[0001] 本发明涉及抗体与磁珠偶联，具体地涉及通过含巯基的特定试剂来将抗体和磁珠偶联的方法以及由此得到的偶联物。

[0002] 在免疫检测中，抗体可以通过化学或物理吸附手段固定在固相表面，但通常间接偶联技术在抗体的偶联中应用更广泛。例如，抗体中的氨基，抗体蛋白质分子中每个肽链都具有末端氨基，氨基可以与多种官能团具有反应性，包括活化羧基、醛等。氨基在抗体中大量存在，使其成为抗体偶联反应中最常见的基团。

[0003] 巯基是抗体蛋白质上另一个重要的反应基团，具有很高的活性。抗体中的巯基大部分来自于半胱氨酸的侧链，多数情况下，抗体上的巯基会交联形成分子内二硫键，而二硫键无法直接用于衍生。因此，在利用巯基进行偶联反应时一般使用2‑亚氨基硫烷等与伯胺基反应引入巯基或者利用巯基乙胺(2‑MEA)或二硫苏糖醇(DTT)等还原剂将胱氨酸的二硫键还原为含有巯基的半胱氨酸残基。

[0004] 目前常用的巯基引入方法有Traut试剂、巯基乙胺(2‑MEA)或DTT还原等方法。Traut试剂(2‑亚氨基硫烷或2‑IT)是一种用于硫醇化(巯基加成)的环状硫代亚氨酸酯化合物，但是在抗体中用Traut试剂引入巯基时，Traut试剂与抗体中的氨基发生随机反应，因此当抗体中的抗原结合位点处的氨基与Traut试剂发生反应后，抗体与抗原结合的能力将会丢失，将影响抗体与抗原结合效率。而使用巯基乙胺(2‑MEA)或DTT还原二硫键引入巯基也存在一些问题，还原剂在还原过程中可能出现不同的还原产物，最终的目标产物得率较低。

[0005] 此外，还公开了使用S‑(2‑硫代吡啶基)‑L‑半胱氨酸酰肼)和S‑(2‑硫代吡啶基)巯基‑丙酰肼进行抗体偶联的技术，但是这些技术得到的抗体均一性差，影响抗体性能。

[0006] 背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

[0023] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0024] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0025] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0026] 本文中，术语“羧基磁珠”是指表面含有羧基的磁性颗粒，其大小不限定，例如纳米级颗粒或微米级颗粒。磁性颗粒一般为无机磁性颗粒，其成分包括但不限于金属合金(Fe、Co、Ni)、氧化铁(γ‑Fe2O3、Fe3O4)、铁氧体(CoFe2O4、BaFe12O19)、氧化铬(CrO2)和氮化铁(Fe4N)等。优选地，无机磁性颗粒成分为四氧化三铁，其可容易地在水溶液中沉淀制备，优选亚铁盐溶液与高铁盐溶液在碱性条件下共沉淀合成的超顺磁性的纳米四氧化三铁。

[0027] 本发明中，磁珠表面的羧基可通过在磁性颗粒包裹具有羧基功能基团的有机高分子得到。所述有机高分子包括天然高分子和合成高分子。示例性天然高分子的实例包括但不限于蛋白质、纤维素、壳多糖、葡聚糖和磷脂类等。合成高分子子的实例包括亲水性高分子如聚乙二醇、聚丙烯醛、聚丙烯酰胺等，疏水性高分子如聚苯乙烯、聚丙烯酸酯等，有机硅化合物如硅烷衍生物等。示例性实施方案中，有机高分子经化学修饰从而具有羧基功能基团。本发明的羧基磁珠一般具有核壳结构，即位于内部的磁性颗粒核心和位于表面的有机高分子，特别是位于表面的羧基。

[0028] 本文中，术语“偶联”是指多个有机化学单位进行化学反应而得到一个有机分子的过程。通过偶联反应使多个(如两个)有机化学单位之间形成化学共价键。在有机化学单位为两个的情况下，偶联可以是两者之间的直接共价结合，也可通过连接基团或连接臂使两者之间间接形成共价结合。

[0029] 本文中，术语“第一缓冲液”和“第二缓冲液”各自分别表示不同的缓冲液，其中，“第一”和“第二”仅表示区分目的，并非表示存在先后关系。第一缓冲液优选为低pH缓冲液，其pH值一般控制为4.5‑5.5范围内，此类缓冲液的实例包括但不限于MES缓冲液，即2‑(N‑吗啉代)乙磺酸缓冲液。MES缓冲液中2‑(N‑吗啉代)乙磺酸的浓度一般为0.05‑0.5M，如0.1M、0.2M、0.3M等。第二缓冲液优选为中性或略碱性缓冲液，其实例包括但不限于PBS缓冲液，即磷酸盐缓冲液，其pH值一般控制为7.0‑8.0，如7.5±0.2等。PBS缓冲液中磷酸盐的浓度一般为0.05‑0.5M，如0.1M、0.2M、0.3M等。

[0030] 本文中，步骤(1)为羧基微球与含巯基试剂反应步骤，其包括在第一缓冲液中使羧基磁珠先后与1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺反应，分离磁珠后在第二缓冲液中进一步与含巯基的酰肼反应得到羧基活化的修饰磁珠。步骤(1)中基于10mg羧基磁珠，1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐的量一般为0.1‑1mg，优选0.2‑0.6mg。N‑羟基琥珀酰亚胺的量一般为0.1‑1mg，优选0.3‑0.8mg，如0.5mg、0.7mg等。含巯基的酰肼的量一般为0.1‑1mg，优选0.3‑0.8mg，如0.5mg、0.7mg等。

[0031] 本文中，术语“含巯基的酰肼”是指含有巯基且基本上为线性的酰肼分子，即在巯基和酰肼两种基团之间为线性结构，其实例包括但不限于3‑巯基丙酰肼，其中PEG的分子量一般为1000‑3000，如1200、1400、1500、1600、1700、1800等。含巯基的酰肼用于形成不可逆的共价键，即形成稳定且不可逆的硫醚键。

[0032] 本文中，步骤(2)为抗体氧化步骤，其包括在第二缓冲液中使糖类抗体经温和氧化处理得到修饰抗体。其中糖类抗体是指含有糖分子的抗体，优选在Fc端具有糖的抗体。通过本发明的步骤(2)使抗体的糖氧化。本发明优选经温和氧化处理进行抗体氧化，从而不影响抗体活性。温和氧化可通过使用例如NaIO4进行氧化。氧化反应优选在第二缓冲液中进行。氧化时，基于抗体2mg抗体，氧化剂的用量一般为1‑20毫摩尔，优选0.5‑10毫摩尔。氧化反应优选在避光条件下进行，反应时间一般为10‑60分钟，优选15‑50分钟，如20分钟、30分钟、35分钟、40分钟等。氧化时氧化剂一般配制为一定浓度，如NaIO4的浓度一般为20‑50mM，如
25mM、30mM、35mM、40mM、45mM。如果浓度过高，则对抗体性能产生影响。另一方面，如果浓度过低，则氧化反应趋向于不完全。

[0033] 本文中，步骤(3)为抗体偶联反应，其包括在适于反应的条件下使修饰磁珠和修饰抗体反应形成腙键，由此实现抗体的定向偶联。偶联反应时，基于10mg羧基磁珠，抗体的量一般为0.05‑10mg，优选0.1‑5mg等。

[0034] 在步骤(1)之前可选地包括洗涤或清洗羧基磁珠的步骤，其包含使用例如第一缓冲液清洗至少一次。

[0035] 本发明中，步骤(1)‑(3)各自分别均在温和条件下进行，例如在10‑40℃，如15、20、25℃温度下进行反应。

[0036] 实施例1

[0037] 本实施例为抗体和磁珠偶联的方法，其包括：

[0038] 一、羧基微球和巯基反应

[0039] 取1mL混合均匀的羧基磁珠(含10mg羧基磁珠)，用1mL 0.1M pH5.0的MES缓冲液清洗3次，加入1mL 0.1M pH5.0的MES缓冲液混合均匀，然后加入40μL 10mg/mL EDC溶液并涡旋混匀，加入0.6mg NHS后室温下滚动混匀器上混匀15分钟。磁分离弃上清液，加入1mL 0.1M pH5.0的MES缓冲液混合均匀后磁分离弃上清液，加入1mL 0.1M pH7.4的PBS缓冲液混合均匀后磁分离其上清液，加入1mL 0.1M pH7.4的PBS缓冲液混合均匀后加入0.6mg 3‑巯基丙酰肼(5mM)后室温下滚动混匀器上混匀2小时，磁分离弃上清液，用1mL 0.1M pH7.4的PBS缓冲液清洗3次，加入1mL 0.1M pH7.4的PBS缓冲液混合均匀备用。

[0040] 二、酰肼与抗体反应

[0041] 取0.2mg CA19‑9抗体，加入3mL 0.1M pH7.0的PBS缓冲液，混合均匀后用30KD的超滤管将稀释后的抗体溶液浓缩至2mg/mL，加入2mL 30mM NaIO4(0.1M pH7.0的PBS缓冲液)混合均匀后，然后避光室温下滚动混匀器上混匀30分钟，混合均匀后用30KD的超滤管除去多余的NaIO4，将超滤后的溶液加入步骤一制备的酰肼反应基团标记的羧基微球溶液，然后室温下滚动混匀器上混匀30分钟。加入BSA溶液继续混合液旋转混匀3小时，得到磁珠微球偶联抗体的混合溶液。

[0042] 实施例2

[0043] 与实施例1相比，区别在于步骤一中羧基微球和巯基反应加入的偶联剂3‑巯基丙酰肼量不同，步骤二中酰肼与抗体反应中的氧化剂NaIO4浓度不同，其它组分比例和操作步骤不变。本实施例中加入的偶联剂3‑巯基丙酰肼为：0.36mg，氧化剂NaIO4浓度为20mM。

[0044] 实施例3

[0045] 与实施例1相比，区别在于步骤一中羧基微球和巯基反应加入的偶联剂3‑巯基丙酰肼量不同，步骤二中酰肼与抗体反应中的氧化剂NaIO4浓度不同，其它组分比例和操作步骤不变。本实施例中加入的偶联剂3‑巯基丙酰肼为：0.96mg，氧化剂NaIO4浓度为50mM。

[0046] 实施例4

[0047] 与实施例1相比，区别在于步骤一中羧基微球和巯基反应加入的偶联剂不同，其它组分比例和操作步骤不变。本实施例中加入的偶联剂为巯基‑PEG2000‑酰肼。

[0048] 对比例1

[0049] 与实施例1相比，区别在于步骤一中羧基微球和巯基反应加入的偶联剂3‑巯基丙酰肼量不同，步骤二酰肼与抗体反应中的氧化剂NaIO4浓度不同，其它组分比例和操作步骤不变。本实施例中加入的偶联剂3‑巯基丙酰肼为：0.12mg，氧化剂NaIO4浓度为10mM。

[0050] 对比例2

[0051] 与实施例1相比，区别在于步骤一中羧基微球和巯基反应加入的偶联剂3‑巯基丙酰肼量不同，步骤二中酰肼与抗体反应中的氧化剂NaIO4浓度不同，其它组分比例和操作步骤不变。本实施例中加入的偶联剂3‑巯基丙酰肼为：1.2mg，氧化剂NaIO4浓度为60mM。

[0052] 对比例3

[0053] 制备CA19‑9磁珠抗体偶联物，其具体步骤如下所示：

[0054] (1)将CA19‑9抗体用0.02M PBS缓冲液稀释至0.2mg/mL，制得抗体溶液。

[0055] (2)在步骤(1)的抗体溶液中加入巯基乙胺，使其终浓度为10mM，混匀后，在室温(25℃)条件下反应60min。采用PBS平衡脱盐柱，并对反应结束后的产物脱盐除杂，制得纯化后的半抗体片段溶液。

[0056] (3)取羧基纳米磁微粒10mg，并用0.02M MES缓冲液清洗后，重悬，制备浓度为10mg/mL的纳米磁珠溶液。然后，按照纳米磁珠、碳二亚胺及1‑(2‑氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐的质量比为1:0.05:0.05的比例，向纳米磁珠溶液中加入碳二亚胺及1‑(2‑氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐，室温(25℃)条件下反应30min，然后磁分离，弃上清，制得活化后的纳米磁珠。

[0057] (4)将步骤(3)制得的火化后的纳米磁珠用PBS清洗后，与步骤(2)制得的纯化后的半抗体片段溶液混匀，使得抗体片段与纳米磁珠的质量比为1:50，室温(25℃)反应3小时。

[0058] (5)在步骤(4)的反应结束后，用含0.1％(m/v)BSA和1mM NEM的PBS溶液清洗磁珠1次，并在室温(25℃)反应3小时。

[0059] (6)在步骤(5)反应结束后，用含0.1％(m/v)BSA的PBS溶液置换磁珠，并重悬浓度为10mg/mL，4℃保存。

[0060] 对比例4

[0061] 制备CA19‑9磁珠抗体偶联物，其具体步骤如下所示：

[0062] (1)酰肼化磁载体的制备

[0063] 第一步：合成含酰肼的PMAO

[0064] a)单保护己二酰肼的合成：2.8g己二酰肼溶解于40mL水中，0.8g二‑叔丁基二碳酸溶解于10mL甲醇中，将二‑叔丁基二碳酸滴加至己二酰肼溶液。反应结束后通过乙酸乙酯萃取除去双保护的己二酰肼，柱层析去除未保护的己二酰肼，得到二‑叔丁基二碳酸酯单保护己二酰肼。

[0065] b)将上述合成的单保护己二酰肼加入二甲基甲酰胺溶解的450mg聚马来酸酐十八酯醇溶液中，75℃反应2h后，产物用氯仿萃取，后用饱和氯化钠水洗除去水溶性杂质，用无水MgSO4干燥。产物过滤减压蒸干溶解得到据马来酸酐十八醇酯与二‑叔丁基二碳酸酯保护的己二酰肼缩合物。

[0066] c)酰肼脱保护：将上述产物加入5mL二氯甲烷和5mL三氟乙酸的混合溶液中，室温搅拌1h后停止反应，旋转蒸发溶剂，将酰肼脱保护得到含酰肼链的PMAO，粉末密封保存于室温。

[0067] 第二步：酰肼修饰的磁载体的合成

[0068] 5mg上述合成的双亲链和10mg羧基磁珠置于进样瓶中，加入100μL氯仿，涡旋充分混匀后加入250μL的10mg/mL十二烷基硫酸钠水溶液。将上述混合物超声乳化，超声参数设置为：功率80W，时间2min，超声5s间隔10s。超声乳化结束后置于60℃烘箱中4h以挥发氯仿。最后将合成的酰肼化磁载体悬浮于1mL超纯水中备用(12mg/mL)。

[0069] (2)抗体的氧化：

[0070] 取100mg CA19‑9抗体，溶于20μL醋酸钠缓冲溶液中(0.05mol/L，pH＝4.2)，再加入50μL NaIO4水溶液(1mg/mL，pH 4.2)4℃避光震荡2h，然后使用超滤管1000rpm/min超滤
10min，用50μL PBS 7.4(0.01M)将抗体洗涤下来，即得到氧化后的抗体(2mg/mL)。

[0071] (3)抗体与磁载体的偶联：

[0072] 取200μg合成的酰肼化磁载体溶于500μL pH6.0的磷酸(PB)缓冲液中，加入8μg氧化后的CA19‑9抗体，于室温下孵育10min实现抗体的定向偶联。而后加入100μL猪血清继续室温孵育10min封闭磁载体上剩余的酰肼基团，待反应结束后磁分离，将沉淀复溶于100μL复溶液中(复溶液成分：0.01MPB缓冲液(pH＝7.4)中含25％蔗糖与0.1％叠氮钠)，即获得抗体定向偶联的免疫磁吸附剂。

[0073] 对比例5

[0074] 制备CA19‑9磁珠抗体偶联物，其具体步骤如下所示：

[0075] 与实施例1相比，区别在于步骤一中羧基微球和巯基反应加入的偶联剂不同，其它组分比例和操作步骤不变。本实施例中加入的偶联剂为TPCH(S‑(2‑硫代吡啶基)‑L‑半胱氨酸酰肼)和TPMPH(S‑(2‑硫代吡啶基)巯基‑丙酰肼，混合浓度为5mM。

[0076] 测试例

[0077] 将实施例1‑4、对比例1‑5制备的不同抗体磁珠偶联物用0.1M pH7.4的Tris缓冲液稀释成磁珠微球浓度为0.4mg/mL的工作液，配合吖啶盐标记的抗CA19‑9单抗复合物检测CA19‑9抗原和生理盐水，重复10次，计算10次测定结果的平均值 与标准差(SD)，根据公式(1)计算变异系数。

[0078]

[0079] 式中：

[0080] CV‑‑变异系数；

[0081] ‑‑10次测定结果的均值；

[0082] SD‑‑10次测定结果的标准差；

[0083] 比较样本检测的发光值，实施例1‑4、对比例1‑5检测CA19‑9抗原和生理盐水的结果如表1和表2所示。

[0084] 表1空白样本发光值

[0085]

[0086] 表2低浓度样本发光值

[0087]

[0088] 表1和表2结果显示：本发明的方法通过巯基偶联的抗体磁珠偶联物检测空白样本时发光值更低，且检测同样浓度的样本发光值更高，相对于对比例其检测本底更低，灵敏度显著提高，具有明显的优势。

[0089] 尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。