液制备的CuS@MSN纳米颗粒溶解于50mL水中，随后，溶液中逐滴加入50μL的APTES，并在50℃下以400rpm搅拌24小时，然后水洗
3次，溶于50mL双蒸水中，即可得到经过APTES修饰的CuS@MSN纳米颗粒，简称为CuS@MSN‑NH2；随后，将1mg的磺化壳聚糖(SCS)加入CuS@MSN‑NH2溶液中，并在室温下搅拌反应1天。最后，水洗3次，即可制取Cu@MSN‑SCS纳米颗粒。

[0048] CuS,Cu@MSN,CuS@MSN‑NH2和Cu@MSN‑SCS的形貌特征和分散程度通过透射电子显微镜(TEM)和场发射扫描电子显微镜(FE‑SEM)来进行观察，并且同时进行样品的元素分布分析，拍摄元素分布图像，在观察过程中，TEM和FE‑SEM的加速电压分别设定为100kV和10kV，TEM和FE‑SEM图像通过Image J软件进行纳米粒径的定量分析，通过傅里叶红外光谱仪，获取了Cu@MSN、CuS@MSN‑NH2和Cu@MSN‑SCS的傅里叶红外光谱(FTIR)，确定了相关特征基团，利用X射线光电子能谱仪，对这些样品的X射线光电子能谱(XPS)和表面元素组成进行了分析，并使用Thermo Advantage软件对Cu2p、S2p和N1s的高分辨率光谱进行了分峰，粉末X射线衍射(XRD)用于获取CuS、Cu@MSN、CuS@MSN‑NH2和Cu@MSN‑SCS的纳米衍射图，以深入研究其晶体结构，最后，采用纳米粒度和Zeta电位分析仪仪器对样品进行了Zeta电位分析，以探究其表面电荷性质。

[0049] CuS@MSN‑SCS抗菌性能测试包括细菌培养、CuS@MSN‑SCS对游离菌的抗菌作用、CuS@MSN‑SCS对菌斑生物膜的破坏作用、细菌胞内ROS水平；

[0050] 细菌培养采用核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum,F.n.)测试Cu@MSN‑SCS的抗菌性能，采用胰蛋白酶豆汤(TSB)培养基作为具核梭菌的液体和固体培养基，将冻存菌株涂于TSB琼脂板上，37℃厌氧培养2d，随后，用接种环挑单个菌落，接种于新鲜液体培养基中，37℃孵育1d，将得到的细菌悬液用TSB培养基稀释，直至菌液的OD600值比纯TSB培养基的OD600值高0.03‑0.05；

[0051] CuS@MSN‑SCS对游离菌的抗菌作用采用平板计数法对Cu@MSN‑SCS对游离F.n.的抑菌效果进行了评估，首先，Cu@MSN‑SCS溶于PBS溶液配成不同浓度，加入取200μL的F.n.悬液，使各组终浓度为0、50、100、150、200、250、300μg/mL，共孵育24小时，0μg/mL Cu@MSN‑SCS组作为对照组，接下来，各组取100μL混悬液，用PBS稀释后，将其涂在TSB琼脂板上，在37℃下孵育48小时，最后，对每组细菌菌落数进行技术，并使用以下公式计算抑菌率(N0为对照组菌落数，Ntest为Cu@MSN‑SCS组菌落数)：

[0052] CuS@MSN‑SCS对菌斑生物膜的破坏作用：在96孔板中加入100μL细菌悬液，并静置下培养3天，第2天更换培养基，随后，轻轻用PBS洗涤生物膜，去除其中的游离细菌，接下来，去除旧培养基后加入100μL新鲜培养基和100μL溶于PBS溶液的、不同浓度的Cu@MSN‑SCS，共孵育24小时。孵育结束后，去除旧培养基，并用结晶紫染色法测定生物膜的量，每孔中加入100μL 0.1％结晶紫溶液，对生物膜染色10min，随后，用超纯水充分冲洗各孔，并在室温下干燥，然后，向每个孔中加入150μL乙醇，在室温下复染，20分钟后，将100μL乙醇溶液转移到新的96孔板上，并使用多孔酶标仪测定结晶紫溶液在590nm处的OD值，为了评价抗菌膜的效果，进行了细菌活/死荧光染色实验，首先将生物膜用PBS洗涤三次，然后，在每个孔中应用TM
LIVE/DEAD BacLight细菌活力试剂盒L13152(Invitrogen )避光下染色15分钟，随后，各孔用PBS冲洗，使用倒置双光子激光共聚焦扫描显微镜观察染色后的生物膜，生物膜的CLSM图像由LAS AF软件采集。

[0053] 细菌胞内ROS水平采用了胞内ROS探针DCFH‑DA，首先，200μL细菌悬浮液与溶于PBS的、不同浓度的Cu@MSN‑SCS的PBS溶液共培养了24小时(材料终浓度为0、50、100、150、200、250、300μg/mL)，随后，将细菌悬液充分混合，并均匀分为两部分，一部分用于细菌计数分析，另一部分用于ROS检测，细菌计数采用了平板计数法，取100μL共孵育液，将其稀释于PBS中，然后涂到TSB琼脂板上，接着，在37℃下孵育48小时，每组进行了细菌计数，每组测量了三次，为了检测ROS，将细菌悬液以5000rpm离心5分钟，去除上清液后，重新悬浮细菌，并按照制造商的说明与DCFH‑DA溶液共孵育了20分钟，随后，用PBS洗涤细菌悬液，然后使用激发波长为488nm，发射波长为525nm的酶标仪测量荧光强度，最后，通过将总荧光强度除以细菌数量来计算荧光强度，完成了细菌内ROS产生的评估。

[0054] CuS@MSN‑SCS体外生物相容性评价包括细胞活性检测、溶血实验；细胞活性检测：小鼠成纤维细胞(L929)在DMEM培养基中培养，DMEM中添加了10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素，将L929细胞接种于96孔板中，每孔3000个细胞，然后在37℃下孵育24小时，接下来，分别加入100μL含有不同浓度Cu@MSN‑SCS(终浓度为50、100、150、200、250、300μg/mL)的培养基与细胞共培养1天和2天，对照组则使用不含Cu@MSN‑SCS的培养基进行处理，随后，加入100μL含有10％ CCK8溶液的培养基，孵育1小时，并在450nm(OD450)处使用多孔酶标仪读取仪测量溶液的光密度，每项测量均重复三次；为了计算细胞活力，使用以下公式：
其中，为Cu@MSN‑SCS基团的吸光度，为对照组的吸
光度，为无细胞的、含有10％ CCK8溶液的培养基的吸光度；

[0055] 溶血实验从健康的SD大鼠心尖采集了新鲜血液，采血后，取0.5mL血液，以5000rpm离心5分钟，将所得的沉淀物重悬于25mL PBS中，接下来，将0.1mL不同浓度的CuS@MSN‑SCS溶液与0.9mL红细胞悬液混合，同时，用双蒸水和PBS分别作为阳性对照(+)和阴性对照(‑)；在阳性对照组中，取0.9mL红细胞悬液，在离心后重悬于1mL双蒸馏水与红细胞混合，随后，在37℃下孵育1小时，再以5000rpm离心5分钟，最后，使用多孔酶标仪测定上清液在540nm处的吸光度，用以下公式计算溶血率： 其中，Abs表示
CuS@MSN‑SCS组的吸光度，Abs(+)表示阳性对照组的吸光度，Abs(‑)表示阴性对照组的吸光度。

[0056] Cu@MSN‑SCS对大鼠牙周炎疗效的评估：8周龄雄性SD大鼠购于中国济南鹏越实验动物养殖场，这些大鼠被置于恒温25±1℃、相对湿度60‑70％的环境中，光照‑黑暗循环为12小时；

[0057] SD大鼠被随机分为四组：i)空白组，即无牙周炎的健康大鼠；ii)牙周炎组(阴性对照)，治疗牙周炎的大鼠，使用0.9％生理盐水局部处理；iii)Cu@MSN‑SCS组，治疗牙周炎的大鼠，使用Cu@MSN‑SCS局部治疗；iv)米诺组(阳性对照)，治疗牙周炎的大鼠，使用米诺环素局部治疗。

[0058] 为建立大鼠结扎性牙周炎模型，在双侧上颌第二磨牙(M2)颈部使用4‑0号丝缝线进行结扎，持续2周，随后，拆除丝线，并对结扎部位进行10次不同处理(如0.9％生理盐水、MiNo或Cu@MSN‑SCS)，每2‑4天进行一次处理，在第30天，对大鼠进行安乐死，切除上颌骨并进行解剖以供进一步实验分析，同一名操作者对麻醉下的大鼠进行了操作；

[0059] 采用小动物活体成像仪对标本进行分析，以观察骨再生情况，上颌标本被固定在样品床上，进行360°旋转扫描，然后，使用Data Viewer软件进行CT图像重建，根据重建的micro CT图像，用ImageJ软件测量了M2颊侧釉牙骨质界(CEJ)到牙槽骨嵴(ABC)的距离，在整个治疗过程中监测了大鼠的体重，并在动物实验结束时计算了体重变化；

[0060] 为了进行组织学分析，上颌标本采集后立即置于4％多聚甲醛溶液中固定48小时，随后，使用10％乙二胺四乙酸溶液脱钙4周。脱钙后的上颌骨进行了脱水、石蜡包埋，然后沿M2冠长轴方向切片，进行了苏木精‑伊红染色和马松染色，免疫反应评分根据ISO 10993指南，根据免疫细胞的评估进行了评估。使用ImageJ软件对降解胶原的面积进行了定量分析，通过监测体重和心肝脾肺肾的变化来评价CuS@MSN‑SCS在体内的安全性；

[0061] 使用TNF‑α和CD31免疫组化染色分析了牙周炎模型中的炎症反应和血管形成情况，切片经兔抗TNF‑α或兔抗CD31一抗孵育过夜，随后使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG进行二抗处理50分钟，使用ImageJ软件测量了平均光密度，对免疫组化染色图像进行了相对定量分析。

[0062] 所有数据均以均数±标准差(SD)的形式呈现，统计分析是使用GraphPad Prism 8.3.0软件完成的，组之间的差异分析采用了Tukey检验的单因素方差分析，在显著性水平方面，使用星号来表示结果，具体表示如下：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

[0063] 结果：1.成功制备CuS@MSN‑SCS，具有核壳结构的CuS@MSN‑SCS纳米粒子通过软模板法成功合成(图2)。CuS纳米粒子因其表面有柠檬酸钠配体覆盖，故而带负电。通常情况下，在带负电的CuS纳米颗粒上直接包裹二氧化硅外壳是非常困难的，因为TEOS的水解产物也带有负电荷。为了克服这一难题，采用了表面活性剂CTAB作为软模板。带正电的CTAB会通过静电和疏水作用在CuS纳米粒子周围形成双层涂层和胶束。因此，CuS纳米粒子的表面获得了正电荷。在碱性条件下，通过带正电的CTAB和阴离子硅酸盐之间的静电作用，CTAB周围的TEOS水解缩聚形成二氧化硅，从而形成CuS@MSN/CTAB核壳纳米颗粒。经过乙醇处理从而去除CTAB模板后，用APTES表面修饰CuS@MSN纳米粒子，使其表面为氨基，从而带正电荷。带电正电荷的CuS@MSN‑NH2纳米粒子可以通过静电作用与带负电荷的SCS相互吸引，从而合成CuS@MSN‑SCS纳米粒子。

[0064] 通过TEM和FE‑SEM分析了CuS、CuS@MSN、CuS@MSN‑NH2和CuS@MSN‑SCS纳米粒子的形貌(图3A‑B)。在对CuS纳米粒子进行介孔二氧化硅包裹、氨基修饰和SCS修饰后，观察到纳米粒子粒径的增加(图3C)，并且在CuS@MSN、CuS@MSN‑NH2和CuS@MSN‑SCS中明显存在核壳结构。这表明二氧化硅外壳成功包覆了CuS纳米粒子，并且SCS修饰在二氧化硅外壳表面。Cu、S、O和N的元素映射图像证实了这些结果(图3D)。然而，与CuS相比，CuS@MSN‑NH2和CuS@MSN‑SCS的分散性较差，这可能是由于范德华力、静电斥力、氢键、空间效应和疏水作用之间的不平衡所致。

[0065] 为了研究纳米粒子的特征性化学基团，检测了纳米粒子的FTIR。如图4所示，所有样品的FTIR都出现了代表Si‑O‑Si不对称和对称拉伸振动的特征峰，这表明在MSN中存在二氧化硅，从而证实了MSN成功包裹了CuS。在CuS@MSN‑NH2中，3450cm‑1附近出现特征峰，代表‑NH2的拉伸振动，证实了‑NH2接枝到CuS@MSN表面。随后，在SCS修饰后，在1203cm‑1附近出现了源自SCS的S＝O特征峰，同时Si‑O‑Si和‑NH2特征峰分别蓝移到994cm‑1和3310cm‑1。这些结果证实了CuS@MSN‑SCS纳米颗粒中SCS的非共价键结合。

[0066] 在XPS光谱上(图5A)，所有样品都显示出Cu 2p、O 1s、C 1s、Si 2s和Si 2p的对应峰，这可以归因于修饰了柠檬酸钠的CuS纳米颗粒以及MSN的包裹。在CuS@MSN‑NH2中，400eV附近出现了一个与N1s相关的峰，证实了‑NH2的成功修饰。此外，在CuS@MSN‑SCS的光谱中，在168eV附近出现一个与S2p对应的新峰，这印证了SCS的修饰。为了进一步分析官能团的变化，我们对Cu2p、S2p和N1s进行了高分辨谱分峰拟合分析。在Cu2p谱(图5B)中，在952.7eV、932.7eV附近的峰分别代表Cu2p1/2和Cu2p3/2，在两峰间有一卫星峰，Cu2p1/2和Cu2p3/2源自CuS，其中Cu2p3/2证实了CuS@MSN‑SCS中CuS的存在。S2p谱(图5B)中,除了源自CuS的S2p1/2(163.0eV)和S2p3/2(162.0eV),还可见位于170.0eV和168.9eV附近的并且源于‑SO3‑的S2p1/2和S2p3/2，这证实了SCS的成功修饰。CuS@MSN‑NH2的N1s谱(图5C)中，在
400.9eV和399.6eV附近见代表‑NH2和C‑N的峰，证明了氨基通过APTES成功修饰在MSN表面；
在402.5eV出现一个小峰(19.9％)，代表源于CTAB的四价氮(N‑Q),这证明少量的CTAB残留在CuS@MSN‑SCS中。在CuS@MSN‑SCS的N1s谱(图5C)中，除了‑NH2(400.6eV)、C‑N(399.6eV)和N‑Q(402.8eV)外，还存在‑NHSO3‑(401.9eV),也为CuS@MSN‑SCS中SCS的存在提供了证据。

[0067] 此外，本研究还通过XRD分析了CuS、CuS@MSN、CuS@MSN‑NH2和CuS@MSN‑SCS纳米颗粒的晶体结构(图6A)。CuS纳米粒子的XRD谱图与标准六方相的CuS的(JCPDS卡号:79‑2321)基本匹配。CuS@MSN、CuS@MSN‑NH2和CuS@MSN‑SCS呈现两个主峰。一个以23°(2θ)为中心的宽峰，对应二氧化硅的无定形结构，另一个在48°附近的峰对应CuS的(110)衍射峰。这些结果表明，即使二氧化硅包裹，CuS纳米晶体结构仍部分保留。值得注意的是，CuS和CuS@MSN在近红外波段(λ>800nm)有较宽的吸收带，这表明了它们的光热性能及在光热治疗中的应用潜能。然而，与‑NH2修饰后，纳米粒子的光热效应减弱(图6B)。

[0068] Zeta电位分析(图6C)显示，CuS纳米粒子的Zeta电位为‑10.41±2.25mV。加入CTAB后，CuS@MSN/CTAB的Zeta电位增加到20.60±0.56mV。去除CTAB并进行APTES修饰后，纳米粒子的zeta电位在CuS@MSN中下降到‑8.99±0.21mV，随后在CuS@MSN‑NH2中上升到20.40±0.70mV。最后，经SCS修饰后，Zeta电位降至10.57±0.57mV。这些结果证实了CuS@MSN‑SCS纳米颗粒的成功合成。

[0069] 磺化壳聚糖(SCS)作为CuS@MSN‑SCS中组分之一，为验证其成功合成，本研究进行了相关表征。与壳聚糖(CS)相比，SCS在1203cm‑1处显示出显著的吸收峰，这是由于S＝O的拉伸引起的。同时，在803cm‑1的峰值表明存在C‑O‑S键的拉伸。这些结果为SCS中存在磺化基团(‑SO3‑)和C‑6位置的磺化提供了明确的证据。在1H‑NMR谱中，约3.18和3.87ppm处的峰属于C‑2处磺化的氨基，而4.3ppm处的峰表示磺化的C‑6 41。SCS中的硫含量高达12.56％。SCS的Zeta电位为‑51.3±0.53mV，SCS带负电是SCS修饰了纳米粒子后Zeta电位降低的原因。

[0070] 2.CuS@MSN‑SCS造成具核梭杆菌氧化应激从而抑制细菌生长和生物膜形成，具核梭杆菌(F.n.)在牙菌斑生物膜的形成和成熟过程中扮演着关键角色，它通过促进早期和晚期牙菌斑的集聚来起到“微生物桥梁”的作用。F.n.能够直接影响宿主免疫反应并增强其他牙周炎病原体的致病性。研究已经证明，针对性地清除F.n.可以有效地减少病原菌的集聚和生物膜的形成。因此，本研究旨在探讨CuS@MSN‑SCS对F.n.的抗菌性能。如图8A所示，相较于对照组(0μg/mL)，50μg/mL CuS@MSN‑SCS促进了F.n.的生长。这是因为低浓度的CuS@MSN‑SCS会释放较低水平的Cu2+，从而引发应激反应。然而，在100～300μg/mL范围内，CuS@MSN‑SCS显著降低了细菌的生长，抑制效果与浓度呈正相关。其中，在250μg/mL和300μg/mL CuS@MSN‑SCS组中，抑制率超过95％(图8B)，表明CuS@MSN‑SCS具有显著的抗菌效果。

[0071] 鉴于牙菌斑生物膜是引发牙周炎的始动因素，本研究进一步使用结晶紫染色法来评估CuS@MSN‑SCS的抗生物膜能力。染色结果越深，生物膜的量越多。对照组和50μg/mL CuS@MSN‑SCS组的紫色强度较深(图8A)。随着CuS@MSN‑SCS浓度的升高，颜色变浅，OD值下降。与对照组相比，200‑300μg/mL组的OD值降低了约50％(图8C)，表明CuS@MSN‑SCS在较高浓度下具有显著的抗生菌膜能力。随后，为检测CuS@MSN‑SCS对细菌生物膜活性的影响，本研究进行了细菌活死染色检测。当高浓度CuS@MSN‑SCS处理生物膜时，生物膜厚度明显降低(图8D)，并且死细菌与活细菌的比例也有所增加。这表明高浓度CuS@MSN‑SCS会显著降低生物膜活性。

[0072] 为了进一步研究CuS@MSN‑SCS的抗菌性能与ROS之间的关系，我们使用ROS检测试剂盒来评估细菌内ROS水平(图8E)。低浓度的CuS@MSN‑SCS(50～150μg/mL)对F.n.中ROS的表达没有明显影响。然而，当样品浓度增加到200μg/mL时，随着浓度的增加，ROS水平显著升高。这可能是因为CuS@MSN‑SCS释放Cu2+离子，Cu2+离子与H2O2通过芬顿反应生成O2·‑。生成的O2·‑随后通过Haber‑Weiss反应与H2O 2进一步反应生成·OH，导致氧化应激反应。氧化应激反应通常通过DNA损伤、蛋白质氧化和脂质过氧化等途径诱导细菌死亡，最终导致细菌凋亡和抑制生物膜的形成。

[0073] 3.CuS@MSN‑SCS具有良好的生物相容性，在生物医学应用中，对纳米材料的可行性进行评估时，细胞相容性的检测非常重要。如图9A所示，除了300μg/mL组外，L929成纤维细胞在第1天和第2天的细胞存活率均保持在75％以上，这表明CuS@MSN‑SCS浓度在低于250μg/mL以下时具有良好的细胞相容性。为了评估CuS@MSN‑SCS的血液相容性，进行了溶血试验(图9B)。与对照组相比，不同浓度CuS@MSN‑SCS处理后，上清液未出现明显的溶血现象，各组的溶血率均在5％以下，符合医学标准。总的来说，CuS@MSN‑SCS在浓度低于250μg/mL时表现出良好的生物相容性。

[0074] 4.CuS@MSN‑SCS促进了牙周炎大鼠的牙槽骨再生，为兼顾CuS@MSN‑SCS的抗菌性能和生物相容性，选用了250μg/mL浓度的CuS@MSN‑SCS来治疗大鼠牙周炎。本研究采用丝线结扎法和高糖饮食联合诱导大鼠牙周炎，详细操作如图10A所示。将丝线结扎与大鼠上颌第二磨牙牙颈部，以诱发炎症，并在接下来的14天内喂食高糖饮食。大鼠牙周炎模型建立后，进行了10次局部治疗，并以广泛使用的抗生素米诺环素(MiNo)作为阳性对照组，来比较治疗效果。

[0075] 如图10B所示，与空白组相比，牙周炎组出现了明显的牙槽骨吸收，证实了牙周炎模型的成功建立。CuS@MSN‑SCS组和MiNo组均表现出明显的疗效，即牙槽骨再生，两者之间没有显著性差异。这些结果通过牙槽骨丧失(ABL)水平的量化得到进一步支持，ABL是牙周炎进展的典型标志(图10C)。此外，CuS@MSN‑SCS处理后，未影响大鼠体重的增加(图10D)。心肝脾肺肾的H&E染色中未观察到明显的炎症或病变迹象(图11)，这表明CuS@MSN‑SCS对正常器官无毒。

[0076] 使用H&E和Masson染色对第二上颌磨牙的牙周组织进行了检测，如图12A所示。与空白对照组相比，牙周炎组表现出多种炎症表现，但经过CuS@MSN‑SCS或MiNo治疗后，这些炎症表现得到了缓解。空白对照组的牙周组织结构完整，牙龈胶原纤维有序排列，纺锤形纤维细胞和星形成纤维细胞沿着纤维束有序排列。然而，在牙周炎组中，结合上皮增生并向根方延伸，同时在牙龈上皮中存在上皮钉。胶原纤维水肿，排列紊乱，而且在牙龈上皮和上皮下纤维组织中见明显的炎细胞浸润。在CuS@MSN‑SCS或MiNo治疗后，观察到牙龈上皮钉减少和结合上皮增生缓解，同时胶原纤维排列趋向有序，牙周组织炎细胞减少，疗效明显。为了更直观地反映治疗效果，本研究对免疫细胞(图12B)和胶原降解(图12C)进行了定量分析。免疫反应评分和胶原降解率均证实CuS@MSN‑SCS纳米颗粒在治疗牙周炎时能够减轻炎症、抑制胶原降解并促进牙槽骨再生。

[0077] 为验证炎症反应是否缓解，本研究进行了TNF‑α的免疫组化染色。结果显示，牙周炎组中TNF‑α的表达明显增加(图13A)。而在经过CuS@MSN‑SCS和MiNo治疗后，炎症水平明显减轻，CuS@MSN‑SCS组与MiNo组之间没有显著性差异(图13B)，再次证实了CuS@MSN‑SCS纳米颗粒在减轻炎症方面的积极作用。炎症与新生血管和血管功能密切相关，这两者在骨愈合中都具有关键作用。因此，对血管生成标志物CD31进行了评估(图13A)。与其他组相比，CuS@MSN‑SCS表现出更高水平的CD31阳性血管生成(图13C)，这可以归因于Cu2+和SCS。这些研究结果明确指出，CuS@MSN‑SCS具有减轻炎症和促进血管新生的能力，进而促进牙槽骨再生。

[0078] 以上对本发明及其实施方式进行了描述。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。