技术领域
[0001] 本发明属于禽沙门菌病防治技术领域，具体涉及O抗原稳定的鸡白痢沙门菌变异型菌株的构建方法及其在鸡白痢凝集抗原制备中的应用。
相关背景技术
[0002] 鸡白痢是鸡白痢沙门菌引起的一种严重危害世界家禽养殖业的疫病。该病可水平和垂直传播，其中垂直传播是该病的主要传播途径，对种鸡进行鸡白痢净化，淘汰阳性鸡，切断垂直途径是控制该病的关键手段。净化依赖高效的检测技术与试剂，因此研制高效、稳定、特异性强的检测试剂对于鸡白痢净化至关重要。
[0003] 运用鸡白痢凝集抗原，通过全血或血清凝集试验是检测鸡白痢阳性鸡只的主要方法。由于鸡白痢沙门菌O12抗原存在差异，即导致了鸡白痢沙门菌存在标准型和变异型2种血清亚型。鸡白痢沙门菌的标准型菌株的O12抗原包含了O121、O123，而鸡白痢沙门菌的变异型菌株的O12抗原包含了O121、O122，导致其血清的识别能力存在差异。因此，鸡白痢凝集抗原通常由鸡白痢沙门菌标准型菌株和鸡白痢沙门菌变异型菌株组合制备。
[0004] 然而，研究发现鸡白痢沙门菌变异型菌株的O抗原并不稳定，随着传代和培养条件的变化，变异型亚型的后代克隆中，一定量的菌株表现出标准型亚型的O抗原，这也导致由该菌株制备的凝集抗原的稳定性不足，影响检测准确度。因此，本发明在鉴定了决定鸡白痢沙门菌标准型和变异型O抗原相互转变的关键酶的基础上，运用基因过表达技术稳定高效表达该酶，构建O抗原稳定的鸡白痢沙门菌变异型菌株，并用于鸡白痢凝集抗原中变异型O抗原组分的制备。
具体实施方式
[0017] 实施例1SPUL_2404基因过表达菌株的构建
[0018] 1、SPUL_2404基因的克隆
[0019] 鸡白痢沙门菌SPUL_2404基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示(登录号为CP003047.1)。根据SPUL_2404基因序列设计引物：上游引物SPUL_2404‑F：5′‑agaaagaggagaaatactagATGAGAAGAAAAATGGTTAACAATAGATT‑3′；下游引物SPUL_2404‑R：5′‑ctcagctaattaagcttttaTTATTTAATTATTTCCGTAATATTCTCAT TTG‑3′，小写部分与载体插入位点上下游同源，大写部分为扩增SPUL_2404基因的引物。
[0020] 提取鸡白痢沙门菌C79‑3株(标准型血清亚型)的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，采用上述引物PCR扩增SPUL_2404基因。PCR反应体系为：primerSTAR mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，ddH2O 19μL，模板2μL。PCR产物经过1％浓度琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，获得了一条约1653bp的特异性DNA条带，与目标DNA片段大小相符。PCR产物采用DNA凝胶回收试剂盒进行切胶回收。
[0021] 2、过表达质粒构建
[0022] 提取pCDF‑J23‑GFP质粒稀释后作为模板，根据GFP片段所在位置，设计引物将质粒进行PCR扩增线性化，上游引物pCDF‑F：5′‑TAAAAGCTTAATTAG CTGAGCTTGGA‑3′，下游引物pCDF‑R：5′‑CTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAG TGCTAGT‑3′。PCR反应体系为：primerSTAR mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，ddH2O 19μL，模板2μL。PCR产物经过1％浓度琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，结果如图1所示，获得了一条大小为2420bp的特异性DNA条带，与目标DNA片段大小相符。回收产物与带同源臂片段的SPUL_2404基因用Infusion进行连接，转化DH5α，涂布链霉素抗性平板，挑取阳性克隆用质粒通用引物S‑J23‑F：5′‑TAGGCGTATCACGAGGCA‑3′，S‑J23‑R：5′‑TCGGTTCA GGGCAGGGT‑3′进行PCR鉴定，结果如图2所示，重组子扩增出一条大小约为2057bp的条带，PCR产物进行测序，结果显示过表达质粒pCDF‑J23‑SPUL_2404构建成功。
[0023] 3、过表达质粒的转化
[0024] 挑取鸡白痢沙门菌C79‑3单菌落，37℃200r/min摇菌过夜，次日按1:100转摇至50ml LB液体培养基中，摇菌约4h待OD600达到0.5‑0.6后，在超净台内将菌液转移至无菌离心管中，冰浴30min。菌液用预冷的离心机4000r/min离心10min，弃上清。加入20mL预冷的
10％甘油重悬洗涤菌体，菌液4000r/min离心10min，弃上清，重复洗涤三次，最后一遍离心去上清后加入适量冰预冷的10％甘油重悬菌体，100μL/管分装，多余的感受态放入‑80℃冰箱备用。加入10ng鉴定正确的质粒pCDF‑J23‑SPUL_2404，冰上放置20min后转入提前预冷的
0.1mm电转杯，1800V、200Ω进行电击转化，电击后迅速加入800μl预冷的LB，37℃200r/min摇菌1h复壮，涂布链霉素抗性LB平板过夜，长出的阳性克隆即为过表达SPUL_2404基因的鸡白痢菌株C79‑3/SPUL_2404‑O。
[0025] 4、血清学分析
[0026] 将亲本菌株C79‑3和过表达菌株C79‑3/SPUL_2404‑O分别划线于马丁琼脂平板上，10
过夜培养后挑取单菌落至适量的生理盐水中，细菌浓度调整为1.0×10 CFU/ml。取洁净的玻片1张，用移液器分别吸取25μl沙门菌O122血清和O123血清(购自中国兽医药品监察所)滴于玻片上，然后分别吸取25μl菌液分别加入O122血清和O123血清中，并轻轻摇动玻片充分混匀，2分钟后判定结果。如图3所示，C79‑3株与O123血清反应，而不与O122血清反应，为标准型菌株。C79‑3/SPUL_2404‑O株与O122血清反应，而不与O123血清反应，表明C79‑3/SPUL_2404‑O株转变为变异型菌株。
[0027] 实施例2过表达菌株C79‑3/SPUL_2404‑O的抗原稳定性分析
[0028] 将亲本株C79‑3(标准型菌株)、CVCC530株(变异型菌株)、C79‑3/SPUL_2404‑O株连续传代40代后，划线于马丁琼脂平板上，过夜培养后各自挑取100个单菌落至适量的生理盐10
水中，每个单菌落的细菌浓度调整为1.0×10 CFU/ml。取洁净的玻片1张，用移液器分别吸取25μl沙门菌O122血清和O123血清(购自中国兽医药品监察所)滴于玻片上，然后吸取25μl菌液分别加入O122血清和O123血清中，并轻轻摇动玻片充分混匀，2分钟后判定结果。如表1所示，亲本株C79‑3的100个单菌落亚克隆中，有12个克隆出现了与变异型血清(O122)的反应。CVCC530株的100个单菌落亚克隆中，有10个克隆出现了与标准型血清(O123)的反应，发生了血清亚型的变异。而C79‑3/SPUL_2404‑O株的100个单菌落亚克隆均只与变异型血清(O122)反应，表现出良好的O抗原稳定性。
[0029] 表1鸡白痢沙门菌C79‑3/SPUL_2404‑O株的抗原稳定性分析
[0030]
[0031] 注：O122+O123表示既可与O122血清又可以与O123血清发生凝集反应
[0032] 实施例3、稳定变异型凝集抗原的制备与应用
[0033] 将构建好的过表达菌株C79‑3/SPUL_2404‑O密集划线接种于马丁琼脂平板，培养24h后用马丁肉汤洗下菌体，转接于马丁琼脂大平皿，正置培养24h后翻转平皿倒置培养
24h，48h后加入适量含1％福尔马林的PBS冲洗下菌体，37℃灭活24h，24h后再加入2倍体积的无水乙醇充分混匀，4℃自然沉降至细菌完全沉淀，沉淀物离心后用含10％甘油的PBS洗
10
涤一遍后重悬，调节菌液浓度至约1.5×10 CFU/ml，加入终浓度为0.01％结晶紫的乙醇溶液低速搅拌使其充分染色即制得稳定变异型凝集抗原。
[0034] 将不同来源变异型菌株免疫SFP鸡制备的鸡白痢阳性血清进行2倍倍比稀释，取自制的变异型凝集抗原与某商品抗原同时对稀释的血清进行检测，比较自制凝集抗原与商品抗原的敏感性。结果如表2所示，以C79‑3/SPUL_2404‑O株制备的凝集抗原敏感性较某商品凝集抗原更好，在血清进行高倍稀释后仍然能产生凝集。
[0035] 表2C79‑3/SPUL_2404‑O株制备的变异型凝集抗原的应用与敏感性分析[0036]
[0037]
[0038] ‑：液体呈现出均一的蓝色，无颗粒物析出；
[0039] +：少量细小颗粒物析出，溶液仍为蓝色；
[0040] ++：有明显蓝色颗粒析出，液体仍然展现出轻微的蓝色；+++：大片蓝色颗粒物析出，液体变的透明。
