[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体是一种检测条石鲷（samd3/elf3）基因间区（DNA）插入变异的特异性标记、引物、鉴定方法、试剂盒及在雌雄遗传性别鉴定中的应用。

[0002] 条石鲷是一种栖息在温带和亚热带岩礁区的鲈形目鱼类，俗称石鲷或石加拉。它主要分布在我国黄海、东海以及日本和韩国南部海域,为定居性鱼类。条石鲷特征为皮下含丰富胶质，口感独特，外形优美，被称为“梦幻之鱼”。它不仅具有较高的食用价值,也是一种观赏鱼类。产品主要销往我国南北地区和日韩市场，平均每公斤价格在200‑240元，市场需求日益增长。我国南北近年来都相继开展了条石鲷的人工繁殖、苗种生产和养殖业。现年产品苗可达100万尾，养殖规模的年产值达5000多万元。它的食性特点更有利于与其他水产鱼类进行混养，降低养殖成本。条石鲷采用性别决定的X1X1X2X2/X1X2Y机制。雄鱼由于带有Y染色体，其生长速度优于雌鱼。研发快速鉴定其性别的技术将有助于选育生长速度更快的雄性品种，从而提高养殖效率和产值，更好地开发利用这一宝贵的渔业资源。

[0003] Samd3 蛋白（Sterile alpha motif domain‑containing protein 3），在生物过程中发挥着至关重要的作用，该基因参与细胞分化、免疫反应和神经系统的发育。研究表明，samd3 基因突变可导致多种健康状况，例如自身免疫性疾病和神经系统疾病。Elf3蛋白（E74 like ETS transcription factor 3），也称为E74样因子3。该基因参与多个器官的发育和功能，包括大脑、肝脏和胰腺。它对于维持适当的昼夜节律和控制参与免疫反应的基因的表达至关重要。研究表明Elf3也可在胚胎发育和干细胞分化中发挥作用。了解这两种基因的功能对于开发新的治疗方法和发育调控研究至关重要。

[0019] 以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

[0020] 本发明首先通过采用第三代PacBio全基因组测序技术完成了条石鲷雌、雄全基因组测序及组装，获得了条石鲷雌、雄染色体水平的高质量基因组（SRP160016，SRP220007， Xiao et al., 2019, 2020）；通过比较基因组生物信息学分析方法发现相较于雌鱼X1染色体samd3/elf3基因间区，条石鲷雄鱼Y染色体上同源samd3/elf3基因间区发生了1处大片段DNA序列插入变异（图1）。选择雌鱼X1染色体上samd3/elf3基因间区16200bp~16600bp区及雄鱼Y染色体与之同源且存在DNA序列插入的44000bp~45100bp区为研究目标区域（图1）。X1染色体上DNA片段长度为390bp，命名为ChrX1 samd3/elf3，其序列为X interID No:1；Y染色体上的DNA片段长度为1008bp，包含了与X1染色体上samd3/elf3基因间区同源序列，命名为ChrY samd3/elf3，其序列为Y interID No:1；ChrY samd3/elf3与ChrX1 samd3/elf3同源序列比对发现在与ChrX1 samd3/elf3r对应的第219位点和220位点之间发现了1个片段DNA序列缺失，大小为618bp（图2和图3），雄鱼Y染色体samd3/elf3基因间区在44000bp 45100bp区域比雌鱼X1染色体上~samd3/elf3基因间区同源区域插入了618bp大小的DNA序列，这个片段即为检测条石鲷samd3/elf3基因间区是否发生DNA片段插入变异的DNA标记；同时由于该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此这个片段也为条石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrY samd3/elf3则为条石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记。

[0021] 图1为本发明实施例提供的ChrX1samd3/elf3和ChrYsamd3/elf3在X与Y染色体上的具体位置信息图，390bp代表ChrX1samd3/elf3片段的长度，1008bp代表ChrYsamd3/elf3的长度；ChrYsamd3/elf3中间低位区域代表插入的404bp核苷酸序列，该区域与ChrX1samd3/elf3片段无同源匹配序列。图2为本发明实施例提供的获得的X染色体ChrX1samd3/elf3与Y染色体ChrYsamd3/elf3核苷酸序列比对图，两端引物位置用黑色粗下划线表示；*：代表ChrX1samd3/elf3和ChrYsamd3/elf3序列一致性，空白区域表示两者碱基不一致序列；_ _ _ ：代表插入缺失序列；黑色下划线代表插入序列所在区域。图3为本发明实施例提供的X染色体ChrX1samd3/elf3与Y染色体ChrYsamd3/elf3核苷酸序列同源插入/缺失差异DNA片段模式图；黑色区域代表同源区域，空白区域代表缺失区域及位点信息，灰色区域代表的是插入区域及位点信息。图4为本发明实施例提供的条石鲷雌雄个体PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果图，M：DL 2000 DNA Maker;♀：生理雌鱼；♂：生理雄鱼；图中呈现单条带（390bp）的个体为samd3/elf3基因间区未发生DNA序列插入个体，也为遗传雌性，生理性别组织学鉴定为雌性，呈现两条带（1008bp和390bp）的个体为samd3/elf3基因间区发生DNA序列插入个体，也为遗传雄鱼，并且生理性别组织学鉴定为雄鱼。

[0022] 本发明基于条石鲷雄鱼Y染色体samd3/elf3基因间区44000bp 45100bp位置发现~的长片段DNA插入序列特征标记来确定条石鲷samd3/elf3基因间区是否发生DNA片段插入变异，发明了一种条石鲷samd3/elf3基因间区DNA插入变异快速检测方法，并将该方法应用到了条石鲷雌、雄遗传性别的快速鉴定；具体检测方法，是确定待检测的条石鲷是否存在YinterID No:1的核苷酸片段（1008bp）；通过PCR引物进行快速鉴定；本发明基于对条石鲷Y染色体上的samd3/elf3基因间区序列和X1和X2染色体上的同源基因序列进行比较分析，确定了与X1染色体上samd3/elf3基因间区XinterID No:1核苷酸序列同源的Y染色体上YinterID No:1核苷酸序列，利用在上述samd3/elf3基因间区同源区域在条石鲷Y染色体有大片段插入这一特征，设计了两条引物。采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法，快速判断受检条石鲷samd3/elf3基因间区是否发生DNA片段插入变异；同时利用该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，应用于条石鲷遗传性别的精确鉴定，上下游引物序列分别为：
Chinter_F:1 : 5’‑ CTGTTCCTAAAAATGAATGGATG‑3’ (Xinter ID No:2)
Chinter_R:2 : 5’‑ AACAAGTTTAGACTAAATCC‑3’ (Xinter ID No:3)。

[0023] 使用上述引物鉴定条石鲷samd3/elf3基因间区DNA片段插入变异的步骤主要包括：提取高质量的条石鲷全基因组DNA、扩增Y染色体samd3/elf3基因间区DNA插入变异的特异标记DNA片段、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物DNA；其中在条石鲷雄鱼（X1X2Y）Y染色体和X1染色体中分别扩增出1008bp和390bp两个DNA片段，1008bp片段为发生DNA插入变异samd3/elf3基因间区特有标记片段；而在条石鲷雌性（X1X1X2X2）个体中仅扩增出390bp的单一DNA片段。

[0024] 本发明基于条石鲷雌雄全基因组测序和雌、雄个体samd3/elf3基因间区定位及DNA序列比对分析，可见条石鲷雄鱼Y染色体上的samd3/elf3基因间区发生了DNA长片段的插入变异，进而通过其作为条石鲷Y染色体上samd3/elf3基因间区碱基插入变异特有的DNA标记，并利用条石鲷samd3/elf3基因间区DNA序列插入变异快速鉴定条石鲷雌雄，采用该方法可以快速、准确和高效的区分受检条石鲷是否发生samd3/elf3基因间区序列插入变异。该方法会在samd3/elf3基因间区发生DNA插入的条石鲷个体中扩增出1008bp和390bp两条带，其中1008bp条带为特异性目的条带，而在未发生DNA插入的samd3/elf3基因间区个体中仅扩增出单一条带（390bp），上述目的条带可以采用琼脂糖凝胶电泳快速准确的分辨带型，实现条石鲷samd3/elf3基因间区发生DNA序列插入与否的快速鉴定。同时由于该特异性目的条带（1008bp）位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此这个片段也为条石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，可以应用于条石鲷雌、雄遗传性别的快速鉴定。

[0025] 实施例1条石鲷samd3/elf3基因间区序列变异特有DNA标记的筛选及验证条石鲷Y和X染色体samd3/elf3基因间区同源区段且含大片段插入目标DNA序列的
发现：所用的雄鱼异形染色体（neo‑Y）DNA序列及雌鱼的X1染色体DNA序列来自中国科学院海洋研究所海水鱼类增养殖与繁育技术研究室李军研究团队，团队委托武汉菲沙基因信息有限公司采用第三代PacBio全基因组测序技术完成了条石鲷雌、雄全基因组测序及组装，组装结果已公布（SRP160016，SRP220007， Xiao et al., 2019, 2020）。采用比较基因组生物信息学分析条石鲷雌雄基因组序列可见（参见图1），条石鲷雄鱼异形染色体Y上samd3/elf3基因间区与条石鲷雌鱼X1染色体samd3/elf3基因间区同源，且存在大片段DNA插入片段，其中X1染色体上samd3/elf3基因间区目标DNA片段长度为390bp，命名为ChrX1samd3/elf3，其序列为SEQ ID NO:1：
CTGTTCCTAAAAATGAATGGATGTTTTGCTGCCTTTTCATCTTTACTAATTAATGTTAGCTAGCTGTA
GACTGGAAAAAAATTATTTAATTCACTCAAAGGCTACCGGCAGCTTTTAAGGTGGAATGTTTTCTTGCATGTGTTACCTTTCCAGCTTTGGTCCTCCGAACCGTAGGTGGGAGACCTCTGGTTTCTTTAGGCTAATTTAACTGGCTTTAGCCTGGCTTGTCAGTTAGCTGGAAACTAGCCTCTGCACGTCATGGTAACGTTGCATAAAACAGGTGCTTTATTCGCTCGTTTGCATATTCGGGTCCAGCCCTACTAAATCATAAAATTCTATACTAAATCAGCAACACCTAAAATCTTTAATAGGATTTAGTCTAAACTTGTT。

[0026] 而在雄鱼异形染色体Y上samd3/elf3基因间区同源的目标DNA片段长度为1008bp，其包含了与X1同源序列，命名为ChrYsamd3/elf3，其序列为SEQ ID NO:2：CTGTTCCTAAAAATGAATGGATGTTTTGCTGCCTTTTCATCTTTACTAATTAACGTTAGCTAGCTGTA
GACTGGAAAGAAATTATTTAATTCACTCAAAGGCTACCGGCAGCTTTTAAGGTGGAATGTTTTCTTGCATGTGTTACCTTTCCAGCTTTGGTCTTCCGAACCGTAGGTGGGAGACCTTTGGTTTCTTTAAGCTAATTCAACTGGCTTTAGCTTGGTGTTGAAGCAAAACTGTGATTTTCTGAAGTGTTTATATATAAAAAACAAATAATCAAAAGTACCTGATTGTATGTATATCTAACATATAAAGTGTGAAGATTGTGTTTTAGCATGCAACATAAAAAGATCATAAAGTTTTTAAAAAATACAGTCCAAGAACTCCTGAAAACAACTGTGTCAAAAACATGTCCAGACTTGCCCAAGAGTGGAAAATCCCCAAACATATTGGAATCGGTGATATGCCTGGACTTGCCCGGGCAGGGGGCTGGACCATCCCAAATTTGGGAGAAATTACACCAATATTTACCTGGCGACAATGATTATTTTTAGAAATAGGTGAAGAAGCTCAGGTTTCTCCACCAATGTGGGCAGGGGCACTTGGACTATATAAGGTGCTGCACAGGCAGTAGCAAATCAGTCAGATTCCGGGACTGGCTTGGGTTTTATCTCTGTGAAGAATAAAACTCTATTGCATCGAACTCTGATCATCTCCAGTGAATTCTTTGAACCTGTTTGAGACTCCAATAGCTATTCAATCCTGAAGAAGACAAAGTGTTGGTGAAGAGGTCCAGACTTAAACTCTGGCCCAGACCTGGACTTCTGATCTTCAACACTGGCTTGTCAGTTAGCTGGAAACTAGCCTCTGCACAACATGGTAACGTTGCATAAAACAGGTGCTTTATTCGCTCATTTGCATATTTGGGTCGAGCCCTACTAAATCATATGATTCTATACTAAATCAGCAACACCTAAAATCTTTAATAGGATTTAGTCTAAACTTGTT。

[0027] 雌雄全基因组扫描和雌、雄个体samd3/elf3基因间区定位及DNA序列比对分析显示，与位于X1染色体samd3/elf3基因间区片段ChrX1samd3/elf3同源的ChrYsamd3/elf3（Y染色体）发生了1处DNA序列插入，分别对应ChrX1 samd3/elf3的第219位点和220位点之间发现了1个片段DNA序列缺失，大小为618bp（图3和图4）。Y染色体上samd3/elf3基因间区目标区域（ChrYsamd3/elf3）DNA序列比与X1染色体同源DNA区域（ChrX1samd3/elf3）插入了618bp大小的DNA序列，这个片段即为条石鲷samd3/elf3基因间区碱基插入变异特有的DNA标记，其存在与否可用来鉴别条石鲷samd3/elf3基因间区是否发生DNA序列插入变异。同时由于该标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此，ChrYsamd3/elf3这个片段也为条石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1samd3/elf3则为条石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，如图2和图3所示。

[0028] samd3/elf3基因间区序列变异特有DNA标记的序列验证：基于Y染色体samd3/elf3基因间区的SEQ ID NO:2核苷酸序列与X1染色体上同源基因SEQ ID NO:1核苷酸序列特征，设计两条引物（图3）。选择已知生理性别的雌、雄条石鲷并提取其高质量DNA，同时使用Chinter_F:1、Chinter_R:2两条引物进行PCR扩增，反应条件及程序如下：PCR反应体系为20µL，包括10×Buffer 5.8µL；dNTP（2.5mmol/L） 4.0µL；rTaq酶（5U/µL）0.2µL；Chinter_F:1 0.4µL；Chinter_R:2 0.4 µL；DNA模板2.0µL，7.2µL ddH2O；混匀后离心。Touch down PCR扩增程序：94℃ 3mins，59℃（‑1℃，3个循环） 1min，72℃ 1min30s，3个循环；94℃ 30s，56.5℃ 1min，72℃ 1min30s，30个循环；72℃ 10min，15℃保存。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳可以分辨出DNA片段插入与非插入samd3/elf3基因间区个体存在差异。将插入与非插入DNA序列samd3/elf3基因间区差异片段产物割胶回收并通过PMD18‑T载体转化至感受态细胞中，挑取阳性克隆送至青岛派森诺基因生物技术有限公司测序。测序结果验证了条石鲷X、Y染色体同源samd3/elf3基因间区含大片段插入目标DNA序列片段，如图1和图2所示。

[0029] 实施例2条石鲷samd3/elf3基因间区DNA片段插入变异鉴定技术的建立与应用对于来自山东威海市文登区海和水产育苗有限公司养殖的条石鲷（其中，12尾表型为雌鱼，12尾表型为雄鱼）进行遗传鉴定。

[0030] 高质量DNA提取：使用天根海洋动物DNA提取试剂盒提取条石鲷鳍条DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA的完整性，采用紫外分光光度计测量DNA上清的OD值，调整使得DNA浓度至60ng/µL，于‑20℃冻存备用。

[0031] PCR反应体系及PCR扩增鉴定：使用条石鲷samd3/elf3基因间区大片段序列变异特异的DNA片段引物Chinter_F:1和Chinter_R:2通过PCR方法检测条石鲷samd3/elf3基因间区DNA片段插入变异与否。PCR反应体系20µL：10×Buffer 5.8µL、dNTP 4.0µL、rTaq酶（5U/µL）0.2µL、上下游引物（Chinter_F:1和Chinter_R:2）各0.4µL、DNA模板2.0µL、ddH2O 7.2µL。Touch down PCR扩增程序：94℃ 3mins，59℃（‑1℃，3个循环） 1min，72℃ 1min30s，3个循环；94℃ 
30s，56.5℃ 1min，72℃ 1min30s，30个循环；72℃ 10min，15℃保存。每个待检测的PCR样品中加入10×Loading Buffer 2.0µL，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，在110V恒压电压下30分钟，凝胶成像可清晰的分别条石鲷samd3/elf3基因间区发生DNA插入与非插入变异个体（参见图4）。

[0032] 由图4可见，在samd3/elf3基因间区发生DNA插入的条石鲷个体中会扩增出两条目的条带（1008bp和390bp），其中1008bp条带为发生DNA片段插入samd3/elf3基因间区特异性目的条带ChrY samd3/elf3，而在未发生DNA片段插入samd3/elf3基因间区个体中只能扩增出单一带型ChrX1samd3/elf3（390bp）。由于ChrYsamd3/elf3标记位于雄鱼Y染色体上，具有伴雄性遗传特征，因此，ChrYsamd3/elf3这个片段也为条石鲷雄鱼Y染色体特有的DNA标记，而ChrX1samd3/elf3则为条石鲷雌雄遗传性别共有DNA特征标记，进而可将选取的条石鲷得以区分，采用本发明方法不仅可以快速、准确和高效的鉴定待检测条石鲷samd3/elf3基因间区是否发生DNA片段插入变异，而且在条石鲷基于samd3/elf3基因间区雌、雄个体细胞分化、免疫反应和神经系统的发育研究及雌雄性别鉴定、高雄苗种制备和家系选育上具有重要的意义和应用价值。