技术领域
[0001] 本发明属于医药合成技术领域，具体涉及一种肾上腺素注射液中未知杂质的分离及其结构鉴定方法。
相关背景技术
[0002] 盐酸肾上腺素注射液，适应症为主要适用于因支气管痉挛所导致的严重呼吸困难，可迅速缓解药物等引起的过敏性休克，亦可用于延长浸润麻醉用药的作用时间，也是各种原因引起的心脏骤停进行心肺复苏的主要抢救用药。其规格为1ml：1mg。其肾上腺素分子结构式如下：
[0003]
[0004] 盐酸肾上腺素注射液中的主要活性成分为肾上腺素，注射液中的杂质主要来源于肾上腺素的工艺杂质和降解杂质。根据EP10.3和USP43药典，肾上腺素可能的杂质分别为L‑去甲肾上腺素、肾上腺酮、R‑苄基肾上腺素、苄基肾上腺酮、亚硫酸肾上腺素、D‑肾上腺素、1‑(4‑羟基苯基)‑2‑(甲基氨基)乙醇、4‑[2‑(甲胺基)乙基]苯‑1,2‑二醇、4‑(1‑甲氧基‑2‑(甲基氨基)乙基)‑1,2‑苯二醇等杂质。按照药典的分析方法，这些杂质均可以使用对照品利用HPLC法准确进行定位，获得其准确的保留时间Rt。
[0005] 盐酸肾上腺素注射液在长期留样观察中以及在高温放置过程中，我们发现其新增一个杂质，且随着时间的延长和温度的升高，此杂质在缓慢增长，判定为降解杂质。在氮气保护下，盐酸肾上腺素注射液延长放置时间以及高温条件下均不出现此杂质，判定此杂质为氧化杂质。此杂质按照EP10.3肾上腺素注射液有关物质分析方法进行测定，其保留时间为2.180min，相对于主成分的相对保留时间为RRT＝0.71，归一化含量约0.3％。由于本杂质在盐酸肾上腺素注射液中是一个较为明显的未知降解杂质，对此未知杂质进行分离和鉴定，可以完善盐酸肾上腺素注射液杂质谱，并判断其是否为遗传毒性杂质，对保证用药安全性至关重要。
具体实施方式
[0038] 为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例与附图，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
[0039] 步骤一、氧化反应
[0040] 实施例1：
[0041] 在装有冷凝管的150ml三口反应瓶中加入盐酸肾上腺素注射液(1ml：1mg)50ml，70℃温度条件下，通入空气，使反应液持续鼓泡，剧烈搅拌，常压反应。反应时间36h。反应结束后，降温至室温。经检验，氧化后本杂质归一化含量为6.0％。相对于初始值本杂质量增长约20倍。
[0042] 实施例2：
[0043] 在装有冷凝管的150ml三口反应瓶中加入盐酸肾上腺素注射液(1ml：1mg)50ml，50℃温度条件下，通入空气，使反应液持续鼓泡，剧烈搅拌，常压反应。反应时间48h。反应结束后，降温至室温。经检验，氧化后本杂质归一化含量为5.8％。
[0044] 实施例3：
[0045] 在装有冷凝管的150ml三口反应瓶中加入盐酸肾上腺素注射液(1ml：1mg)50ml，60℃温度条件下，通入空气，使反应液持续鼓泡，剧烈搅拌，常压反应。反应时间48h。反应结束后，降温至室温。经检验，氧化后本杂质归一化含量为6.4％。
[0046] 步骤二、杂质分离纯化
[0047] 实施例4：
[0048] 将实施例1所得氧化反应液50ml，采用制备液相分离纯化(色谱仪型号为combiFlash RF+)，色谱柱为C18硅胶柱，上样方法为液相法，流动相A液：0.5％醋酸铵水溶液，流动相B液：甲醇，采用双波段在线监控杂质的出峰时间，紫外波长λ＝215nm和245nm，进样过程A液：B液＝40:60(v：v)，流动相洗脱速率为20ml/min。经杂质跟踪确认，本杂质在制备液相中的出峰时间约4.5min。在线收集本杂质的洗脱液约80ml。
[0049] 实施例5：
[0050] 将实施例2所得氧化反应液50ml，采用制备液相分离纯化(色谱仪型号为combiFlash RF+)，色谱柱为C18硅胶柱，上样方法为液相法，流动相A液：0.5％醋酸铵水溶液，流动相B液：甲醇，采用双波段在线监控杂质的出峰时间，紫外波长λ＝215nm和245nm，进样过程A液：B液＝45:55(v：v)，流动相洗脱速率为20ml/min。经杂质跟踪确认，本杂质在制备液相中的出峰时间约4.8min。在线收集本杂质的洗脱液约85ml。
[0051] 实施例6：
[0052] 将实施例3所得氧化反应液50ml，采用制备液相分离纯化(色谱仪型号为combiFlash RF+)，色谱柱为C18硅胶柱，上样方法为液相法，流动相A液：0.5％醋酸铵水溶液，流动相B液：甲醇，采用双波段在线监控杂质的出峰时间，紫外波长λ＝215nm和245nm，进样过程A液：B液＝40:60(v：v)，流动相洗脱速率为25ml/min。经杂质跟踪确认，本杂质在制备液相中的出峰时间约4.2min。在线收集本杂质的洗脱液约90ml。
[0053] 实施例7
[0054] 将实施例1所得氧化反应液50ml，采用制备液相分离纯化(色谱仪型号为combiFlash RF+)，色谱柱为C18硅胶柱，上样方法为液相法，流动相A液：0.5％醋酸铵水溶液，流动相B液：乙腈，采用双波段在线监控杂质的出峰时间，紫外波长λ＝215nm和245nm，进样过程A液：B液＝40:60(v：v)，流动相洗脱速率为20ml/min。经杂质跟踪确认，本杂质在制备液相中的出峰时间约5.0min。在线收集本杂质的洗脱液约80ml。
[0055] 实施例8
[0056] 将实施例1所得氧化反应液50ml，采用制备液相分离纯化(色谱仪型号为combiFlash RF+)，色谱柱为C18硅胶柱，上样方法为液相法，流动相A液：0.5％甲酸铵水溶液，流动相B液：甲醇，采用双波段在线监控杂质的出峰时间，紫外波长λ＝215nm和245nm，进样过程A液：B液＝40:60(v：v)，流动相洗脱速率为25ml/min。经杂质跟踪确认，本杂质在制备液相中的出峰时间约4.1min。在线收集本杂质的洗脱液约85ml。
[0057] 实施例9
[0058] 将实施例1所得氧化反应液50ml，采用制备液相分离纯化(色谱仪型号为combiFlash RF+)，色谱柱为C18硅胶柱，上样方法为液相法，流动相A液：水，流动相B液：甲醇，采用双波段在线监控杂质的出峰时间，紫外波长λ＝215nm和245nm，进样过程A液：B液＝
40:60(v：v)，流动相洗脱速率为25ml/min。经杂质跟踪确认，本杂质在制备液相中的出峰时间约5.2min。在线收集本杂质的洗脱液约100ml。
[0059] 对比例1
[0060] 将实施例1所得氧化反应液50ml，采用制备液相分离纯化(色谱仪型号为combiFlash RF+)，色谱柱为C18硅胶柱，上样方法为液相法，流动相A液：水，流动相B液：丙酮，采用双波段在线监控杂质的出峰时间，紫外波长λ＝215nm和245nm，进样过程A液：B液＝
40:60(v：v)，流动相洗脱速率为20ml/min。经杂质跟踪确认，本杂质在制备液相中的出峰时间与主峰接近，分离度＜1.0，不能很好分离。
[0061] 对比例2
[0062] 将实施例1所得氧化反应液50ml，采用制备液相分离纯化(色谱仪型号为combiFlash RF+)，色谱柱为C18硅胶柱，上样方法为液相法，流动相A液：0.5％醋酸铵水溶液，流动相B液：甲醇，采用双波段在线监控杂质的出峰时间，紫外波长λ＝215nm和245nm，进样过程A液：B液＝80:20(v：v)，流动相洗脱速率为20ml/min。经杂质跟踪确认，本杂质在制备液相中的出峰时间与主峰接近，分离度＜1.0，不能很好分离。
[0063] 步骤三、浓缩
[0064] 将实施例4所得80ml洗脱液在60℃～80℃温度条件下，真空浓缩，真空度≤‑0.09MPa；浓缩至原体积的1/3，降温至室温，得含此未知氧化降解杂质的浓缩液。
[0065] 实施例5‑实施例9所得洗脱液均按上述方法进行真空浓缩。浓缩终点可控制为浓缩前洗脱液体积的1/4～1/3。
[0066] 【化合物确认】
[0067] 对上述实施例4所得浓缩液中的未知杂质进行结构鉴定。采用LC‑MS二维在线液质联用方法对该未知杂质进行定性研究。通过高分辨质谱和二维质谱碎片推测分子结构。
[0068] LC‑MS的分析条件为：
[0069] 一维液相色谱参数：流动相A：磷酸二氢钾5.0g，辛烷磺酸钠2.6g，用水溶解并稀释至1000ml，加磷酸调节pH至2.8；流动相B：乙腈；流动相A:B＝90:10；色谱柱：Boltimate C18Core‑shell，4.6x100mm，5μm；流速1.6ml/min；柱温50℃；吸收波长210nm；
[0070] 二维色谱参数：Weltch C18，4.6x50mm，5μm。以0.1％甲酸水溶液(A)/甲醇(B)为流动相，流速为0.5ml/min，梯度洗脱条件：0→10min，B％(0％→80％)；10→15min，B％(80％→0％)，柱温50℃。
[0071] 质谱参数：离子源ESI,扫描模式80‑400D，辅助气加热温度350℃，离子传输管温320℃，鞘气流速45ml/min，辅助气流速10ml/min，分辨率140000，喷雾电压3.8kv，NCE为
25v、45v、55v。
[0072] 经过测试，该杂质实测分子量为200.09144，推测高分辨元素组成为C9H14O4N。具体质谱图见附图1。
[0073] 二级质谱碎片及可能归属如表1所示：
[0074] 表1
[0075]
[0076]
[0077] 杂质的准分子离子峰为m/z 200[M+H]+，精确质量为200.09142，元素组成为C9H14O4N，比肾上腺素多一个O原子。通过对二级质谱碎片可能归属的分析，确认本杂质的分子结构为：
[0078]
[0079] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
