[0001] 本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种用于细菌实时免洗的双光子成像的方法。

[0002] 细菌无处不在，与人类健康密切相关。由致病菌污染的空气、食物和水引起的疾病是世界上一个持续严重的公共卫生问题。细菌感染是世界上人类疾病和死亡的主要原因之一。全球每年约有三分之一的死亡和数百万例由致病菌引起的感染病例发生在世界各地。由于过度使用抗生素，传染病的治疗面临着一个棘手的挑战，即抗生素耐药性的出现和发展出的多药耐药菌株。特别是对于医院感染，耐多药的流行导致一些感染更加难以治疗。更严重的是，抗生素耐药性的传播速度快于新抗生素的引进，导致细菌感染，这是一个重大的公共卫生危机。因此，快速、高效地识别和成像细菌的有效方法是有意义的，迫切需要帮助卫生专业人员进行可靠的靶向治疗。

[0003] 荧光探针依靠荧光光谱来识别和识别细菌种类。同样重要的是，依靠荧光显微镜，对细菌进行荧光成像可以获得更多的动态信息，例如Kasper等人对厌氧菌脆弱拟杆菌进行荧光标记，并对其在小鼠体内和离体肠道的通过进行了成像。通过生物正交点击化学，用叠氮修饰糖将一个含环辛烷的荧光团标记到细菌表面。该探针通过对一整只活的动物进行长时间成像，帮助定量小鼠肠道中的脆弱拟杆菌总数。他们还通过体外肠道器官成像获得了细菌的特定位置。在另一项工作中，Bertozzi等人使用生物兼容的无铜点击化学，报道了一系列用于细菌肽聚糖免洗成像的杂化硅罗丹明探针。Jaffrey等人开发了基于遗传编码的菠菜传感器，用于对活细菌中的细胞内代谢物和蛋白质进行荧光成像。然而，这些报道使用遗传编码技术和生物正交点击化学定位细菌表面或细菌内部的小分子探针，这不能用于完整的细菌细胞。同时，这些探针应用单光子短波长进行成像。

[0004] 双光子成像具有更深的组织穿透深度,双光子显微镜的穿透深度通常是共聚焦显微镜的2到3倍。激发波长由紫外、可见光调整为红外激发，长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小，比较适合活细胞长时间的动态观察。芘分子具有单分子和双光子激发特性，单分子激发波长在紫外区域，双光子激发波长在700‑800nm之间。前期应用的二连咪唑衍生的芘化合物对细菌能够进行双光子荧光成像，但是成像效果较差，需要开发新的细菌双光子成像方法，用于其长时间动态的观察。

[0027] 下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

[0028] 实施例1

[0029] 用于细菌成像的荧光探针PI‑4的制备，基本合成方法如下：

[0030] (1)中间体4‑氯代‑1‑芘基丁酮的合成：

[0031] 在氮气保护下，在100mL双口瓶中依次加入芘2.0g，4‑氯丁酰氯1.41g，二氯甲烷30mL，冰盐浴冷却至‑10℃，搅拌条件下向反应液中缓慢加入无水氯化铝1.33g，继续搅拌1小时后得反应液颜色变深；撤去冰浴，将反应温度缓慢升至室温，继续搅拌10小时后停止反应，将反应液倒入100mL冰水中，随后用二氯甲烷萃取三次，无水硫酸镁干燥，过滤，旋除溶剂，硅胶柱分离，得到淡黄色固体4‑氯代‑1‑芘基丁酮，产率82％。

[0032] (2)中间体1‑(4‑氯丁基)‑芘的合成：

[0033] 在氮气保护下，在250mL史莱克瓶中依次加入无水氯化铝1.387g，氢化铝锂0.4g，乙醚9mL，搅拌条件下，将4‑氯代‑1‑芘基丁酮1.27g溶于30mL二氯甲烷后，缓慢加入反应液中，在室温下搅拌反应3小时，将反应液倒入冰水中，淬灭剩余的氯化铝和氢化铝锂，用质量浓度36％盐酸调节反应液pH至5的酸性，随后用二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，过滤，旋除溶剂，硅胶柱色谱分离，得到白色固体1‑(4‑氯丁基)‑芘，产率78％。

[0034] (3)探针PI‑4的合成：

[0035] 在氮气保护下，在50mL单口瓶中依次加入二联咪唑12.7mg，1‑(4‑氯丁基)‑芘100mg和10mL乙腈，升温至110℃，搅拌下反应96小时后，停止反应，有白色沉淀析出，过滤，沉淀用乙醚洗涤；随后将所得沉淀溶于甲醇中，向其中缓慢滴加饱和的六氟磷酸钾甲醇溶液，析出白色沉淀产物，产率28％。

[0036] 其核磁谱图氢谱数据如下：

[0037] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ9.57(s,1H),8.34(d,J＝9.3Hz,1H),8.31–8.26(m,2H),8.22(dd,J＝8.5,3.2Hz,2H),8.14(s,2H),8.11–8.01(m,2H),7.94(d,J＝7.9Hz,1H),7.89(t,J＝1.7Hz,1H),6.64(s,1H),4.29(t,J＝7.1Hz,2H),3.38(d,J＝7.6Hz,2H),2.01–1.91(m,2H),1.83–1.73(m,2H).

[0038] 经核磁和质谱鉴定，产物结构为探针PI‑4，此合成方法参考专利CN201911258592.6。

[0039] PI‑6的合成与上述方法相同，与其不同之处在于，使用等摩尔量的原料4‑氯戊酰氯代替4‑氯丁酰氯进行合成。产物结构经核磁和质谱鉴定；

[0040] 化合物结构如图1所示:n＝4时化合物为PI‑4；n＝6时化合物为PI‑6。

[0041] 实施例2

[0042] 用于细菌成像的荧光探针PI‑3的制备，基本合成方法如下：

[0043] 在氮气条件下，50mL的双口瓶中加入芘(4g,19.77mmol)和溴丙酰溴(3.33g,16.48mmol)溶解于40mL二氯甲烷，保持温度在0℃，缓慢的加入氯化铝粉末(2.64g,
19.77mmol)于反应液中，搅拌2小时后得到深色溶液；将温度升到室温搅拌8小时后，加入
20mL冰水淬灭多余的氯化铝，随后用100mL二氯甲烷萃取分离得到粗产物，通过硅胶柱色谱，在石油醚：二氯甲烷＝7:3(V/V)的条件下分离得到2‑溴代‑1‑芘基丙酮；

[0044] 在氮气条件下，50mL的双口瓶中加入四氢铝锂(0.295g,7.78mmol)和氯化铝(1.04g,7.78mmol)溶于9mL乙醚，随后将溶于12.5mL二氯甲烷的2‑溴代‑1‑芘基丙酮(1.00g,3.11mmol)缓慢加入反应液中，在室温下搅拌1小时后得到白色沉淀。用20mL冰水淬灭多余的氯化铝和四氢铝锂，用2.5摩尔的盐酸调节反应液至pH＝6，随后用100mL二氯甲烷萃取分离得到粗产物，通过硅胶柱色谱,在石油醚的条件下分离得到1‑(2‑溴丙基)‑芘；

[0045] 在氮气条件下，25mL的双口瓶中加入二联咪唑(96.25mg,0.65mmol)和1‑(2‑溴丙基)‑芘(400mg,1.30mmol)混合于20mL乙腈溶于，升温至80℃回流，搅拌24小时后产生沉淀，沉淀用40mL乙醚洗涤。随后将沉淀溶于20mL甲醇中，缓慢将5mL饱和六氟磷酸钾溶液滴入溶液中得到白色沉淀，过滤洗涤得到产物PI‑3。产物结构经核磁和质谱鉴定。

[0046] PI‑1的合成参考文献Biomaterials 2012,33,2282‑2288，PI‑2的合成参考专利CN201810491982.7。

[0047] 化合物结构如图1所示：n＝1时化合物为PI‑1；n＝2时化合物为PI‑2；n＝3时化合物为PI‑3。

[0048] 实施例3

[0049] 荧光探针PI‑1，PI‑2，PI‑3，PI‑4在PBS溶液中对蜡样芽胞杆菌的双光子成像[0050] 细菌培养：取革兰氏阳性菌蜡样芽胞杆菌50μL接种于5mL LB液体培养基中在37℃摇床震荡培养，至细菌浓度OD600为1.0，取1mL细菌溶液于EP管中，在10000rpm条件下离心2分钟，弃去上清液，用20mM、pH＝7.4的PBS缓冲液清洗细菌2次，最后用PBS缓冲液(20mM NaH2PO3和Na2HPO3，pH＝7.4)重悬细菌，调细菌的OD600＝0.5，备用。

[0051] 将PI‑1，PI‑2，PI‑3，PI‑4探针分别溶于DMSO溶液中分别配制成2mM的母液。分别取2.5μL上述探针母液，分别加入到0.5mL的上述细菌溶液中，混匀静置5分钟，然后取2.5μL的
2
混合液到底面厚度为0.17mm的表面皿，取5cm大小的1％的琼脂糖凝胶(厚度为0.1cm)覆盖于混合液上，在700nm波长下激发，用奥林巴斯的双光子激光共聚焦显微镜，在相同的仪器条件下进行成像，得到图2，图2a为加了不同荧光探针的细菌双光子荧光成像图，图2b为亮场条件下的细菌成像，图2c为a和b的叠加图，图2d为图2a中沿白色实线的荧光强度图。

[0052] 图2表明4个探针在PBS溶液中都能对蜡样芽胞杆菌进行成像，且细胞膜上显示出明显的荧光，而细胞内部没有荧光，表明探针都标记在细胞膜上，但是4个探针显示出差异的荧光成像效果，从成像和荧光光谱的比较可以看出，PI‑1和PI‑2显示出微弱的蜡样芽胞杆菌形貌，细胞膜上的荧光强度约为1500，相对而言，PI‑3和PI‑4孵育的蜡样芽胞杆菌显示出明显且清晰的细菌形貌，细菌的细胞膜上的荧光达到2500‑3500，是PI‑1和PI‑2标记的细胞膜荧光强度的2倍左右。以上结果表明PI‑(1‑4)探针均能在PBS溶液中无需清洗的情况下标记于蜡样芽胞杆菌的细胞膜上，用双光子激光共聚焦显微镜成像，看到清晰的棒状的细胞轮廓。但是，PI‑3和PI‑4相较于PI‑1和PI‑2识别细胞膜后的荧光更强，标记效果更好。

[0053] 实施例4

[0054] 荧光探针PI‑1，PI‑2，PI‑3，PI‑4在PBS溶液中对大肠杆菌的双光子成像[0055] 细菌培养：取革兰氏阴性菌大肠杆菌50μL接种于5mL LB液体培养基中在37℃摇床震荡培养，至细菌浓度OD600为1.0，取1mL细菌溶液于EP管中，在10000rpm条件下离心2分钟，弃去上清液，用20mM、pH＝7.4的PBS缓冲液清洗细菌2次，最后用PBS缓冲液(20mM NaH2PO3和Na2HPO3，pH＝7.4)重悬细菌，调细菌的OD600＝0.5，备用。

[0056] 将PI‑1，PI‑2，PI‑3，PI‑4探针分别溶于DMSO溶液中分别配制成2mM的母液。分别取2.5μL上述探针母液，分别加入到0.5mL的上述细菌溶液中，混匀静置5分钟，然后取2.5μL的
2
混合液到底板厚度为0.17mm的表面皿，取5cm大小的1％的琼脂糖凝胶(厚度为0.5cm)覆盖于混合液上，在700nm波长下激发，用奥林巴斯的双光子激光共聚焦显微镜，在相同的仪器条件下进行成像，得到图3，图3a为加了不同荧光探针的细菌双光子荧光成像图，图3b为亮场条件下的细菌成像，图3c为a和b的叠加图，图3d为图3c中沿黑色实线的荧光强度图。

[0057] 图3表明4个探针在PBS溶液中都能对大肠杆菌进行成像，且都标记在细胞膜上，但是4个探针显示出差异的荧光成像效果，从成像和荧光光谱的比较可以看出，PI‑1对绝大多数大肠杆菌成像及其微弱，细胞膜上的荧光强度只有约1000，PI‑2显示出微弱的大肠杆菌形貌，细胞膜上的荧光强度约为1500。相对而言，PI‑3和PI‑4孵育的大肠杆菌显示出明显且清晰的细菌形貌，细菌的细胞膜上的荧光达到2200‑2400。以上结果表明PI‑(1‑4)探针均能在PBS溶液中无需清洗的情况下标记于大肠杆菌的细胞膜上，用双光子激光共聚焦显微镜成像，看到清晰的棒状细胞轮廓。但是，PI‑2，PI‑3和PI‑4相较于PI‑1识别细胞膜后的荧光更强，标记效果更好。

[0058] 实施例5

[0059] 荧光探针PI‑1，PI‑2，PI‑3，PI‑4，PI‑6在LB培养基中对蜡样芽胞杆菌的双光子成像

[0060] 细菌培养：将蜡样芽胞杆菌50μL接种于5mL LB液体培养基中在37℃摇床震荡培养，至细菌浓度OD600为1.0，分别取4个1mL细菌溶液于不同EP管中备用。

[0061] 将PI‑1，PI‑2，PI‑3，PI‑4，PI‑6探针分别溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液，分别取5μL上述探针母液，分别加入到上述1mL的细菌溶液中，混匀静置5分钟，然后取2.5μL的混2
合液到底板厚度为0.17mm的表面皿，取5cm大小的0.8％的琼脂糖凝胶(厚度约为0.3cm)覆盖于混合液上，在700nm波长下激发，用奥林巴斯双光子激光共聚焦显微镜，在相同的仪器条件下进行成像，得到图4，图4a为加了不同荧光探针的细菌双光子荧光成像图，图4b为亮场条件下的细菌成像，图4c为a和b的叠加图，图4d为图4c中沿黑色实线的荧光强度图。

[0062] 图4中的荧光成像和对应的细菌表面荧光强度光谱数据显示出，用相同的对比度处理图片后，5个探针显示出差异的荧光成像效果，PI‑1探针几乎不能标记于细菌细胞膜上，细胞膜上的荧光强度与背景荧光相当，约为500；PI‑2和PI‑6相对于PI‑1标记效果略好，显示出蜡样芽胞杆菌形貌，细菌细胞膜的荧光强度(约为800)强于PI‑1对细菌的标记强度，相对而言，PI‑3和PI‑4孵育的蜡样芽胞杆菌显示出更明显且清晰的细菌形貌，探针标记在细菌的细胞膜上，荧光强度约为1200‑1400。以上实验表明PI‑3和PI‑4相较于PI‑1，PI‑2和PI‑6能在LB培养基中，无需清洗的情况下较好的标记于蜡样芽胞杆菌的细胞膜，并在双光子激光共聚焦显微镜下对蜡样芽胞杆菌进行成像，看到清晰的棒状细胞轮廓。

[0063] 实施例6

[0064] 荧光探针PI‑3和FM 4‑64(购买于Sigma‑Aldrich)在LB培养基中对蜡样芽胞杆菌的共定位成像

[0065] 细菌培养：取过夜培养的蜡样芽胞杆菌50μL接种于5mL LB液体培养基中，在37℃摇床震荡培养，至细菌浓度OD600为1.0，取1mL细菌溶液于EP管中备用；

[0066] 将PI‑3和FM 4‑64探针分别溶于DMSO溶液中分别配制成2mM的母液。分别取0.5μL上述探针母液同时加入到1mL的细菌溶液中，混匀静置5分钟，然后取2.5μL的混合液到表面2
皿，取5cm大小的1.2％的琼脂糖凝胶(厚度约为0.1cm)覆盖于混合液上，在750nm波长下激发PI‑3分子，用543nm激光激发FM 4‑64分子，进行荧光成像，得到图5。

[0067] 图5显示，PI‑3和FM 4‑64探针分别标记在细菌上，且具有很好的共定位(如图5重叠图所示)，FM 4‑64为商业的细菌细胞膜染料，表明PI‑3标记于蜡样芽胞杆菌的细胞膜上，显示出清晰的棒状细胞轮廓。

[0068] 实施例7

[0069] 荧光探针PI‑3和FM 4‑64在LB培养基中对蜡样芽胞杆菌的共定位成像[0070] 细菌培养：取蜡样芽胞杆菌50μL接种于5mL LB液体培养基中，在37℃摇床震荡培养，至细菌浓度OD600为0.3，将5mL细菌溶液置于EP管中，用离心机于10000‑14000rpm下离心2min，弃上清，用1mL的LB培养基重悬备用。

[0071] 将PI‑3和FM 4‑64探针分别溶于DMSO溶液中分别配制成2mM的母液。分别取1.5μL上述探针母液同时加入到1mL的细菌溶液中，混匀静置5分钟，然后取10μL的混合液到表面2
皿，取20cm 大小的1％的琼脂糖凝胶(厚度约为0.5cm)覆盖于混合液上，在750nm波长下激发PI‑3分子，用543nm激光激发FM 4‑64分子，进行荧光成像，得到与图5相似的成像结果。

[0072] 实施例8

[0073] 荧光探针PI‑3和FM 4‑64在LB培养基中对大肠杆菌的共定位成像

[0074] 细菌培养：取大肠杆菌菌落单斑接种于5mL LB液体培养基中，在37℃摇床震荡培养，至细菌浓度OD600为0.4，将5mL细菌溶液置于EP管中，用离心机于10000‑14000rpm下离心2min，弃上清，用1mL的LB培养基重悬，备用。

[0075] 将PI‑3和FM 4‑64探针分别溶于DMSO溶液中配分别制成2mM的母液。分别取0.25μL上述探针母液同时加入到1mL的细菌溶液中，混匀静置5分钟，然后取2.5μL的混合液到表面2
皿，取5cm 大小的1％的琼脂糖凝胶(厚度为0.1cm)覆盖于混合液上，在730nm波长下激发PI‑3分子，用543nm激光激发FM 4‑64分子，进行荧光成像，得到图6。

[0076] 图6显示，PI‑3和FM 4‑64探针分别标记在细菌上，且具有很好的共定位(如图6重叠图所示)，表明PI‑3标记于大肠杆菌的细胞膜上，能够看到清晰的细胞轮廓。

[0077] 实施例9

[0078] 荧光探针PI‑3在LB培养基中对多种细菌的免洗双光子成像

[0079] 细菌培养：分别挑取革兰氏阴性菌肺炎克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌和副溶血弧菌，以及革兰氏阳性菌无乳链球菌和金黄色葡萄球菌菌落单斑分别用100μL LB液体培养基重悬于EP管中备用。

[0080] 将PI‑3探针溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液，取0.5μL上述探针母液，分别加入2
到上述100μL的各个细菌溶液中，混匀静置5分钟，然后取2.5μL的混合液到表面皿，取5cm大小的1％的琼脂糖凝胶(厚度约为0.1cm)覆盖于混合液上，在700nm波长下激发，用双光子激光共聚焦显微镜成像，得到图7。

[0081] 图7显示出清晰的细菌轮廓成像，表明PI‑3能够标记于革兰氏阴性菌肺炎克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌和副溶血弧菌，分别为短粗的棒状菌。还能标记于革兰氏阳性菌无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜上，显示出圆球的形状。

[0082] 实施例10

[0083] 荧光探针PI‑4在LB培养基中对多种细菌的免洗双光子成像

[0084] 细菌培养：分别取革兰氏阴性菌肺炎克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌和副溶血弧菌，以及革兰氏阳性菌无乳链球菌和金黄色葡萄球菌菌落单斑分别接种于5mL LB液体培养基中在37℃摇床震荡培养，至细菌浓度OD600为1.0，分别取1mL细菌溶液于EP管中备用。

[0085] 将PI‑4探针溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液，取5μL探针母液，分别加入到上述2
1mL的各个细菌溶液中，混匀静置5分钟，然后取2.5μL的混合液到表面皿，取5cm大小的1％的琼脂糖凝胶(厚度约为0.1cm)覆盖于混合液上，在700nm波长下激发，用双光子激光共聚焦显微镜成像，得到的荧光成像与图7中细菌的成像类似，证明PI‑4能够标记于革兰氏阴性菌肺炎克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌和副溶血弧菌，以及革兰氏阳性菌无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜上，显示出短粗或者球形的轮廓。

[0086] 实施例11

[0087] 实时追踪达托霉素对蜡样芽胞杆菌的细胞膜的影响

[0088] 细菌培养：取蜡样芽胞杆菌菌落单斑接种于5mL LB液体培养基中，在37℃摇床震荡培养，至细菌浓度OD600为0.5，将1mL细菌溶液置于EP管中，加入达托霉素至终浓度为200μg/mL，静置10分钟。

[0089] 将PI‑3和商业染料碘化丙啶(PI，购买于Sigma‑Aldrich)探针分别溶于DMSO溶液中分别配制成2mM的母液。分别取5μL探针母液分别加入到上述1mL的细菌溶液中，混匀静置2
5分钟，然后取2.5μL的混合液到表面皿，取5cm 大小的1％的琼脂糖凝胶(厚度约为0.2cm)覆盖于混合液上，在700nm波长下激发PI‑3分子，用543nm激光激发PI分子，分别在1,3,5,7,
9,11,13,15分钟时进行成像，得到图8。

[0090] PI能够透过死菌的细胞膜标记细菌的核酸显示红色荧光，但是其不能标记活的细菌。图8中可见，第1分钟是，PI‑3标记与细菌的细胞膜上，且细菌内没有PI的荧光表明细菌处于活菌状态，第7‑15分钟时，白色剪头对应的细菌膜上出现一个凸起的细菌膜小泡，第15分钟时PI染料进入细菌中表明细菌死亡。表明达托霉素通过破坏细菌的细胞膜而使细菌死亡。